（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕新基因bmx的表达及亚细胞定位研究.pdf

浙江理工大学硕士论文 摘要 在对家蚕蛹e d n a 文库测序中，筛选到一个家蚕未知功能基因b i n - x , 通过 对其e d n a 序列生物信息学分析。该e d n a 序列全长为7 7 8b p ，开放阅读框( o r f ) 长4 4 4b p ，其编码的蛋白质b m - x ，全长1 4 7 个氨基酸残基，预测相对分子量为 1 6 4k i ) a ，等电点为3 6 9 ，为无信号肽的非分泌的酸性蛋白。 经p c r 扩增得到b m - x 基因片段，经b a m hi 和x h oi 双酶切后，插入相应 酶切后质粒p e t - 2 8 a ( + ) ，构建重组融合蛋白表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 坦m 出经p c r 、 酶切鉴定重组正确。将构建的重组质粒转化大肠杆菌r o s s e t a ( d e 3 ) 菌株感受态细 胞，筛选重组菌株后以i p t g 诱导表达，裂解菌体作s d s - p a g e 分析，在2 0 1k d 处有一浓集的特异性蛋白条带，表达量可达菌体总蛋白的5 0 左右。融合蛋白以 可溶形式存在，超声波裂解菌体后离心收集上清液，采用镍离子亲和层析柱纯化 重组融合蛋白r b m - x 。以该融合蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔制备了多克隆抗 体，e l i s a 检测该抗体血清的效价可达到1 ：8 0 0 0 以上。w e s t e r nb l o t t i n g 检测表 明制备的多克隆血清具有较高的特异性。随后以多克隆抗体为工具，对b m - x 基 因进行亚细胞定位，并分析b m - x 基因在五龄家蚕各组织蛋自和蛹中的表达分布： b m x 在家蚕b m n 细胞的细胞质和细胞核中都存在，但是以细胞质中居多。b m - x 基因的表达信号主要分布于五龄家蚕中肠、头部、表皮与脂肪体，在蛹中的信号 则相对偏低。 关键词家蚕；新基因；功能基因：表达；细胞定位 4 浙江理工大学硕士论文 a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h el a r g e - s c a l es e q u e n c i n go fe d n al i b r a r yf r o ms i l k w o r mp u p a e ， t h ee d n ao fan o v e lg e n ew i n lb l a n kr e s e a r c hb a c k g r o u n dw a si d e n t i f i e da n d t e m p o r a r yn a m e db m - x t h el e n g t ho ft h i sc d n a i s7 7 8b p t h r o u g hb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s , w ec h o o s ei t so f f f o rf u r t h e rs t u d y i th a s4 4 4 b pa n de n c o d e s14 7a m i n o a c i dr e s i d u e s ，w i t ht h ep r e d i c t e dm a s so f1 6 4k d aa n dp io f3 6 9 b m - xi sp r e d i c t e d t ob ean o n - c l a s s i c a ls e c r e t o r yp r o t e i nw i t hr i os i g n a lp e p t i d e t h ep c r p r o d u c to fb m - x w a sp u r i f i e d ，a n da f t e rb e i n gd i g e s t e dw i t hb a m hi a n dx h oi t h ed n af r a g m e n tw a si n s e r t e d i n t o t h ef u s i o ne x p r e s s i o nv e c t o r p e t - 2 8 a ( + ) t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t o e c o l ir o s s e t a ( d e 3 ) p c ra n dd i g e s t i o nw i t hb a m h1 1x h ois h o w e dt h a tt h et a r g e tf r a g m e n tw a si n s e r t e d c o r r e c t l y r e c o m b i n a n tp r o