（食品科学专业论文）高梁红色素抗氧化作用的研究.pdf

吉林农业大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 摘要 高粱红色素存在于高粱的外果皮中，是一种天然色素，合有丰富的黄酮类化合物， 其总黄醌含量高达4 0 1 2 。 本论文主要探讨了以乙醇为提取溶剂提取高粱红色素的最佳工艺条件，以及采用化 学发光法、d p p h 法、t b a 法、测定过氧化值法等体外实验的方法，着重讨论了高粱红色 素对自由基体系和脂质过氧化体系的抗氧化作用。为拓展高粱红色素的应用领域提供了 理论依据，为天然抗氧化弃j 的开发人员和食品行业的技术人员提供新的参考资料。主要 研究结果如下： 1 确定了最佳的提取条件。提取的最佳条件为：固液比i ：7 ，温度5 0 q c ，时间7 0 m i n ， 乙醇浓度5 0 。本实验中高粱红色素的提取率为7 7 6 。固液比、温度是影响高粱红 色素提取率的主要因素，而时间和乙醇浓度对提取率影响不大。 2 确定了高椠红色素的抗氧化作用。通过对高粱红色素抗氧化性的测定，可见，高粱红 色素具有良好的抗氧化能力，不但可以延缓猪油、芝麻油的氧化程度、抑制铁离子诱 导的氧化体系，还可以清除自由基，并随着黄酮类化合物含量的升高其抗氧化能力逐 渐增强，所以增大添加量可以增强高粱红色素的抗氧化能力。 3 黄酮类化舍物具有巨大的生物学作用，如抗茵，抗炎，抗肿瘤等。所以高粱红色素 不仅可以作为着色剂使用，还可以作为功能性添加荆添加到保健食品中。本论文为高 梁红色素开辟了广阔的应用空间。 关键词：高粱红色素提取自由基抗氧化 吉林农业大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 a b s t r a c t s o r g h u mp i g m e n te x t r a c tf r o ms o r g h u ms h e l l i ti s sn a t u r a lc o l o r a n ta n di t si n a i n c o m p o n e n t s i sf l a v o n o l s i tc o n t a i n sf l a v o n o l se r o u g ht o4 0 1 2 t l i st h e s i sm a i n l yd i s c u s st h eo p t i m u me x t r a c tl e v e lo fs o r g h u m p i g m e n t w i t he t h a n 0 1 a n d i t sa n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sw e r ed e t e r m i n e db yu s i n gc h e m i l u m i n e s c e n c e ，d p p h ，t b a ，a n d o t h e rv i t r oe x p e r i m e n t a lm e t h o d s t h j sr e s e a r c hp r o v i d et h e o r e t i cc o n t e n t so ne x p a n d i n gt h e a p p l i e df i e l do fs o r g h u mp i g m e n t ，i ta l s os u p p l i e st h ec o n s u l t st ot h er e s e a r c h e r so n n a t u r a l f o o da n t i o x i d a n ta n dt e c h n i c i a n so nf o o df i e l d t h er e s u l t ss h o w e d ： 1 d e t e r m i n et h eo p t i m u me x t r a c tl e v e l t b eb e s te x t r a c tl e v e li s ：s o l i d l i q u i d1 ：7 ，e s t r a e tt e m p e r a t u r ei s5 0 3 , t i m ei s7 0m i n u t e s 。 t h ec o n s i s t e n c yo fe t h a n o li s5 5 t h ee x t r a c tr a t eo fs o r g h u m p i g m e n t i nt h i se x p e r i m e n t i s7 7 6 t h em a i ni n f l u e n c eo nt h ee x t r a c tr a t ea r ct h ev a l u eo f s o l i d l i q u i d a n d t e m p e r a t u r e ，t h ec o n s i s t e n c yo f e t h a n o la n d t i m eh a v el i t t l ee f f e c to nt h ee x