（光学专业论文）表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫检测中的应用.pdf

c m j 峰，而与c h 面外弯曲振动有关的6 5 7 、6 8 8 、8 0 1 、1 0 0 3e m l 等处峰强没 有增强，因此峰强较弱；较低浓度下，m b 分子主要是以较为“倾斜 或“平躺 的方式化学吸附于纳米粒子表面，这减弱了谱峰4 4 8c m 。1 和1 0 2 9c m ，增强c h 面外弯曲振动，使6 5 7 、6 8 8 、8 0 1 、1 0 0 3 e m 。1 等处峰强增加。应用密度泛函方法 ( d f t ) 在b 3 l y p 6 3 1 + g 枣和l a n l 2 d z 基组水平上对亚甲基蓝阳离子( m b + ) 及m b + 与a g 原子形成的不同构型体系进行结构优化和频率计算。实验与理论计 算结果表明，m b + 有可能通过n a g 、s a g 与a g 原子形成两种较强的吸附构型。 电荷命居分析表明，与s 原子相比，芳香环上的n 原子更易与银原子发生相互 作用。 由于水分子的拉曼截面很小，拉曼光谱适合于水环境的检测。同时，s e r s 具有极高的检测灵敏度，特殊条件下甚至可以达到单分子和单纳米粒子的检测， 使得s e r s 广泛应用于生命科学领域。在生物技术领域，s e r s 结合金纳米标记 方法用于免疫检测是一个研究热点。该方法将具有强拉曼信号的标记分子和抗原 抗体蛋白分子吸附于纳米金表面，通过拉曼谱仪检测标记分子的s e r s 信号， 以达到示踪抗原抗体的目的。相比其他免疫检测方法，s e r s 标记免疫检测具有 高灵敏度、高光谱选择性，特别适合分子识别、药物筛选、生物靶向等生物医药 领域。但是，s e r s 免疫检测尚未形成比较稳定可靠的检测流程，在可靠性方面 还未达到实际应用的要求。本论文第二部分开展了优化s e r s 标记免疫技术步骤 和流程的初步探索，尝试了s e r s 金胶免疫标记三层组装和单组分s e r s 免疫检 测。在完成了信号分子和抗体蛋白的金胶标记、玻片修饰处理、免疫组装等步骤 后，实现了三层的s e r s 标记免疫检测。这些实验和结果为课题组深入开展相关 研究积累了丰富的经验。 关键词：亚甲基蓝，表面增强拉曼散射，密度泛函理论，免疫检测 a b s t r a c t t h e o r ys t u d yo ft h es u r f a c ee n h a n c e dr a m a n s c a t t e r in ga n dlt sa p p llc a tlo n o nt h eim m u n o a s s a y m a j o r ：0 p t i c s n a m e ：z h o n gl i a n g s u p e r v i s o r ：h uy o n g j u n f 强 t h ef i r s tr e p o r to nt h es u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) w a sd o n eb y f l e i s c h m a n ne ta 1 i n19 7 4 a f t e rt h a t ，t h e r ew e r em a n ys t u d i e so nt h ef u n d a m e n t a l t h e o r ya n di t sa p p l i c a t i o n si nd i f f e r e n tf i e l d s s e r si sas p e c i a lp h e n o m e n o nw h e nt h e m o l e c u l e sa r ea d s o r b e do nt h er o u g hs u r f a c eo rn a n o p a r t i c l e so fn o b l em e t a l s f o r s e r ss p e c t r ao fm o s tm o l e c u l e sa r ev e r yd i f f e r e n tf r o mt h e i rn o r m a lr a m a ns p e c t r a ， t h es e r ss p e c t r ac o u l db eu s e dt oe x p l o r et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm o l e c u l e sa n d s u r f a c e i n19 8 9 ，r o h re l ；a 1 f i r s t l ya p p l i e dt h es e r so nt h ei m m u n a s s a yd e t e c t i o n ， a n dt h