t e i nw a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi ne c o l ir o s s e t a ( d e 3 ) i n d u c e db yi p t gt h ea n a l y s i so fs d s p a g es h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i nr b m x w a se x p r e s s e d h i g h l y i nr o s s e t af d e 3 ) w i t hs o l u b l ef o r m b yn i a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , r b m - xw a sp u r i f i e d i m m u n i z a t i o no fr a b b i t w i t hr e c o m b i n a n t p r o t e i ng e n e r a t e dh i g ht i t e r ( 1 ：8 0 0 0 ) p o l y c l o n a la n t i b o d i e s ，m e a s u r i n gb ye l i s a w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ea n t i b o d yc o u l db i n dr b m xs p e c i f i c a l l y , a n dt h e n , s u b c e l l u l a rl o c a t i o n , e x p r e s s i o na n dd i s t r i b u t i o na n a l y s i sw a sp e r f o r m e d i t l a i dag o o df o u n d a t i o no ff u r t h e rs t u d i e so ft h i sn o v e lg e n eb m - x k e yw o r d ：b o m b y xm o r i , n o v e lg e n e ，f u n c t i o n a lg e n e ，s u b c e l l u l a rl o c a t i o n 5 浙江理工大学硕士论文 a p b m - x b m x b s a e d t a e l i s a h r p i p t g k a n m c s n c b i o r f o p d p c r r b m x s d s p a g e p c r p m s f 缩略语 a m m o n i u mp e r s u l f a t e an o v e lg e n eo f b o m b 畛m o r i p r o d u c t i o no f b m - x g e n e b o v i n es e r u ma l b u m i n e t h y l e n ed i a m e m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e n z y m el i n k e ai m m u n o s o r b e n ta s s a y h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e i s o p r o p y l t h i o - p - d - g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n m u l t i p l e - c l o n i n gs i t e n a t i o n a lc e n t e rf o r b i o t e c l m o l o g yi n f o r m a t i o n o p e nr e a d i n gf r a m e 0 - p h e n y l e n e d i a m i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r e c o m b i n a n tb o m b y xm o r ib m x s o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l ya c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y lf l u o r i d e 6 过硫酸铵 家蚕新基因b m - x b m - x 基因表达产物 牛血清白蛋白 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附实验 辣根过氧化物酶 异丙基硫代p d 半乳糖苷 卡那霉素 多克隆位点 美国国立生物技术信息中 心 开放阅读框 邻苯二氨 