t r a c tr a t e 2 d e t e r m i n et h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e so fs o r g h u m p i g m e n t t h er e s u l t so fv i t r oe x p e r i m e n t a lm e t h o d ss h o w e dt h a ts o r g h u mp i g m e n th a ss u p e r i o r a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s i tc a n p o s t p o n et h eo x i d a n td e g r e e o fl a r da n ds e $ a n l e o i l ，i n h i b i tt h e o x i d a n te f f e c to nt h ep e r o x i d a n t i o no fp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i di n d u c e db yf 色“a n d s c a v e n g e f r e er a d i c a l 硼1 c h i g h e rt h ec o n s i s t e n c yo ff l a v o n o l si s , t h e s t r o n g e r t h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa r e s ow ec a l li m p r o v ei t sa n t i o x i d a n te f f e c t sb y a d d i n gm o r e s o r g h u mp i g m e n t 。 3 t h ef l a v o n o l sh a v eg i g a n d cb i o l o g i c a le f f e c t s ，s u c ha sa n t i b i c t e r i a ，a n t i - i n f l a m m a t i o n ， a n t i t u m o r s o r g h u mp i g m e n t c a l lb eu s e da sn o to n l yc o l o r a n tb u ta l s of u n c t i o n a l a d d i t i v e i tc a nb ea d d e di n t oh e a l t hf o o d t h i sr e s e a r c ho p e n e daw i d e a p p l y i n g f i e l df o r s o r g h u mp i g m e n t k e yw o r d ：s o r g h u mp i g m e n t e x t r a c tf r e er a d i c a la n t i o x i d a n te f f e c t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其他教育机 构的学位证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 、1 、 学位论文作者签名：笔毒百、签字目期：，劲岁生年g 月，d 日 ，炙”一 77 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 吉林农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权吉林农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：雩饔又 签字日期：j - ，础 年夕月弦日 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 电话 邮编 p 厂b 师、j年塑年 ，?华，。 1 陟。 、 ：，) ： 名 期 签 日 师 字 导 签 吉林农业大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 前言 一高粱红色素的研究现状 近年来，随着我国人民生活水平的提高和食品工业的发展，对食用色素的需求量与 日俱增。目前，国内市场销售和食品工业使用的色素，绝大多数是合成色素，合成色素 虽然染着性和调色性好，但长期食用，人们有一种不安全感。从长远的观点看，天然色 素代替合成色素作为食品着色剂是必然的发展趋势。 高粱红色素属于黄醌类色素，黄酮类色素是多酚类色素中的一种，是植物界分布很 广的一类水溶性色素，结构中都有一基本母核a 一苯基并吡喃酮，在母核的基础上 可形成黄酮、黄烷酮、黄酮醇、黄烷酮醇等衍生物。黄酮类色素多与葡萄糖、鼠李糖、 芸香糖结合成苷类形式存在，成苷部位多在母核的3 ，7 位上，游离形式的苷元甚少【1 】。 黄酮类色素中除了高粱红色素以外，还包括可可壳色素和洋葱皮色素。 