e nt h es e r sl a b e l t e c h n o l o g yh a sb e c a m eah o tt o p i c i nt h i st h e s i s ，t h e f u n d a m e n t a lr e s e a r c hb yc o m b i n i n gs e r sw i t hd f tc a l c u l a t i o na n dt h ea p p l i c a t i o n r e s e a r c ho ns e r sl a b e lf o ri m m u n o a s s a yh a db e e ne n g a g e d q u a n t u mc h e m i s t r yc a l c u l a t i o nc a nb eu s e dt os i m u l a t et h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n m o l e c u l e sa n dm e t a ls u r f a c eo rn a n o p a r t i c l ea n dt oe x p l o r et h er a m a ne n h a n c e m e n t m e c h a n i c s ，a d s o r p t i o no r i e n t a t i o no fm o l e c u l ea n dt h ea s s i g n m e n to ft h es p e c t r u m r e c e n t l y , i th a sb e e nah o tt o p i c m e t h y l e n eb l u e ( m b ) h a s a l le x c e l l e n ts e r se f f e c t ， t h u si ti su s u a l l yu s e da sap r o b em o l e c u l et oc h a r a c t e rt h ee n h a n c e de f f e c to ft h e i l i n a l l o m a t e r i a l w h e nw em e a s u r e dt h es e r ss p e c t r ao fm bi na gc o l l o i d ，w ef o u n d t h a tt h es e r ss p e c t r ao fm bw e r ev e r yd i f f e r e n ti nh i g ha n dl o wc o n c e n t r m i o n ，a n d a l s oc h a n g e dw i t ht h ea d s o r b e dt i m e t h i sr e s e a r c hh a ss t u d i e dt h es e r ss p e c t r ao f m bi nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n s o nt h eb a s eo ft h et r a d i t i o n a ls e l e c t i o nr u l e sf o rs e r s ， t h es p e c t r ar e v e a lt h a tt h em bm o l e c u l e sa r ed o m i n a n t l yp e r p e n d i c u l a rt ot h em e t a l s u r f a c ei nh i g hc o n c e n t r a t i o n t h eb a n d so fc - s cs y m m e t r i cs t r e t c h i n g ( a t4 4 8c m 叫) ， c - h i n p l a n eb e n d i n g ( a t 10 2 9c m 1 ) a r ee n h a n c e dw h i l et h o s eo ft h ec - h o u t o f - p l a n eb e n d i n ga t6 5 7 ，6 8 8 ，8 0 1a n d1 0 0 3c m 。1a l en o te n h a n c e da n dr e l a t i v e w e a k e r i nt h el o wc o n c e n t r a t i o n ，t h em bm o l e c u l e sa r em o r ep a r a l l e lt ot h e n a n o p a r t i c l es u r f a c ea n dc h e m i s o r p t i o nh a p p e n s t h eb a n d sa t4 4 8a n d10 2 9c m 。