聚合酶链式反应 重组家蚕b m x 蛋白 十二烷基硫酸钠聚丙烯 酰胺凝胶电泳 聚合酶链式反应 苯甲基磺酰氟 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文， 是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注 明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的 作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：礁p l 参 日期：川年；月矿日 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。 本人授权浙江理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密口 。 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：j 墨童季爹于 指导教师签名： e m b l 量曼二墨 ! 墨薹l 婪呈墨窆登至量：茎l z i n ce i n g e rl g a t at y p e ) f a m i l yp r o d e i n a r a b 3 3 5 塑j | 墼迅呈三q 曼：三l u n n a m e dp r o t e i np r o d u c t a r a b i d o p s l sr h a l l a n a f j s e q u e n c e sp r o d u c i n gs l g n i f l c a n ra l i g n m e n t s ： ；莲至l 圣至坌羔坌茎耋查垒兰：羔l a b c t y l et r a n s p o r ta y 5 乞e 曩l ，p e r m 芒a s ec o m d o n 茎曼茎l 羔量圣垒垒墨2 ：兰l3 t 叠e h 埘z 口_ c l l z i 船c es y n c b a s e s i l i c i b a o c e rd o m e s e q u e n c e sp r o d u c i n go i 口畦f i c 童盎乞m l i g n m e n 乞n ： 2 墨l 互至垒垒墨圣量墨曼：l h y p o t h e t i c a lp r o t e i ne x i g d i 疆f t2 0 0 1 e x l g u 暾! 釜故曼兰：越u n n a m e dp r o t e i nd r o d u c cl v i t l sv m n i f e z a 】 兰坚垄i 量曼至1 2 坌垒墨兰：兰i h y p o t h e t i c a lp r o t e i n v i t i sv i n i f e r a 薹曼茎l 兰至z 曼望至羔：兰l h y p o t h e t i c a lp r o t e i np b 0 0 0 6 4 8 。0 3 0 p l a s m o d i r e f l z p0 1 9 5 8 8 1 9 1 l h y p o t h e t i c a lp r o t e i n 脚蚣c 砬0 0 4 0 6 b a c t e r o 图3 2b m - x 基因序列分析 f i g3 2g e n es e q u e n c ea n a l y s i so fb m - x v l u e 2 8 3 6 3 9 4 s s 7 该基因o r f 长度为4 4 4b p ( b m - x e d n a2 2 3b p - 6 6 6b p ) ，编码1 4 7 个氨基酸 残基的蛋白质( 见图3 3 ) ，表达蛋白理论分子量1 6 4k d a ，预测等电点p i = 3 6 9 0 a t t p ：a u e x p a s y o r g t o o l s p r o t p a r a m h t r r l l ) 。这里将该表达产物暂命名为b m x 蛋白。 强 3 7 张 o l i 2 3 蚀 舟一一一 铝 蔗一一一一一。一囊 弘j 丞 一托一 靶；蛊 朝一一一雏一托 浙江理工大学硕士论文 l 姐 9 l l 弱 1 8 1 2 2 6 2 嬲l 1 7 s l o 3 2 3 墨l 钾 姗 0 5 4 5 1 7 7 翻玛 9 2 5 毒l l 叮 5 褐 l 躲 e o l l 钉 0 7 8 铭l 7 g 弧 订馘a 锚g 馘 从l 盯t l c 托馘a 臌g 托 甜姨g 她戗? 玎cg g l 稻锚ao a ka 渔a 1 曙c 从馘 t 髓c 伐冼 锚纛a a a 姒酗c 创眄g 锚a 船榭o 四馘 e 豫从ta c a 被馘i g 程q ga 强 翻旺霸曙磁a a a 船劓埋a a a 鼹g n 艋 e 从 g 曩贸射盯6 a ag 竹6 a aa c t 强1 1 rg a a 议搬a a aa c ac a a i 肼g l 誓 bc 聪a a aa 溅 勰蠢“lg 孙馘l 馘tc “a a a 嗣婚a pl翼置l?g nvdd 口 l互p n 口t 四a 摊g g 玎g 强t 艋嗣盯拟婚飘玎 c 嚣铡f aa a a 铆渔 l 暑 誓e丫o ydys 嚣t下 ie 四 1 隗 四 氍mg a a a 懿ig 旺强t 从l 馓矗a zizlldx tdedn誓qs 豫g e t 锚e ? 