高梁红色素存在于禾本科植物高梁的外果皮、种皮中，主要成分是3 ，37 ，4 一 三羟基一7 0 一鼠李糖苷黄酮和5 ，7 ，4 一三羟基黄酮。高粱红色素易溶于水、乙醇、丙 酮、丙二醇等有机溶剂。高粱红色素本身呈弱酸性，与碱反应生成盐类，与金属离子可 络和形成盐类( 能抑制金属离子的影响) o 其固体粉末具有金属光泽，水溶液呈透明红 棕色。弱酸性条件下为红褐色，碱性条件下色调更红，在酸性较强的条件下出现沉淀。 对光和热非常稳定，并对一些常用的食品添加剂如蔗糖、磷酸钠、苯甲酸钠、维生素c 等色素允许添加剂量范围是稳定的i 列。 高粱红色素作为一种天然色素，色调自然、柔和、无毒、无特殊气味，着色性能好。 经卫生部门检验，各项指标均符合国家标准要求。根据国家标准( g b 2 7 6 0 8 6 ) 规定【3 】， 高梁红色素可用于熟肉制品、果冻、饮料、糕点、畜产品、水产品及植物蛋白着色。最 大用量0 4 9 l k g 。 沈阳市克拉古斯肉食品厂、沈津肉食品厂等应用高粱红色素水溶性产品作火腿香肠 着色剥，用量为q 3 4 9 k g ，经3 0 q 炉温烤制的火腿香肠，色泽柔和自然，具有真实感， 深受用户欢迎。沈阳市饼干厂采用高粱红色素醇溶产品制成水果糖一次成功，添加量为 0 0 2 5 ，采取直火熬糖工艺生产，制作的水果糖颜色稳定，无特殊气味，获得了满意的 效果1 4 。沈阳市白塔日用化学厂采用高粱红色素醇溶产品和水溶产品分别在口红、洗发 水中用作着色剂，并获得成功。其产品色彩鲜艳，柔和，厂家认为该色素在化妆品中可 以取代化学合成色素酸性大红【5 】。沈阳药科大学采用高粱红色索代替化学合成色素生产 有色糖衣药片，取得了满意的效果。经卫生部门分析，药片的砷、铜含量远低于国家规 吉林农业大学硕士学位论文 商粱红色素抗氧化作用的研究 定的标准，服用这种药片是安全可靠的。新民市红旗制药厂采用高粱红色素作为中成药 增色剂，解决了中药因色调达不到药典要求的颜色而销售困难的问题嘲。随着大力开发 植物色素资源，提取和生产天然色素的热潮的到来，有关高梁红色素的提取及性质研究 屡见报道。 李树芬等人( 1 9 9 3 年) 对高梁红色素的提取及理化性质进行了初步研究，结果表明： 在所有的有机溶剂中，乙醇的提取率最高，丙酮次之，而6 0 乙醇浓度的提取效果优于 其它浓度的提取效果【7 】。 曹晓峰( 2 0 0 0 年) 利用索氏提取器以6 5 乙醇从高粱壳中提取色素，证实了该色素 在可见光区的最大吸收波长为4 9 0 n m 。并对一些常用的食品添加剂如蔗糖、磷酸钠、苯 甲酸钠、维生素c 等对其稳定形态的影响进行了研究，证实高粱红色素在允许添加剂量 范围内是稳定的i s 。 张沙艳等人( 1 9 9 9 年) 利用6 0 乙醇和1 盐酸溶液按一定比例混合作提取剂，并研 究了高粱色素在不同酸度、温度、光照等条件下的稳定性。结果表明高粱红色素在大多 数食品及饮料的酸碱环境下，在室温及食品加工的温度范围内十分稳定，对光及常用食 品添加剂，防腐剂稳定性良好，使用安全性高。而且，随着食品中酸度的不同，高粱红 色素可出现不同的颜色变化，有着丰富的色调口】。 伍明等人设计了用液泛提取器从高粱壳中提取出高粱红色素的薪方法【l o l 。该工艺采 用同一装置不同溶剂提取，可以避免生产高粱红色素中存在杂质高，色价低的问题，产 生不同价位的产品，定位不同产品的用途。 金灵芬等( 1 9 9 9 年) 根据高粱红色素与碱反应生成可溶行盐类的性质，设计了碱提、 酸沉、柱层析精致的新工艺。用0 1 5 0 2 0 的碱液搅拌提取高粱红色素，然后用1 0 的盐酸使色素析出，再用硅胶g 柱进行精制，得到的色素收率高，色价好，但此法废液 不易处理，污染环境【1 1 】。 目前，国内对高粱红色素的研究主要集中在提取及稳定性方面，对其抗氧化性的研 究很少。我国生产天然色素的资源丰富，象高粱红色素的生产原料高粱壳就蕴藏着巨大 的资源优势。全国高粱种植面积约1 3 3 3 万公顷，每年生产高梁壳约2 0 亿公斤，吉林 省2 0 0 2 年种植高梁2 6 0 万亩，高粱壳大都被废弃，我们应充分利用这些资源开发生产 高粱红色素，满足社会需要。 二。高粱红色素抗氧化作用的研究 由于食品添加剂工业的技术进步，带动了食品抗氧化剂的研制、开发、生产和应用 的长足发展。抗氧化剂是一种重要的食品添加剂，它主要用于阻止或延缓油脂的自动氧 化，还可以防止食品在贮藏中因氧化而使营养损坏、褐变、褪色等“2 】。抗氧化剂一般可 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 分为油溶性和水溶性两类，油溶性抗氧化剂包括天然的维生素e 和人工合成的没食子酸 丙酯( p g ) 、抗坏血酸酯类、丁羟基茴香醚( b h a ) 、二丁基羟基甲苯( b h t ) 等；水溶性 抗氧化剂包括维生素c 和异维生素c 及其盐类、植酸、苯多酚等1 1 3 1 。目前食品工业主 要使用人工合成抗氧化剂b h t 和b h a 。因化学合成抗氧化剂的安全性受到怀疑，动物试 验表明具有一定的毒性和致癌作用【1 4 l 。在日本b h a 只能用于棕榈油和棕榈仁油，美国、 欧共体等国已经禁止使用合成抗氧化剂，许多国家对其添加量已经加以限制【1 5 1 ， f a o w r o 食品标准法典明确规定合成抗氧化荆的添加量。