a r e w e a k e nw h i l et h eb a n d so ft h ec - ho u t - o f - p l a n eb e n d i n ga t6 5 7 ，6 8 8 ，8 01a n d10 0 3 c m a l ee n h a n c e d d e n s i t yf u n c t i o n a lt h e o r y ( d f t ) c a l c u l a t i o n sa tt h el e v e lo f b 3 l y p 6 311 + g * ( f o rc ，s ，n ，h ) l a n l 2 d z ( f o ra g ) h a v eb e e ne m p l o y e dt o o p t i m i z et h es t r u c t u r e sa n dp r e d i c tr a m a nf r e q u e n c i e so fm b + a n dt h em b + - a g c o m p l e x e s t h er e s u l t so fe x p e r i m e n t sa n dc a l c u l a t i o n ss u g g e s tt h a tt h es i l v e ra t o m p r e f e r st ob eb o u n dt on a n dsa t o mi nt h ea r o m a t i cr i n g ，a n dt h u st w od i f f e r e n t c o m p l e x e sa r ef o r m e d ，i e c o n f o r m e rn a ga n dc o n f o r m e rs - a g m o r e o v e r ，t h e m u l l i k e nc h a r g ep o p u l a t i o na n a l y s i si n d i c a t e sna t o mi nt h ea r o m a t i cr i n gp r e f e r st o i n t e r a c t 、 ，i t ha gt h a ns a t o md o e s f o rt h es m a l ls c a t t e r i n gc r o s ss e c t i o no fw a t e r , t h er a m a ns p e c t r u mi sv e r yl i t t l e i n f l u e n c e db yt h ew a t e ra n dc a nb eag o o dd e t e c t i o nm e t h o di nw a t e re n v i r o n m e n t e s p e c i a l l y , s e r sh a sav e r yh i g hs e n s i t i v i t y a n de v e na c h i e v es i n g l em o l e c u l e d e t e c t i o nu n d e rs p e c i a lc o n d i t i o n s t h e s ea d v a n t a g e so fs e r sh a v eb e e nw i d e l yu s e d i nl i f es c i e n c e sf i e l d r e c e n t l y , s e r sl a b e lc o m b i n e dw i t hg o l dn a n o p a a i c l ef o r i m m u n o a s s a yh a sb e e nah o tt o p i ci nt h eb i o a s s a yf i e l d i nt h i sm e t h o d t h el a b e l l e d m o l e c u l e s ，w h i c hs h o wi n t e n s er a m a ns i g n a l ，a n dp r o t e i nm o l e c u l e so fa n t i g e n a n t i b o d ya r ea d s o r b e ds i m u l t a n e o u s l yo nt h es u r f a c eo fg o l dn a n o p a r t i c l e s a n db y t h ed e t e c t i o no ft h es e r ss i g n a lo ft h el a b e lm o l e c u l e ，t h eg o