强强z 最舱a 强强矗a 玎a 锻to 髓e 旺蚀g 四t sdlddlq l z c gqqv 四 他 强蠢强l 铭 枷强ta a a 戗玎雠tc m 馘t 觚矗a 订 l i s口de冀 dxd q d i i a a ag 编翎阿触尽椒撤创潺g 盯嬲馘l z 副撂a h l 融 ld丫iss墨dld冀dlpl 制l 触：r 钙翟 玎锚la a az e 蠢a 盯剑峨从ga 玎盯cg u 瓣粥 e冀oipxse客x i ieng g 霖 1 阿a 娌翻盯a 罾c c 从t 稍瞪mg 舡乱i r 钌 g 四盯 n vihdps拜丫fe 曩 丫 a ll 蛾 器强a 触汀 刀g 弼g 姓锚t 盯gc n r 弘t 玎? g 赡 嚣l墨 e i tve 蚤i l a dfv 锚t 创略g 劓盯创魄g la a a 馘q 吼疆l 强a a am devnednxle s 矗c 强 鼍ua a at 她r1 翻瞪i l ”曙g c & 锯tj 蛆z 豫a a a 张lr 疆强t 愚贸? 强弱滢z 弘筠ra 弘零强豫昼筠er a za c c 从l a a a c 副谊a a aa a a a a aa a aa a aa a aa a aa a a 圈3 3b m - x 蛋白c d n a 序列和推测的氨基酸序列 f i g3 3e d n as e q u e n c ea n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo fb m x 2 4b m x 生物信息学分析 镯 g o 1 5 5 1 8 0 铭5 l 勰o 1 6 3 1 5 s l 弱o 铀 幻5 6 l 曩5 0 7 墨 钾弓 9 l 5 4 0 1 0 8 5 8 5 1 2 z 髓o 1 5 0 6 7 5 7 2 0 约5 7 9 8 一般说来，如果一个蛋白质序列和较多不同种属的蛋白质序列具有较高的同 2 l 浙江理工大学硕士论文 源性( 3 0 以上) ，那么提示待分析的蛋白质序列可能是相应家族的成员【4 2 1 。使用 在线b l a s t p 工具对b m x 氨基酸序列同n c b i 蛋白氨基酸序列数据库进行同源比 对分析，未能搜索到具有意义的同源蛋白，这说明b m - x 基因不仅是一个家蚕中 未经研究的新基因，甚至可能是一个在当前已知生物的基因库中尚未被研究的基 因，对它进行研究，具有一定的创新意义。 通过t a r g e tp 分析b m - x 蛋白在细胞内的定位，结果显示其存在于线粒体和 分泌至细胞外的可能性不大( m t p = 0 0 7 5 ，s p = 0 0 5 7 ) 。通过p r o s i t e 蛋白质数 据库对b m - x 蛋白氨基酸序列进行分析，结果显示在氨基酸序列4 7 和1 4 3 1 4 6 处各有一个n 糖基化位点；在其它位置还存在1 个潜在的蛋白激酶c 磷酸化位 点、7 个潜在的酪氨酸激酶i i 磷酸化位点和2 个潜在的n 豆蔻酰化位点( 见图3 4 ) 。 穿鞠戳a s a _ g l 嘏鳓s y l a t i o n ，艇? 鳓蝴f 豳孵鑫觚； 4 款麓戤 1 4 1 1 1 4 6 ：n l 旺z 嬲p k cp h o s p f f o _ s i t e ：，加鳓一太热嫩脚j | l ，蝴酩脚舶，： 勰3 啾n 鬈 熟辫麟c k z _ p h o s p h os i t e ，o a a 脱 nk i n a a e 舻触鹎幻黼鲥引 2 8 3 t ：雠 3 4 3 7 ：t i i d 鹅4 2 ：飘缝 硒4 9 ：黯曲 6 4 6 7 ：双峭露 8 1 0 4 ：3 摹e 参 1 2 7 1 3 0 ：t 兜b 尹8 0 盼限l s t 札n m y n e t q r e t i o n 瘩蛔： 5 8 6 3 ： g q q v t t 9 i s g ： g z d k s h 图3 4b m - xe d n a 功能位点预测 f i g3 4p r e d i c tf u n c t i o n a ls i t e so fb i n x s i g n a lp 预测的结果显示b m - x 为非分泌型蛋白，存在信号肽概率为0 0 0 0 ， 锚定蛋白概率为0 0 0 0 ，最大分隔位点概率为0 0 0 0 ，不含信号肽( 见图3 5 ) 。 8 i 9 n e l p h i i mp r e d l o t t o n ( e u ks o d s ! ) ls e q u e n c e p o s i t i o h 图3 5 家蚕b m x 蛋白的信号肽分析 f i g3 5s i g n a lp e p t i d ep r e d i c t i o no fs i l k w o r mb m - xp r o t e i n s 通过在线二级结构预测发现( 见图3 6 ) ，b m - x 蛋白可能形成的二级结构主 要为a 螺旋( 3 2 6 5 ) 与无规卷曲( 5 3 0 6 ) ，b m - x 的整体二级结构并没有形成长 的a 螺旋或长段无规卷曲，两者交替排列，中间偶有插入短s h e e t 片段。 