所以具有安全性商、抗氧 化能力强、无毒副作用、防腐保鲜等特点的天然食品抗氧化剂日益受到重视，现在国际 上流行“有机食品”，是完全没有污染物，不含任何人工合成的物质。为了满足各种保 健品生产的需要，研究开发广谱、高效、安全的天然抗氧化剂，成为当今食品添加剂研 究领域中的热点之一。 氧化在很大程度上与自由基有关。自由基性质活泼，有极强的氧化反应能力，对人 体有很大的危害性，在体内自由基和脂质过氧化作用使多种大分子成分如核酸、蛋白质 氧化变性，d n a 交联和断裂，导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌症、衰老及心血 管病等退变性疾病”6 】。环境污染，电离辐射，化学毒物和药物等因子可在机体内引发多 种自由基。随着自由基研究的逐渐深入，人们认识到了自由基的危害性，因此对清除自 由基作用保健食品的研究受到人们的重视。 衰老的自由基学说是英国学者d e n h a mh a r m a n 于1 9 5 6 年首先提出的，主要认为：随 着年龄增大的退行性变化是由于自由基的副作用所引起的【l ”。这成为现代衰老学说中最 重要的一种，他从分子生物学角度来解释衰老现象，其实质是除遗传因素外，有氧生物 在呼吸中产生的氧自由基造成的机体损伤是衰老的重要原因。该学说一出现便得到了许 多独立试验的证实，同时该学说是构成其他学说如交联学说、废物堆积学说的基础。近 年来的研究表明，许多疾病的发生发展与自由基有密切关系。 自由基又称游离基一o f r ，系指外层轨道含有未配对的电子、原子团或特殊状态的分 子。主要包括超氧阴离子( 0 ：一) 、羟自由基( o h ) 、单线态氧( 0 ：) 和过氧化氢( r o ：) 。 0 2 和o h 对体内生物大分子的攻击，往往又可引起这些大分子产生其它自由基，如攻击 脂质引起过氧化而生成脂过氧基( r 0 0 ) ，攻击核酸引起嘌呤和嘧啶自由基的生成等。 自由基通过下述方式损伤细胞：( 1 ) 与膜上的酶和受体进行共价结合，从而影响膜成分 的活性；( 2 ) 与膜的组成成份共价结合，从而影响膜的结构和膜的功能与抗原特异性； ( 3 ) 通过共价结合，使巯基氧化或改变膜多聚不饱和脂肪酸( p u f a ) 与蛋白质的比例 而干扰运转；( 4 ) 引起p u f a 的过氧化而直接影响膜结构。 吉林寝韭大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 来自体内外的过量自由基在一定环境下时刻影响机体的各个方面人体自身虽然有 完整的抗氧化系统进行自发保护，但当体内自由基产生太多或清除能力下降时，就会导 致各种炎症、癌症、衰老等一系列病变口9 1 。 黄酮类化合物广泛存在于植物中，既是优良的自由基清除剂，又是良好的抗氧化剂。 早在3 0 年代就发现了类黄酮具有v 。样的活性，曾一度被列为v p 。类黄酮抗油脂过氧化 作用早在6 0 年代就已经被证实。8 0 年代以来，对类黄酮的研究逐渐转向其清除自由基 的能力、抗衰老及对老年病的防治功效上1 2 0 1 。 黄酮类化合物具有不同取代情况的酚羟基。酚羟基是良好的电子提供者，因此可表 现出较好的还原能力、清除自由基能力和中断油脂自动氧化链式反应的能力【2 1 】。分子中 心的d 、b 不饱和吡喃酮使其表现出一定的抗氧化性。其抗氧化机理主要是：阻止了自 由基在体内产生的三个阶段，一是与0 ：一反应阻止自由基引发；二是与金属离子螯和阻 止o h 生成；三是与脂质过氧化自由基( r 0 0 - ) 反应阻止脂质过氧化过程【2 2 】。 2 1 世纪是一个追求食品安全与可持续发展的绿色世纪。以天然食品抗氧化剂取代化 学合成的抗氧化剂是今后食品抗氧化剂工业发展的趋势，开发高效、实用、成本低廉的 天然抗氧化剂仍是研究重点。许多天然色素和天然香精等天然产物具有良好的防腐作用 和抗氧化活性 2 3 - 2 7 】，对人体的多种疾病还具有非常突出的治疗、预防等药理作用和保健 功能，这些一直未被充分开发和利用。这对于天然资源无疑是极大的浪费。 高粱红色素中含有丰富的黄酮类化合物，而黄酮类化合物具有巨大的生物学作用， 如抗菌、抗病毒口8 、抗炎、抗过敏 2 9 1 ，高梁红色素中的3 ，3 ，4 一三羟基一7 0 一鼠李 糖苷黄酮具有b 环上的3 ，4 - 邻二羟基，这是高粱红色素具有抗氧化性的关键部位。从 黄酮类抗氧化剂结构上分析，b 环酚羟基与a 环酚羟基有一点差别。前者的两个。h 多处 于邻位，而后者多处于间位a o 。显然邻位o h 被抽氢产生自由基后可借助形成分子内氢 键得以稳定，因而抗氧化活性更高，而且，邻位o h 的自由基可通过共振形成邻苯醌， 这也可降低其内能、提高自由基的稳定性，而问位酚羟基不具备这两种稳定机制 3 1 1 。 三本论文的研究内容 本论文主要研究高梁红色素抗氧化方面的性质，采用体外实验的方法测定高粱红色 素清除自由基的功能抗氧化性【3 2 。体外实验的特点是快速、灵敏，可对保健食品清除自 由基作用进行初步评价，适用于筛选抗氧化保健食品功能材料。 本论文为高粱红色素开辟了广阔的应用空间，为拓展高梁红色素的应用领域提供了 理论依据，为天然抗氧化剂的开发人员和食品行业的技术人员提供新的参考资料。 