a lo ft r a c i n ga n t i g e n a n t i b o d yc a nb ea c h i e v e d c o m p a r e dw i t ho t h e ri m m u n o a s s a ym e t h o d s ，s e r sl a b e l m e t h o dw i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n dh i g hs p e c t r a ls e l e c t i v i t yi se s p e c i a l l ys u i t a b l ef o r 1 、， b i o l o g ya n dm e d i c i n ea r e a , s u c ha sm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ，d r u gs c r e e n i n g ，b i o l o g i c a l t a r g e t i n g h o w e v e r ，t h er e l i a b i l i t yo fs e r si m m u n o a s s a yh a sn o ty e tr e a c h e dt h e p r a c t i c a la p p l i c a t i o n s t h e s e c o n dp a r to ft h i sp a p e ri st h eo p t i m i z a t i o no ft h e p r o c e s s e so fs e r sl a b e lt e c h n o l o g y w e a s s e m b l eas a n d w i c hs t r u c t u r ef o r i m m u n o a s s a yw h i c hi n c l u d i n gs e r s l a b e l e ds i n g l es p e c i e sr e p o r t e ra n di m m u n o g o l d n a n o p a r t i c l e s w eh a v eo p t i m i z e dt h es t e p so f t h ea s s e m b l i n gs i g n a ll a b e l i n gm o l e c u l e a n da n t i b o d yp r o t e i n so ng o l dn a n o p a r t i c l e s ，t h es l i d et r e a t m e n ta n dt h es e r sl a b e l i m m u n o a s s a yw i t has a n d w i c hs t r u c t u r e t h e s ee x p e r i e n c e sa r eh e l p f u l f o rt h e a d v a n c e dr e s e a r c ho nt h es e r sl a b e li o m m u o a s s a y k e yw o r d s ：m e t h y l e n eb l u e ，s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，d e n s i t yf u n c t i o n t h e o r y , i m m u n o a s s a y v 警 目录 第一章引言1 1 1r a m a n 光谱和分子光谱简介l 1 1 1 拉曼光谱简介l 1 1 。2 分子振动和光谱简介5 1 1 3s e r s 现象、理论解释和应用1 1 1 2 量子化学和g a u s s i a n 简介18 1 2 1 鼙子化学基础1 9 1 2 2 量子化学的理论和计算方法2 0 1 2 3g a u s s i a n 软俐：2 7 参考文献2 9 第_ 二章对甲基监的s e r s 实验和理论研究3 6 2 1s e r s 基底制备3 7 2 2s e r s 实验仪器条件3 8 2 3d f t 计算方法一3 9 2 4 实验结果4 0 2 4 1 不同浓度下m b 的s e r s 光谱4 0 2 4 2 低浓度下的吸附时间对谱图的影响。4 2 2 5d f t 计算结果4 3 2 5 1 结构与电荷布居4 3 2 5 2 拉曼频率4 4 2 6 结论4 6 参考文献4 7 第二章s e r s 标记用于免疫检测研究5 l 3 1 免疫学简介和s e r s 免疫标记的实验原理。5 l 3 2 i l i i 相基底的准备5 2 3 3 胶体金的标记。5 4 3 4 多层组装和检测。5 7 3 5 结果乖展望5 8 参考文献6 0 第四章总结和展望。