helix 2 图3 6 家蚕b m x 蛋白的二级结构预测 f i g3 6s e c o n d a r ys t r u c t u r ep r e d i c t i o no fs i l k w o r mb m - xp r o t e i n s 使用e x p a s y 的p r o t s c a l et o o l 预测了b m - x 蛋白的疏水性( 见图3 7 ) 。结果 显示，b m x 蛋白的疏水性最大值为1 2 0 0 ，最小值为2 9 5 6 ；整个b m x 氨基酸 浙江理工大学硕士论文 残基大多由亲水氨基酸构成，预测b m - x 蛋白可能是一个比较亲水的蛋白。 p r o s o a l eo u t p u qf o ru f rs e q u e n o e h p h o b ，k q t & 0 i 。6 。n fl 铲 一 尹 v “ l f jn。? l j ! f 、8i l u 1 | 7 j f 1 ， y 。 ai 、厂 y 1 y ， 0 l 3 讨论 p o s i t i o h 图3 7 家蚕8 m x 蛋白的疏水性预测 f i g3 7h y d r o p h o b i c i t yp r e d i c t i o no fs i l k w o r mb m xp r o t e i n s 生物信息学( b i o i n f o r m a t i c s ) 是生物学与计算机科学以及应用数学等学科 相互交叉而形成的一门新兴学科。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、 检索与分析，进而达到揭示数据所蕴含的生物学意义的目的。 通过生物信息学工具的比对，结合本研究所面临的科研任务，从本地家蚕蛹 c d n a 文库中筛选到了家蚕基因b i n - x , 该基因与家蚕基因组c d n a 完全吻合，但 属于一个前人没有研究过的新基因。b m - x 不具有保守结构域，不含内含子，这 一特征表明b m - x 在进化中可能比较保守。将b m - x 表达蛋白命名为b m x 。对 b m - x 结构和特性进行生物信息学预测：b m - x 不含信号肽，是一个非分泌性的 亲水蛋白，拥有1 2 个可能存在的功能位点，二级结构主要由a 螺旋与无规卷曲 交替构成。 焉 电 正 以 咭 浙江理工大学硕士论文 运用生物信息学工具鉴定筛选家蚕蛹c d n a 文库中具有研究价值的基因是本 所开展家蚕功能基因研究的第一步；利用生物信息学工具，以本实验室实际测得 的基因数据为基准，通过数据处理、序列片段的拼接、基因功能的预测一直到基 因的分子进化研究，从而确定研究对象和指导研究方法的实施。在本次筛选中， 筛选到的家蚕基因b m - x 是一个未曾被研究过的新基因，对其的研究具有创新性 的研究价值。生物信息学分析发现该基因表达产物b m x 具有可预测的蛋白酶功 能作用位点，是一个不含信号肽的非分泌蛋白，重要的是，预测的b m x 具有良 好的亲水性，这对于后继的原核表达以及纯化工作是有利的。 浙江理工大学硕士论文 第四章r b m x 的原核表达与纯化 1 材料与方法 1 1 材料 e c o l it g l 菌种，重组菌t g i p h e l i x b i n - x , r o s s e t a ( d e 3 ) 由本实验室保存； 表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 购自i n v i t r o g e n 公司：t a q d n a 聚合酶购自p r o m e g a 公司； p c r 胶回收试剂盒购自t a k a r a 公司；限制性内切酶b a m hi 和勋di 购自p r o m e g a 公司；b i g d y e 试剂盒购自a b i 公司；常规试剂配方如无特别说明，均参照分 子克隆实验指南( 第三版) 。 1 2 重组表达质粒的构建策略 以b m - x e d n a 为模板，p c r 扩增获得所选b m - x 基因( 通过引物设计在两 端加入双酶切位点) ，插入到p e t - 2 8 a ( + ) 多克隆位点b a m hi 和x h oi 酶切位点之 间，构建了表达b m x 的重组原核表达质粒p e t - 2 8 a ( + ) - 8 m - x ( 见图4 1 ) 。 “吖4 、。州” _ 。 r 【 m 。竺一“ l l n l l i 、h ) _ l 圈4 lp e t - 2 8 a ( + ) - b m - x 的构建莆略 f i g4 1c o n s t r u c t i o 口o fr e c o m b i n a n tp l a s m i dp e t - 2 $ a ( + ) - b m - x 1 3 引物的设计 根据所选取的b m - x 基因o r f ，设计上游引物p 1 和下游引物p 2 ( i 当上海生 物工程技术服务有限公司合成) ，分别包含b a m hi 酶切位点和起始密码了a t g 、 x h oi 酶切位点和终止密码于t a a ，上、下游引物前分别加八3 个保护碱基c c c 和c c g 。 