吉林农业大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1 原料 高粱壳：采自吉林省榆树市黑林镇 猪油、芝麻油、豆油购于吉林农业大学农贸市场 1 1 2 化学试剂 芦丁：上海化学试剂厂 d p p h ：s i g m a 公司 b h t ：北京鼎国生物制品厂 抗坏血酸：上海化学试剂厂 亚油酸：上海化学试剂厂 乙醇、冰醋酸、三氯甲烷、三氯化铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、碘化钾、硫代硫酸钠、 硫代巴比妥酸、水杨酸钠等均为北京化工厂生产的分析纯 1 1 3 仪器 r e 5 2 c s 旋转蒸发器 s h b b 9 5 型循环水式多用真空泵 1 0 1 2 型真空干燥箱 x m t a 7 0 0 0 多用水浴恒温振荡器 l g l 0 2 4 a 离心机 d s h z 一3 0 0 培养箱 d s y 一2 4 孔电热恒温水浴锅 7 2 2 一型可见分光光度计 8 5 2 型恒温磁力搅拌器 a l c i i 0 4 电子天平 1 2 试验方法 1 2 1 高粱红色素的提取 本试验采用乙醇提取法，并采用四因素三水平的正交试验，分别对溶剂原料比、 提取温度、提取时间及溶剂的浓度的最佳组合作以研究。以期达到低成本，高收率， 高利用率的生产目的。 每份称取高粱壳1 9 ，样品中加入溶剂后放在恒温水浴振荡器中浸提，每份样品 经三次提取，合并三次的提取液，于5 0 下蒸发浓缩，再在真空干燥箱中干燥，即 得到粗色素，为棕红色粉末，称重备用。 吉林农业大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 高粱红色素提取流程： 山 除杂( 去除沙粒和一些草棍) 山 干燥( 5 0 ) 山 粉碎( 2 0 4 0 目) 山 浸提( 5 0 ，三次) 山 离心( 6 0 0 0 r m i n ) 山 残渣 山 上清液 i w 弃去浓缩( o i m p ，5 0 ) 山 干燥( 0 i m p ，5 0 ) 山 粗色素( 成品) 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 本试验以乙醇为提取溶剂，先通过单因素试验确定了正交试验的水平范围，设 计四因素三水平的正交试验，正交试验设计表见表1 。 表1高粱红色素粗提正交试验设计表l ，( 3 ) t a b l e l 。e x p e r i m e n t f a c t o ra n dl e v e lo f $ o f g h u m p i g m e n t e x t r a c t 1 2 2 高粱红色素中总黄酮定性定量的测定 黄酮类化合物在植物体内主要与糖结合成甙，它与硝酸铝生成黄色的黄酮铝络合 物，可以定性。黄色的深浅与黄酮类化合物的含量呈一定比例关系，可比色定量瞄3 。所 以以芦丁为标准品、用比色法测定不同物质中黄酮类化合物的含量。 1 2 2 1 标准曲线的制备 分别精确吸取0 0 2 9 6 的芦丁标准乙醇溶液0 m l ，o 5 m l ，1 0 m l ，1 5 m l ，2 0 m l ，2 5 m l 于6 支1 0 m l 的具塞刻度试管中并加入乙醇溶液至5 m l 。加5 的n a n o ：溶液0 3 m l ，摇匀， 放置6 m i n 。加入1 0 的a l ( n o ，) ，溶液0 3 m l ，摇匀，放置6 m i n 。加i m o l l n a 0 h 溶液 4 m l ，定容到1 0 m l ，摇匀，放置1 5 m i n 。以乙醇空白溶液作为对照，在7 2 2 一型分光光度 计上分别测定5 1 0 r i m 处的a 值。 1 2 2 2 含量的测定 分别精确吸取浓度为0 0 1 的待测色素乙醇溶液5 m l 各两份( 重复) 于1 0 m l 具塞的 刻度试管中，并以乙醇溶液定容到5 m l 。加5 的n a n o ：溶液0 3 m l ，摇匀，放置6 m i n 。 加入1 0 的a l ( n o ，) ，溶液0 3 m l ，摇匀，放置6 m i n 。加i m o l l n a o h 溶液4 m l ，定容到 1 0 m l ，摇匀，放置1 5 m i n 。以空白溶液作为对照，在7 2 2 一型分光光度计上分别测定5 1 0 n m 处的a 值。将得到的c 值2 0 0 银p 为各样品的黄酮类化合物的百分含量。 1 2 ，3 高粱红色素对d p p h 清除作用的测定 一般来讲，自由基化学性质活泼，寿命极短，但也有例外，例如二苯代苦味肼基自 由基( 1 ，1 一二苯基一2 2 苦肼基或1 ，1 - d i p p h e n y 一2 一p i c r y l h y d r a 2 yr a d i c a l d p p h ) 。 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 1 9 5 8 年已把其用于抗氧化剂的筛选研究。由于d p p h 有个单电子并在5 1 7 n m 处有较强 的吸收，其乙醇溶液呈深紫色。如果有其它物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收 将会消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系”“。