6 3 致谢6 5 作者攻读学何j l j j 问发表的学术论文目录6 6 - v l - 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫榆测中的应用 第一章引言 1 1r a m a n 光谱和分子光谱简介 1 1 1 拉曼光谱简介 1 9 2 3 年德国科学家a s m a k a l 等人从理论上预言，当频率为的单色光照 射到物质后，物质中的分子会对入射光产生频率为v o + a v 的散射光。1 9 2 8 年 拉曼( c v r a m a n ) 1 1 翔在研究液体苯实验中发现了该散射现象。分子转动产生 的拉曼光谱较难观察，最常见的是分子振动产生的拉曼谱，本论文只讨论振动 情况。 拉曼光谱的原理可用下图表示。 受激虚态 电子基态 荧光光谱 j lt 振动拉曼光谱 利线 s t o k e s 线 a n t i - s t o k e s 线 l 1r 1r r 1r1r1 r r1 r 1r 图1 1 拉曼散射原理示意图 v = 3 v - - 2 第电子 v = l 激发态 v = o v = 3 振础激发念 、= 2 振础量子数 v = l v = o 拉曼散射光谱和红外吸收光谱都是反映分子振转能级的变化的光谱方法。 分子的振动、转动的能量与分子电子能级一样，都是量子化的。转动能级差约 为1 0 4 1 0 2e v ，振动能级差约o 0 5 1e v ，分子中价电子的能级差约1 - 2 0e v l 3 1 。 分子中电子能级、振动、转动能级均不连续。在激发光照射下，分子中的电子 从初态振动基态跃迁到中间态受激虚态，返回到电子基态的振动激发态；或者 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫检测中的应用 从初态电子基态的振动激发态跃迁到中间态受激虚态，返回到振动基态。根据 量子理论，该过程为二阶过程，分别是光子的吸收和发射过程，在此过程中产 生拉曼频移。对有拉曼活性的不同分子有不同的拉曼谱图，故可以选取分子的 特征拉曼光谱表征该分子的存在。分子的拉曼频率位移不随入射光的频率变化 而变化。常温下振动基态的电子分布远大于振动激发态，故反斯托克斯线强度 小于斯托克斯线。理论和实验上斯托克斯线和反斯托克斯线峰强之比约为1 0 。 与荧光的机理完全不同，拉曼频移不随入射光频率的改变而改变，而荧光只限 于被分子所吸收的一些频率所激发。因此，在检测分子的拉曼光谱时改变激发 线可以消除分子的荧光背景或载玻片的荧光背景。荧光谱线的强度与激发线处 于同一数量级。拉曼散射中，瑞利散射光强是入射光强的百分之几，拉曼散射 光强更低，只是瑞利光强的百分之几。因此，对拉曼散射光的检测需要线宽窄 的光源、高光谱分辨的单色仪。在激光出现之前，虽然使用汞灯作为激发光源， 拉曼光谱的检测仍不理想，这限制了拉曼光谱学的应用。激光出现后，激光的 单色性好、亮度高、偏振性高，是理想的激发光源，拉曼散射的效率提高，使 斯托克斯线强度可达到瑞利线强度的几百分之一。在没有表面增强或共振增强 的情况下，过低的拉曼散射截面是拉曼光谱应用的缺点，使得大多数吸附物种 的非增强的拉曼信号强度都低于常规谱仪的检测灵敏度。 红外光谱是分子偶极矩变化时产生【4 】，拉曼光谱是分子极化率变化诱导的， 谱线强度取决于相应振动过程极化率变化的大小。在分子结构分析中，拉曼光 谱与红外光谱相互补充。如电荷分布中心对称的c c 、n - - n 、s s 等键，红外吸 收很弱，而拉曼散射却很强。水是化学和生物研究普遍使用的溶剂，在红外区 具有强吸收，而在可见光区并不吸收，但水的拉曼散射很弱，因此，拉曼光谱在 水溶液中测试所受溶液的干扰小，适于生物和化学中原位检测。 当激发光的能量接近或等于散射分子的某个电子吸收带能量时，分子中某 些拉曼线强度会显著增加，可达1 0 6 倍，这种现象称为共振拉曼散射。共振拉 曼和下面介绍的表面增强拉曼可同时发生。 拉曼散射的理论解释可从经典电磁理论【5 ，6 l 和量子理论1 6 】两方面描述。经典 理论把光视为电磁场，用电场与分子的相互作用近似解释拉曼散射现象。更严 格的量子理论利用光量子与分子的弹性和非弹性碰撞解释瑞利和拉曼散射。具 一一一一_ 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫柃测中的应用 体对拉曼散射现象的解释涉及物理、化学、群论等很多领域知识。 1 ，拉曼散射的经典理论 由经典电磁理论可知，感应偶极矩尸与入射光电场分量e = e oc o s ( 2 ，r v t ) 的 关系为： 尸= 口e + 击e 2 + 击厂e 3 + + 去孝f a 为极化率( 单位电场强度所感应的电偶极矩) ，是超极化率，y 、善是高阶 秩张量。忽略高阶项，只考虑线性项p ：a e ，即 p = 哦c o s ( 2 ；, t v t ) ( 1 1 ) 如果分子的振动是简谐的，则 7 = y o + x o c o s ( 2 万- ，振t ) ( 1 - 2 ) 为平衡位置，x o 为为简谐振动振幅。 