浙江理工大学硕士论文 p 1 ：5 一c c c q 盥a t g c c g c t g a a c a a a a c a a c 一3 ( 下划线为b a m hi 酶切位点) p 2 5 - c c g ! 囱受鱼垃t c 御 g a c t c g g l 盯1 a t l g t c - 3 ( 下划线为x h oi 酶切位点) 1 4 质粒提取 p h e l i x - b m - x 质粒与表达载体p e t - 2 8 a ( + ) 按照分子克隆实验指南( 第三版) 碱裂解法提取 4 3 】。 1 5p c r 扩增 以b m - x e d n a 为模板，用所设计的引物p 1 和p 2 扩增特异片段。 p c r 反应体系p c r 反应程序 d d h 2 0 10 x p c rb u f f e r 2 5 m mm g c l 2 2 5 m m 4d n t p p l p 2 t a q 酶 模板 t o t a l 1 6 回收p c r 产物 9 4 0 c 预变性 5r a i n 9 4 0 c 变性 3 0s 、 5 5 0 c 复性 3 0s 3 5 个循环 l 7 2 0 c 延伸 1m i n 7 2 0 c 延伸 1 0m i n 4 0 c 保存 在制胶槽中用大孔梳铺制1 琼脂糖凝胶； 取p c r 产物5 0 山上样电泳，在长波紫外灯下切下含有目的片段的凝胶条， 切去多余部分，装入预先称重的1 5 同离心管中； 称重计算凝胶重量，按照1 0 0m g ：3 0 0i x l 加入相应体积的e x t r a c t i o nb u f f e r ； 在5 5 c 水浴箱中温育1 0m i n ，其间晃动离心管2 3 次以加速溶解； m此此旺此止儿此呲 ) i ，一，j l l 1 l 1 5 浙江理工大学硕士论文 加入凝胶一倍体积( 1 0 0m g ：1 0 0 曲的异丙醇，混匀； 将溶液转移至s p i nc o l u m n ，6 0 0 0r p m 离心1r a i n ，倒掉滤过的液体； 加入5 0 0 山e x t r a t i o nb u f f e r ，6 0 0 0r p m 离心1m i n ，倒掉滤过的液体； 加入6 5 0 山w a s hb u f f e r ，6 0 0 0r p m 离心1r a i n ，倒掉滤过的液体； 重复上一步； 1 2 0 0 0r p m 再离心1m i n ，彻底除去未离心尽的液体，将s p i nc o l u m n 转移到 一个新的灭菌离心管中； 向s p i nc o l u m n 中加入5 01 1 1e l u t i o nb u f f e r ，室温静置1m i r a 1 2 0 0 0r p m 离心lm i n ，所得溶液中即包含目的基因片断，可直接用于下一步 实验，2 0 保存。 1 7p c r 产物与质粒p e t - 2 8 a ( + ) 的双酶切 质粒p e t - 2 8 a ( - d 和纯化的p c r 产物分别用b a m hi 和x h oi 双酶切。反应体 系如下： p c r 产物双酶切质粒p e t - 2 8 a ( + ) 双酶切 p c r 产物 3 0m p e t - 2 8 a ( + ) 2 0m b a m hi1 山 b a m hi l 山 x h oilmx h oi 。 lm 1 0 x b u f f e r 5i i l1 0 x b u f f e r5p l d d h 2 0 1 3m d d h 2 0 2 3m 合计 5 0m合计 5 0m 分别混匀，3 7 反应2h ，7 0 0 c 水浴1 0r a i n 灭活限制性内切酶。1 凝胶电泳， 分别割胶回收酶切后的p c r 产物以及p e t - e s a ( + ) 载体片段。 1 8 连接反应 反应体系如下： 回收的载体大片断 回收的p c r 产物 1 山 6p l 浙江理工大学硕士论文 1 4 d n al i g a s e 1m 1 0 t 4 d n a l i g a s eb u f f e r 1 一 d d a 2 0 1m 合计 1 0m 混匀，1 6 反应8h 。 1 9 大肠杆菌t g l 感受态细胞的制备哗i 从l b 平板上挑取新活化的大肠杆菌t g i 单菌落，接种子5m ll b 液体培养 基中，3 7 c 振荡培养1 2h 左右，将该菌悬液以1 ：1 0 0 的比例接种于5m ll b 液体培养基中，3 7 剧烈振荡培养1 2h 至o d 6 0 0 = o 5 左右； 将培养液转入1 5 “离心管中，冰上放置1 0 m i n ，然后于4 。