d p p h 法能测定为数众多的天然 抗氧化剂而不受葡萄糖等干扰”“。由于清除剂直接作用于d p p h 自由基，反应时间仅 需2 0 m i n 左右，操作简单，且一般分光光度计即可测定。因此d p p h - 法直接、灵敏、 快速、简便。 分别精确吸取0 0 1 的精制色素、b h t 、v 。的9 5 乙醇溶液及0 。0 2 ，0 。0 5 ，o 0 8 ， 0 1 的色素9 5 乙醇溶液2 m l ，各加入2 i 0 “m o l l 的d p p h 溶液2 m l ，摇匀后放置3 0 m i n ， 以溶剂为对照，分别测定5 1 7 r i m 处的a b s 值a i 。同时测定上述溶液2 m l 与2 m l 溶剂混 合后在5 1 7 n m 处的a b s 值a j 。再测定2 m l d p p h 溶液与2 m l 溶剂混合液在5 1 7 r i m 处的a 值a c 。将三值按公式计算其抑制率。 抑制率= ( 1 一( a i a j ) a c 1 0 0 1 2 4 高粱红色素对羟自由基( o h ) 清除作用的测定 f e n t o n 反应产生- o h ，反应式如下： h 2 0 2 + f e 2 + _ + o h + h 2 0 + f e “ 羟自由基氧化水杨酸得到2 ，3 二羟基苯甲酸，用其在5 1 0 r i m 处的吸光值表示o h 的多少。吸光值与o h 的量成正比。反应体系中加入具有清除o h 作用的物质即可降 低该吸光值【3 q 。本试验利用水杨酸法测定高粱红色素对o h 的清除能力。 用f e s o 。+ m o 。产生o h ，以o h 氧化水杨酸钠所得产物的吸光值表示o h 的多少， 吸光值大则o h 越多。3 m l 反应液中含0 1 5 m o l lf e s o 。，6 m m o l lh ：如，2 m m o l l 水杨 酸钠及不同浓度的色素、b h t 、v c 溶液。最后加入h 2 0 ：启动反应，3 7 反应1 h ，测定 5 1 0 n m 处的吸光值，吸光值越小则清除- o h 效果越好捌。按下式计算清除率： 清除率( s ) = a o 一( a i a o i ) 1 0 0 a o 其中a o 一不加样品时反应体系的吸光度a i 一加入样品后反应体系的吸光度 a o i 一样品液的吸光度 1 2 5 高粱红色素对f e 2 + 诱发卵黄脂蛋白过氧化的抑制作用 配制1 ：2 5 倍稀释的卵黄悬浊液( 卵黄用等体积的p h = 7 4 00 i m o l l 磷酸缓冲液 ( p b s ) 配成，使用之前用磁力搅拌器搅拌1 0 m i n ) 。每份分别取卵黄悬浊液0 2 m l ，加 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 人不同体积的样品液，使其总黄酮的浓度分别为4 、8 、1 2 、1 6 、2 0 u g l m l ，再分别加入 2 5 m m o l l f e s o 。7 h ：0 溶液0 2 m l ，用p b s 补足2 m l ，对照管除不加样品溶液外其它试剂 同前，并提前加入5 0 _ - - - 氯乙酸溶液0 5 m l ，对照管与样品管同置3 7 水浴温浴4 h ，取 出后加入5 0 三氯乙酸溶液0 5 m l ，再加0 8 硫代巴比妥酸( t b a ) i m l ，混匀，置1 0 0 水浴2 0 m i n ，冷却后3 5 0 0 r m i n 离心1 5 m i n ，取3 m l 上清液在5 3 2 n m 处测定吸光度。 抑制率( ) = a 空白一a 样品 x 1 0 0 a 空白 1 2 6 高粱红色素对亚油酸脂质过氧化的抗氧化性的测定 采用t b a 法【删：配制2 5 的亚油酸乙醇溶液作为底物溶液，分别加入底物使其成 为浓度为0 0 1 m g m l b h t 、0 o l m g m l v c 、0 o l m g m l 高梁红色素、0 0 5 m g m l 高梁红色素、 0 i m g m l 高粱红色素溶液，混匀后置于培养箱中于4 0 下培养。定时取出i m l 待测样 品，加入i m l 2 5 _ 三氯乙酸混匀，放置，终止反应。然后加入i m l o 6 7 的t b a ，于沸水浴 中加热1 0 m i n 。取出冷却后加入4 m l 正丁醇，摇匀，于4 0 0 0 r m i n 下离心1 0 m i n ，取上 层正丁醇液，于5 3 2 n m 处比色，同时测定不加抗氧化物的空白样品的吸光度。吸光度越 小，表明抗氧化能力越强。 1 2 7 高粱红色素对以f e 2 + 催化亚油酸过氧化体系抗氧化性的测定 在l o m l o 2 m o l lp h = 7 4 的磷酸钠缓冲液中，加入2 5 亚油酸乙醇液4 i m l ，二次 蒸馏水4 9 m l ，并加入i m lf e 2 + ( 【f e 2 + - 2 5 4 1 0 4 9 l ) 作催化剂形成底物溶液，分别加 入底物使其成为浓度为0 0 1 m g m l b h t 、0 0 1 m g m l v c 、0 0 1 m g m l 高粱红色素、0 0 5 m g m l 高梁红色素、o i m g m l 高粱红色素溶液。