通常因为p 与e 的方向不一致，口是二秩张量。口只与分子构型有关，与 外电场无关，是分子内坐标7 的函数，在平衡位置附近按坐标展开，有： 口( 厂) = 口( ) + ( - 号? ) r - r , , ：c o c o s 2 朋振t + 高次项 ( 1 3 ) 由( 1 1 ) ，( 1 - 2 ) ，( 1 - 3 ) 等式可得： 尸= a ( r o ) + 1 c 万d 2 c r 扛, 衲2 卜s 2 吼ta r ) ；，。忡啦汹s 2 删， + 互1 万d a ) ，砥而岛c 。s 2 万( v + ) t + j i 石d a ) h 。而岛c 。s 2 万( v v 振) t + 吉( 旁) ，i 抽毛c o s 2 z ( v + 2 v ：，, ) t + 吾( 万d - a ! k 柏驷s 2 砌一2 喇+ 第一项是频率为l ，的瑞利散射，第二项是频率为1 ，+ 魄的反斯托克斯线，第三项 是频率为，一喙的斯托克斯线，其他项是频率为y + 2 喙和i ，一2 的拉曼线。 根据更为详细的推导，斯托克斯线和反斯托克斯线的强度比应等于： 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫检测中的应用 i i , 而( v - v 振) 4坛( 1 ，+ 喙) 4 因为通常l ， 喙，一喙) ( y + 喙) ，所以两者强度大致相等，但实验显示斯 托克斯线比反斯托克斯线强度强约1 0 倍，只能用量子理论才能解释。 2 ，拉曼散射的量子理论 量子理论把发生拉曼散射的量子化的光场与量子化的分子看作一个体系， 入射光子湮灭和散射光子发出，伴随着分子从一个本征能级跃迁到另一本征能 级，中间经历中间态一虚念。 在不考虑共振情况下，入射光与分子系统的微扰哈密顿算符： h = e m m = e 5 为电偶极矩。微扰系统的薛定谔方程为： ( 风一e m ) 吵( ，f ) = i h 争( r , t ) 经过对以上方程的求解，并引入适当的近似【5 】可得斯托克斯和反斯托克斯散 射的光强分别为： k - c ( 吼一) 4 去哌门+ 瓦) _ c ( 吃+ 击瓦 。是电极化率张量分量按照某一简正坐标展开的一阶系数；吼是入射光 子频率，是散射过程中产生或湮没的光子频率；瓦是某一元激发g 的平均布 居数，通常拉曼光谱检测元激发是热声子，瓦满足玻色一爱因斯坦分布，即： 瓦- 【e x m 咿) - l 】- l 惫丁 显然，由上式可得 了s o k e s = ( 詈 警) 4e x p ( 壳吒r ) ( i - 4 ) l a i 味i l + q l 表面增强拉曼光谱学理论研究及j 在免疫柃测中的应用 此计算的斯托克斯与反斯托克斯线峰强之比与实验结果相符。 拉曼光谱学具有广泛的应用。具有无接触无损伤和高灵敏度等优点，是一 种快速、可实时检测材料结构和微结构及声子与其它元激发间相互作用的有效 工具。利用它可以了解晶体内部的缺陷、品格畸变及其相变的等情况。此外， 拉曼光谱扫描范围宽，对样品用量极少，水环境对拉曼光谱几无干扰，因此在 原位检测，特别是对生物体系检测具有很多应用。现代的拉曼光谱仪器也发展 很快，不仅功能更多，分辨率、精度、灵敏度更高。上世纪8 0 年代，傅立叶拉 曼光谱诞生，有效降低了许多有机分子的荧光干扰；9 0 年代末，可便携的激光 拉曼仪器出现，在考古、刑侦等领域使用增多；j o b i ny v o n 的共焦显微拉曼谱 仪，集成多个激光光源，甚至能够做到线扫描、面扫描。这些先进的技术和功 能都促进了拉曼光谱在化学、材料、生物学、化工等领域更广泛应用。应用方 面进展已有很多专著出版1 7 , 8 , 9 】。 i i 2 分子振动和光谱简介 拉曼光谱是由分子振动引起，本章介绍分子振动的基本原理和方法。在研 究分子振动和波函数时常把玻恩一奥本海默( b o r n o p p e n h e i m e r ) 近似作为基础。 因为原子核的质量远大于核外电子质量，在核运动的瞬间电子的分布不能适应 核在新位置的势场。同样，电子的分布因光的吸收等改变时，原子核也不能很 快运动到电子新的分布造成的势场。这样就将分子的运动分解为处于电子势场 中的核的振动和核势场中电子的运动。这就是玻恩奥本海默近似。在此基础上 对应的问题就变成简正振动分析和电子波函数求解。简币分析中欲更进一步把 分子的平动、振动和转动分离丌处理，须建立满足s a y v e t z 条件的坐标系，即 满足使分子质心在振动中没有振动线性动量和零级振动的角动量。下面分别介 绍在直角坐标系中对分子振动的分析和简乖分析i i o l 。 l ，对直角坐标系的分析 直角坐标系下，分子的振动动能可写为： 表面增强拉曼光谱学理论研究及j 在免疫检测中的应用 丁= 圭姜州警) 2 + ( 警) 2 + ( 警) 2 】 m 5 ， 觇，瓴，包等是原子口的瞬时坐标艺，y o ，乙相对在平衡位置时位移量。 