c5 0 0 0r p m 离心 1 0i i l i n ： 弃上清，用预冷的7 5r n m o l lc a c l 2 溶液7 5 0m 轻轻悬浮细胞，冰上放置3 0 m i n ，然后于4 3 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ； 弃上清，加入2 0 0m 预冷的含1 5 甘油的7 5m mc a c l 2 溶液，轻轻悬浮细胞， 8 0 保存备用。 1 1 0 连接产物的转化 取连接产物5 脚，加到2 0 0m 大肠杆菌t g l 感受态细胞悬液中。轻轻混匀， 冰上放置3 0m i i l ； 4 2 c 水浴热激9 0s 或3 7 水浴5r a i n ，迅速取出置冰上冷却3 5m i r a 加入1m l3 7 c 预热的l b 液体培养基( 不含k a n ) ，混匀后3 7 c 水浴lh ，使 细菌恢复正常生长状态； 4 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃1m l 上清，沉淀重悬后取2 0 0g l 均匀涂布于含k a n 的l b 平板上，3 7 c 正面向上放置3 0m i n ，待菌液被培养基吸收后倒置培养 1 0 1 6 h 。 浙江理工大学硕士论文 1 1 1 重组克隆的筛选与鉴定 用无菌牙签从转化平板上挑取若干生长状态良好的白色单茵落，分别接种子 含5 0 删k a r l 和3 4 t e , m l 氯霉素的5m ll b 液体培养基中，3 7 。c ，2 2 0r p m 振 荡培养8 1 0h 。收集菌液提取质粒，b a m hi 和x h oi 双酶切，1 琼脂糖凝胶电 泳检测结果。 1 1 2 大肠杆菌r o s s e t a ( d e 3 ) 感受态细胞的制备 l b 平板挑取新活化的大肠杆菌r o s s e t a ( d e 3 ) 单菌落，接种培养，制备大肠 杆菌r o s s e t a ( d e 3 ) 感受态细胞，方法与本章制备大肠杆菌t g l 感受态细胞相同。 1 1 3 重组表达质粒的转化及鉴定 方法同本章大肠杆菌t g l 重组克隆的筛选与鉴定。 1 1 4 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 在5i n l 含1 0 0m g lk a n 的l b 液体培养基中加5 0 “l r o s s e t a ( d e 3 ) - p e t - 2 8 a ( + ) - b m - x 菌液，3 7 c 震荡培养至o d 6 0 0 = 0 5 ； 加入i p t g 至终浓度o 5m m ，3 7 c 诱导表达； 在8 h 后各收集菌液lm l ，超声破碎菌体，1 2 0 0 0r p m 离心，收集上清，电 泳分别检测上清与沉淀表达产物。 1 1 5s d s p a g e 电泳分析 制胶 分别配置1 2 分离胶和5 浓缩胶溶液，配方如下： 分离胶( 1 2 ) d d h 2 0 1 6 m l 3 0 丙烯酰胺贮存液 2 0m l 1 5 mt r i s c l ( p h 8 8 )1 3 面 浓缩胶( 5 ) d d h 2 0 3 0 丙烯酰胺贮存液 1m t r i s c i ( p h 6 8 ) o 6 8 m l o 1 7 m l o 。1 3m l 浙江理工大学硕士论文 1 0 s d s5 0m1 0 s d sl om 1 0 过硫酸铵 5 0m1 0 过硫酸铵1 0m t e m e d2mt e m e d 1 山 合计 5i n l 合计1 础 分离胶溶液迅速混匀后倒入两块玻璃板之间，高度距板上缘2c m ，加少 量异丁醇覆盖，静置让其聚合3 0 6 0r a i n ，直至出现一条明显的分界线，说 明已经聚合好，除去异丁醇层，并用滤纸吸干多余的异丁醇和未聚合的丙烯 酰胺；浓缩胶混匀后倒在已聚合的分离胶上，并插入样品梳聚合3 0r a i n 。聚 合后，取出样品梳，用水洗涤样品孔，并用滤纸吸去多余的水。 样品处理 诱导表达的菌液，4 。c ，1 2 0 0 0r p m 离心1 0r a i n ，弃上清。沉淀用d d h 2 0 悬浮后加等体积的2 样品缓冲液，混匀后沸水中煮沸1 0r a i n ，1 2 0 0 0r p m 离 心1 0m i n 后取上清上样。 加样 将制备好的凝胶板装进电泳槽并注满缓冲液，取处理好的样品1 0 山加入 样品槽，另在一空白孔加入低分子量标准蛋白溶液5 出； 电泳； 按指示接好电源，以2 0m a 的电流进行电泳，直至指示的溴酚蓝到达凝 胶底部，停止电泳。 染色与脱色 电泳结束后，取出凝胶板，小心地取出胶，将其浸入染色液中，置脱色 摇床振荡染色2 5h ，然后取出胶，放入脱色液中同样振荡直至脱去底色为止。 1 1 6h i t r a p 亲和层析柱纯化重组蛋1 4 6 j 用1 5m lb i n d i n gb u f f e r 平衡h i t r a p 亲和层析柱； 样品经0 4 5l a i n 的滤膜过滤后上样； 用5 倍柱体积b i n d i n gb u f f e r 洗柱至基线； 用w a s hb u f f e r 洗柱至基线； 用e l u t i o nb u f f e r 洗至峰平，收集洗脱下的溶液置于离心管中； 3 2 m m i 碰十镕女 用b i n d i n gb u f f e r 洗至o d 值稳定或峰平，准备重新上样 - s d s p a g e 检测纯化效果。 