混匀后于4 0 1 。c 生化培养箱中反应定时取出 待测样品，迅速加入2 5 的三氯乙酸混匀，放置，终止反应。然后加入0 6 7 的t b a ，于 沸水浴中加热1 5 m i n 。取出冷却后加入4 m l 正丁醇，手5 3 2 n m 比色，同时测定不加抗氧 化物的空白样品的吸光度。吸光度越小，表明抗氧化能力越强。 1 2 8 高粱红色素对猪油的抗氧化性的测定 油脂氧化过程中产生过氧化物【4 1 】，与碘化氢反应时析出碘，用硫代硫酸钠标准溶 液滴定，计算过氧化值的含量，反应如下： c h ) c o o h + k i - - * c h c o o k + h i 2 h i + r 。一c h c h 凡- - * r l c h c h r 一凡0 + 1 2 ii o 川0 吉林农业大学砸士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 i2 + n a 2 s 2 0 3 - - + 2 n a 2 i + n a 2 s , 0 6 在油脂中添加高粱红色素后，通过对油脂氧化程度的测定，可知高粱红色素抗氧化 能力的大小。过氧化值越小，抗氧化能力越大。 配制浓度为0 0 1 m g m l 的b h t 、v c 的无水乙醇溶液及浓度为0 0 1 m g m l 、0 0 5 m g m l 、 0 i m g m l 的高粱红色素的无水乙醇溶液各1 0 m 1 分别加入到1 5 9 左右的猪油中混匀，放 在6 0 1 的培养箱中进行培养。每隔1 2 h 取出2 3 9 样品，置于碘瓶中，加入3 0 m l 氯 仿一冰乙酸( 氯仿：冰乙酸= 2 ：3 ) 混合液，溶解样品，再加入i m l 饱和k i 溶液，立即 加塞摇匀，放置暗处反应5 m i n 。取出以上样品，加蒸馏水1 0 0 m l ，用0 0 0 2 m o l l n a 。s 。0 ， 标准溶液滴定至淡黄色时，加入i m l l 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点，计算 抗氧化值( p o v ) o 计算公式如下： p c v = m 1 0 0 0 1 0 0 其中：c n a ，s ：0 ，标准溶液的浓度( m o i l ) v 1 样品溶液消耗n a ：s ：0 ，标准溶液的体积( m 1 ) v 2 试剂空白消耗n a ：s ：0 ，标准溶液的体积( m 1 ) 胪样品的质量( g ) 1 2 9 高粱红色素对芝麻油的抗氧化性的测定 配制浓度为0 0 1 m g m l 的b h t 、v c 的无水乙醇溶液及浓度为0 0 1 m g m l 、0 0 5 m g m l 、 0 i m g m l 的高梁红色素的无水乙醇溶液各l o m l 分别加入到1 5 9 左右的芝麻油中混匀， 放在6 0 - i - 1 。c 的培养箱中进行培养。每隔1 2 h 取出2 3 9 样品，置于碘瓶中，加入3 0 m l 氯仿一冰乙酸( 氯仿：冰乙酸= 2 ：3 ) 混合液，溶解样品，再加入i m l 饱和k i 溶液，立 即加塞摇匀，放置暗处反应5 m i n 。取出以上样品，加蒸馏水1 0 0 m l ，用0 0 0 2 m o l l n a 。s 。0 ， 标准溶液滴定至淡黄色时，加入i m l l 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点，计算 抗氧化值( p o v ) 。 1 2 1 0 高粱红色素对豆油的抗氧化性的测定 配制浓度为0 0 1 m q m l 的b h t 、v 。的无水乙醇溶液及浓度为0 o l m g m l 、0 0 5 m g m l 、 0 i m g m l 的高粱红色素的无水乙醇溶液各1 0 m 1 分别加入到1 5 9 左右的豆油中混匀，放 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 在6 0 1 的培养箱中进行培养。每隔1 2 h 取出2 3 9 样品，置于碘瓶中，加入3 0 m l 氯 仿一冰乙酸( 氯仿：冰乙酸= 2 ：3 ) 混合液，溶解样品，再加入i m l 饱和k i 溶液，立即 加塞摇匀，放置暗处反应5 m i n 。取出以上样品，加蒸馏水1 0 0 m l ，用0 0 0 2 m o l l n a 。s ：o ， 标准溶液滴定至淡黄色时，加入i m l l 淀粉指示剂，继续滴定至蓝色消失为终点，计算 抗氧化值( p o v ) 。 2 结果与分析 2 1 高粱红色素的提取 乙醇为提取溶剂做正交试验的结果见表2 。 以粗提得到的高粱红色素的质量为评价指标。 