引入质量加权坐标q i ， 绣= 厩k ，q ：= 扛两，q 。= 历k ，q ：= 而k ， 式( 1 - 5 ) 变为 丁：丢断 二i 振动的势能v 按q ，展开，得 y = + 善3 nc 瓦a v ，旭+ 主善3 n 否3 nc 茴j 蔷2 t ) 。g 胁+ 平衡时势能最低，有 ( 娑) 。：o o q o 选取势能面v o = 0 ，略去高次项( 简谐近似) ，有 矿= 丢莩莩饥g ， 其中纠器肭嫦数。 根据拉格朗日运动方程l = t v 可得 3 识+ 吼= o ，i = l 2 3 n ( 1 - 6 ) 再设吼= q o c o s ( o g t + s ) ，代入式( 1 - 6 ) ，可得 3 ( 石一岛缈2 ) g o = o ，f = l ，2 ，2 3 n ( 1 - 7 ) j = l 上式系数行列式需为零，形成3 n 阶的久期方程，解得3 n 个根即为3 n 个振动 频率。对于线性分子，有3 n 5 个非零根，非线性分子有3 n 6 个非零根。通过 表面增强拉曼光谱学理论研究及其莉：免疫榆测中的廊用 解方程组( 1 - 7 ) 只可求得g 奠的比值，设归一化后的振幅坐标为k 。 由( 1 - 7 ) 式可知，对于每个q ，有一组厶，即原子以相同的频率q 振动， 而振幅k 不同。这样的振动即为简振振动，每一频率称为简振模式。同一频率 振动的分子相位可以相差0 或7 。 式( 1 6 ) 的一般解为： 吼= g 厶c o s ( o j k t + c ) ，f _ l 2 3 n 一6 ( 1 - 8 ) 直角坐标比较直观，对于描述问题容易，但( 1 7 ) 式的系数行列式较为复杂。 使用简正坐标可极大简化运算形式。设简正坐标为q ，在此坐标下，振动动能 丁和势能y 分别为： 13 n - 6 3 n 一6 丁= 寺宏，v = i 1 鬈2 2 厶k = l厶k = l 令动量坐标忍= q ，上式以矩阵表示为： 丁= 兰巧p ，矿= 刀q 其中a 的矩阵元为4 ，= 名屯 设质量加权坐标g ，和q 之问的关系为 q ，= 乙q ( 1 9 ) 同样应用拉格朗同方程，得g 运动方程续+ 名q = 0 。设其解为 q = 鲜c o s ( 五t + s ) ，代入式( 1 - 9 ) ，有 g ，= 以珙c o s ( 五，+ s ) ( 1 1 0 ) 与( 1 - 8 ) 比较，l 睹= 乙，q = 五，矩阵表示q = r q 。( ! - 1 0 ) 式说明简正坐 标通过矩阵表示为质量加权坐标的线性组合，不同位置原子以同一频率振动。 求解q 的过程即为简振分析。 - 7 表面增强拉曼光谱学理论研究及其确：免疫榆测中的应用 2 ，简正分析 简j 下坐标是分子所有质量加权坐标的线性组合，每个质量加权坐标表征的 是构成分子的一个原子在一个坐标方向上的振动特性。因此每个简j 下坐标表征 的是一套分子内部运动的组合，而这种组合一定是符合分子所属的对称性群的 一个对称类的。画出一个分子可能的结构，就能够根据结构算出分子的简正坐 标，通过考查分子的简f 坐标可以了解分子内部运动的能量，可以预测分子在 红外光谱和拉曼光谱中的特征吸收峰。 前文已指出，直角坐标描述分子振动简单直观，但简振频率的求解非常复 杂。描述分子振动还可使用内坐标。一个分子的内坐标有多种取法。例如对水 分子，可以取两个o h 键长、r 2 和h o h 键角口，也可取、r 2 和h - h 键长吩 为内坐标。为此，先考虑一般情况坐标。定义一般坐标为s 。 设坐标专为： 磊= a x i ，文= a y , ，磊= 止l ，六= 咄， 并设专到s 的变换为： 动能为： 与专对应的动量p 为： 3 j 一6 墨= e ，缶 ，= 1 t ：丢殇，等 ：，：i p = 詈= 两a t a s , 。= 军c 反 其中只为s 对应的动量。 动能丁可以写为： 丁=!莩鲁=一1车一1(军p鼠)2=一1乙瓦12 2m i2t l e 一，圮c 乍砚乍 。乍一” 一、争“一 定义 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫检测中的应用 则 同理，势能矿依s 展开为 上述二方程用矩阵表示为： g i - - ；和气 丁= 兰事g f f c c y ：委乞s 薯 二i t r 矿 假设简正坐标q 到s 坐标的变换为： 则 所以a = r f l 另一方面 或以矩阵表示为 将此式代入下式 即得 s = l q y ：i s r f s ：! q r l r f l q ：i 1q r a q 22 。 2 一 么= 面o t = 军嚣鲁2 军e 厶 p 2 = p r = 丢彰忍 丁：三p l l 7 p 2 与( 1 - 1 i ) 比较，有g = 口，或r = l - 1 g 9 - ( 1 1 1 )p s 卯 硌 7 p 科 l 一2 l 一2 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫检测中的应用 得 将上式代入下式 a ：c f l 彳= 1 觎 可见工将g f 经相似变换对角化，上式也可写为 g f l = l a ，即【( 舒) 玎- a 露蚝= o ， 求解上述久期方程的解，即求解对角矩阵彳的矩阵元q ，即为简正振动频率。 