2 结果 2 1p c r 扩增b m - x 基因片段 以本所台b m - xe d n a 序列的质粒为模板进行p c r 。p c r 产物在经过1 的 琼脂糖凝胶电泳分离后仅在5 0 0b p 下方显示出一条特异性条带，大小与理论值 4 4 4b p 相符合，而十r 应的以d d h 2 0 为模扳的阴性对照在相同位置则没有条带( 见 图42 ) 。 ml2 图4 2 家蠡b m - x 基因的p c r 扩增结果 f i g4 2 t h e n s a l t so f p c ro f b m - x o r f o f s i l k w o r m m 2 5 e b pd n a 分子量标准；ip c r 产物；2 阴性对照； m 一2 5 0 b p d n a l a d d e r m a r k e r ；1p c rp r o d u c t ；2n e g a t i v ec o n l r o l 2 2 重组表达质粒的鉴定结果 碱法小量抽提重组质粒，经b a m hi 和x h oi 双酶切，重组质粒 p e t - 2 8 a ( + ) - b m - x 电泳出现大小两条带( 约4 4 4b p 和5 4k b ) ，与预期的一致( 图 4 3 ) ；以此质粒为模板，用p l 、p 2 为引物进行p c r 扩增鉴定，结果也得到单一 的与预期大小一致的约4 4 4b p 的产物条带f 图44 ) ：表明已获得下确的重组表达 质粒。 圈43 重组质牲p e t - z s a ( + 口，* 膛定 f i g4 3 t h e i d e n t i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n tp l n s m l dp e t - 2 8 ac + ) - b m x m2 5 0b pd n a 分子置杯准；1 b a m h l ，x h o i 酶切重组质粒 m2 5 0 b p d n a l a d d e r m a r k e r ；lr e c o m b i n a n tp i a s m i dd n a d i g e s t e d w i t hb a m h i x h o yi 图4 , 4 重组质粒p e t - 2 8 a 口斛爿p c r 鉴定 f i g4 4 7 h e i d e n t i f i c a l i o no f 珊o m b i n a n tp t a s m l dp e t - 2 8 a f + l - b m - x b yp c r m2 5 0b pd n a 分子量标准；ip c r 产物 m2 5 0b p d n a l a d d e r m a r k e r ；ip c rp r o d u c l 2 3 重组大肠杆菌的诱导表达 将重组大肠杆菌r o s s e t a ( d e 3 ) 经过i p t q 诱导4 h 后收集苗体，制样，进行 s d s - p a g e 检测，结果与阴性对照( 转化了空载后的r o s s e t a ( d e 3 ) 、未诱导的重 组菌) 相比，在2 01k d a 出现浓集的融合蛋白表达条带。经凝胶成像系统和软 件分析显示，表达的蛋白约占菌体总蛋白的5 0 以上f 图45 ) 。取诱导表达菌体 超声破碎后高速离心，分别取上清和沉淀进行s d s - p a g e 检测，重组蛋白能够 溶解在上清中且形成一定的量( 图46 1 。 ml23 圈4 6 诱导表达苗体超声破碎后蛋自分布检铡 f i 9 4 6 p r o t e i nd i s t r i b u t e d d e t e c t i o no t i t i s - f u s i o np r o l e i n i ne d tr o s s e t a ( d e 3 ) a f t e ru l t r a s o n i c w a v ed i s r a p t i o a m 低分子量标准蛋白；l 诱导后的菌体总蛋白：2 离心处理后的沉淀；3 离心处理后上清 ml m wp r o t e i n h r - 1r o s s e t a ( d e 3 ) - p e t - 2 8 a ( + ) 一b m - xa n e r i n d u c i n g ；2c e n t r i f u g a lp r o t e i n d e p o s i t a f t e r u l t r a s o n i c w a v e b i s 咖p t i o n ；3c e n t r i f u g a lp r o t e i ns u 5 d e r n a i a n a f t e ru l t r a s o n i c w a v e d i s 邝p t i o n 3 5 女“ ￥碰十论1 2 4 重组蛋白的纯化结果 重组大肠杆菌经大量诱导培