表2 正交试验的结果 t a b l e 2 r e s u ko fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a lo fe a c h g r o u p abcd质量( g ) 重复1重复2 t i 0 3 6 3 3 0 4 0 6 4 0 4 3 5 5 0 1 2 1 0 1 3 5 0 1 4 5 0 0 2 4 0 3 7 7 0 0 4 2 0 3 0 4 0 7 9 0 1 26 o 1 4 0 0 1 3 6 0 0 1 4 0 4 1 4 1 0 3 9 4 4 0 3 9 6 7 o 1 3 8 o 1 3 1 0 1 3 2 0 0 0 7 o 4 1 2 0 0 4 0 3 7 0 3 8 9 5 0 1 3 7 o 1 3 5 o 1 3 0 0 0 0 7 o 0 6 0 7 0 0 6 5 2 o 0 5 6 4 0 0 5 7 6 0 0 7 2 6 o 0 7 6 6 0 0 6 4 6 o 0 7 3 8 o 0 7 1 5 o 5 9 9 0 0 0 5 9 7 o 0 6 0 3 0 0 6 1 0 0 0 6 3 1 0 0 7 0 8 0 0 6 5 7 0 0 7 i3 o 0 7 7 6 0 0 7 6 7 0 6 0 6 2 0 1 2 0 4 0 1 2 5 5 0 1 1 7 4 0 1 2 0 7 o 1 4 3 4 0 1 4 2 3 0 1 3 5 9 d 1 5 1 4 0 1 4 8 2 1 2 i ) 5 2 1 1 。 o o o ； o ， o ， q 眨融| 髓 r 吉林农业大学硕士学位论文高粱红色素抗氧化作用的研究 方差分析结果见表3 。通过方差分析m 1 做f 检验的结果，因素a 、b 差异极显著， 因素c 、d 差异不显著，表明本试验中固液比、提取温度是影响高粱红色素提取的主要 因素，而提取时间和提取溶剂的浓度对提取率没有影响。从极差分析来看，提取高粱红 色素的最佳条件为固液比为1 ：7 ，温度5 0 ，时间? 0 m i n ，乙醇浓度5 5 。 表3 方差分析表 t a b l e 3 v a r i a n c ea n a l y s i so ft h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t 变异来源 s sd fm s f 其中f 0 0 5 ( 2 8 ) = “4 6f 0 0 1 ( 2 8 ) = 8 6 5 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 2 2 高梁红色素中总黄酮定性定量的测定 2 2 1 标准曲线的制备 通过直线相关回归分析，证明在浓度为0 o l 一0 0 5 m g m l 范围内，芦丁的含量与其 吸光度呈正相关，得芦丁浓度c 与吸光度a 的关系曲线的回归方程式：a ：9 5 4 5 7 c + 0 0 0 8 4 ( r = o 9 9 6 8 ) o 标准曲线见图1 。 2 2 2 黄酮类色素中总黄酮的含量 黄酮类色素包括高粱红色素、洋葱皮色素、可可壳色素三种。 三种黄酮类色素中总黄酮的含量见表4 。 由表中可以看出在三种黄酮类色素中，高梁红色素中黄酮类化合物的含量最高，达 4 0 1 2 ，可可壳色素中黄酮类化合物含量最少，只有2 4 1 8 。 高粱红色素与硝酸铝反应呈黄色，证明有黄酮类化合物存在。 表4 几种黄酮类色素中总黄酮的含量 t a b l e4 t h ec o n t c n l so ff l a v o n o i do ft h r e en a t u r a le d i b l ef l a v o n o i d p i g m e n t s 色素名称含量( ) 高粱红色素 洋葱皮色素 可可壳色素 4 0 1 2 2 7 4 0 2 4 1 8 童苎窒些查塑圭整堡塞 壹墨塾鱼查垫苎垡堡旦塑塑壅 0 6 0 5 赵0 4 米 螫 0 3 o 2 o 1 o 0 0 10 0 20 0 3 0 0 40 0 50 0 6 a = 9 5 4 5 7 c + 0 0 0 8 4 ( r = 0 9 9 6 8 ) 图1 芦丁标准曲线 f i 9 1 s t a n d a r dc u r v e 1 4 吉林农业大学硕士学位论文 高粱红色素抗氧化作用的研究 2 3 高粱红色素对d p p h 的清除作用 本试验采用d p p h - 法测定高粱红色素对d p p h - 自由基的清除能力。 浓度为o 0 1 m g m l 的v 。、b h t 及高粱红色素溶液对d p p h 自由基的清除作用结果 见图2 。浓度为0 0 1 m g m l 、0 0 5 m g m l 、0 i m g m l 的高梁红色素对d p p h 自由基的 清除作用结果见图3 。 由图可以看出，高粱红色素对d p p h 自由基具有较好的清除作用，其清除作用高 于b h t ，但低于抗坏血酸。并且，随着高粱红色素浓度的升高其对d p p h 自由基的清 除性逐渐增强。 2 4 高粱红色素对o h 的清除作用 本试验采用水扬酸法测定高梁红色素对o h 的清除作用。 不同浓度高粱红色素对o h 自由基的清除作用见表5 。 可见，高粱红色素浓度较低时，对羟基自由基的清除作用较弱，当其浓度为 0 0 1 m g m l 和0 0 5 m g m l 时几乎无抗氧化作用。当浓度达到0 i m g m l 时其清除率升高， 为2 2 6 1 ，高于浓度为0 0 1 m g m l 的v c 的清除作用。而b h t 对o h 自由基没有清除 作用。 表6 高粱红色素对o h 自由基的清除作用 t a b l e 6 t h es c a v e n g i n ge f f e c t