3 1 、，一6 毒到s 的变换s = 玩毒，以矩阵表示为s = b e ，b 矩阵只与分子构型 有关。可通过微分法、s 矢量法先形成曰，进而构造g ，最后可求解彳。 一个振动模式包含多个原子和基团的同时振动，利用势能分布表示不同坐 标对振动模式的能量贡献：p e d = 焉e 彳。 3 群论的应用 群论在量子化学和分子振动的分析中有极重要应用【1 2 ，13 1 。分子的对称元素 主要有5 种：旋转轴e 、对称面盯、对称中心f 、旋转反射鼠和恒等操作e ， 构成3 2 个对称性群。因对称操作都具有一个不为对称操作移动的点，因而这些 群也叫点群。 通过分子结构和简正坐标对称性的分析，主要目的是对一些物理和化学的 参量、性质作出快速准确的定性判断。例如通过分析分子的对称性可以推测分 子有无偶极矩，进而还可以研究化学键的键矩，也可以方便判断分子有无旋光 性。许多分子构形具有不同的对称性，一个分子的不同振动模式也具有不同的 对称性。通过特征标表，可以很方便的对简振模式分类和判断简正振动模的对 称性信息。还可以通过判断振动模式与偶极矩分量对称性是否相同，判断该振 动模式是否具有红外活性，而通过判断振动模式与极化率分量可以判断是否具 有拉曼活性。在化学反应中反应物和反应产物的分子轨道应满足分子轨道对称 守恒原理，通过该原理就可判断反应能否发生。把分子的波函数按照对称性进 行分类，分子的状态和能级用它所属的不可约表示来标记，就可形成谱项。在 表面增强拉曼光谱学理论研究及其在免疫柃测中的心用 线性组合成分子轨道中利用分子点群的特征标表能简化计算。量化计算中对具 有对称性的分子构型施加对称性，可以大大节省计算时间。 1 1 3s e r s 现象、理论解释和应用 l ，s e r s 的现象 激光应用于拉曼光谱学后，新的拉曼现象相继发现。1 9 6 2 年发现相干斯托 克斯效应和受激拉曼现象，1 9 6 3 年发现逆拉曼效应，1 9 6 5 年观察到超拉曼现象 和拉曼诱导克尔效应。表面增强拉曼现象( s e r s ) 于1 9 7 4 年被m f l e i s c h m a n n 等【1 首次报道。他们观察到在使用电化学方法粗糙的银电极表面，吸附的毗啶 分子拉曼信号增强了1 0 6 倍，他们将之归因于粗糙电极表面积增加导致吸附分 子的增多。随后其他实验确认电极表面单个的吡啶分子的信号也比溶液中单个 吡啶分子拉曼信号强1 0 6 倍。更广泛的研究很快扩展到分子在少数会属电极、 胶体等粗糙表面的增强拉曼散射。这种现象被称为表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 。上述现象和发现使s e r s 成为研究活跃的领 域。s e r s 与共振拉曼结合可观察到更强的增强拉曼信号，称为表面增强共振 拉曼( s u r f a c ee n h a n c e dr e s o n a n c er a m a ns c a t t e r i n g ，s e r r s ) 。 归纳的s e r s 现象1 1 5 1 6 , 1 7 , 1 8 】，有以下主要的共识： 1 ) 许多分子都具有s e r s 效应，大多数为杂环化合物，但是只有a g 、c u 、 a u 、l i 、n a 、k 少数几种金属能够作为s e r s 增强基底，具有应用意义的只有 a 昏c u 、a u 三种，银的增强效果最强，常见的增强因子为1 0 6 ； 2 ) 以上金属必须具有亚微观或微观的半1 1 糙度( 几百a 到原子尺度) ，如电 化学氧化还原过程粗糙化的会属电极，会属胶体，化学腐蚀的表面，机械打磨 的金、银表面； 3 ) s e r s 具有长程性和短程性。一些情况下s e r s 强度随分子离基底表面 距离增加而迅速降低。而在一些实验中，观察到分子和表面距离几十a 时仍有 s e r s 效应； 4 ) s e r s 信号强度与激发频率的关系不是4j t 比关系，而是表现为更宽的 共振。许多实验证明，s e r s 强度先随激发光频率降低而增强，达到极大后， 表面增强拉曼光谱学理论研究及其枉免疫检测中的应用 随激发光频率降低而下降。s e r s 强度与激发光频率、金属基底都有关系。银 基底对不同频率的激发光都有较好的s e r s 效应，s e r s 强度的极大值在黄光或 红光区。对铜或金基底，使用蓝光时一般只有很小的s e r s 效应，s e r s 强度最 大值相应的激发光频率要比在银基底上的低； 5 ) 在单分子层吸附的情况下，s e r s 强度与覆盖度的关系呈非线性。因为 不是吸附在粗糙金属基底表面的分子都能产生s e r s 效应，主要的增强是由小 部分吸附在基底活性位置的分子产生； 6 ) 普通拉曼光谱中，谱峰的出现完全遵循拉曼跃迁的选择定