管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素B1.docx

论 文 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素 b1郑国金, 陈惠, 应希堂, 胡国茂, 林金明* 清华大学化学系, 北京 100084 楚雄医药高等专科学校化学教研室, 楚雄 675000 北京科美生物技术有限公司, 北京 100094*通讯作者, email: 收稿日期: 2010-11-14; 接受日期: 2010-11-22doi: 10.1360/032010-839摘要开发了一种管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中黄曲霉毒素 b1 的方关键词黄曲霉毒素 b1 化学发光免疫分析 磁性微粒子 玉米样品法, 该方法使待测玉米样品中的黄曲霉毒素 b1、辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 b1 与异硫氰酸荧光素(fitc)标记的黄曲霉毒素 b1 单克隆抗体在均相体系中发生竞争性免疫反 应, 再加入用抗 fitc 抗体包被的磁微粒作分离剂, 抗原抗体复合物结合在磁微粒上, 在 磁场中经分离、洗涤后加发光底物, 检测发光强度, 测定玉米样品中黄曲霉毒素 b1 的含 量. 此方法标准曲线线性范围为 0.055 ng/ml, 检测限为 0.02 ng/ml, 批内相对标准偏差 小于 9%, 批间相对标准偏差小于 15%, 具有良好的稳定性和重现性.发光免疫检测.黄曲霉毒素 b1(afb1)是一种半抗原小分子, 有 免疫反应性, 实验中采用竞争法对玉米样品中的黄曲霉毒素 b1 进行分析, 使待测黄曲霉毒素 b1、辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 b1(afb1-bsa-hrp) 在均相体系中与异硫氰酸荧光素(fitc)标记的黄曲 霉毒素 b1 单克隆抗体(fitc-afb1 单抗)发生竞争性 免疫反应, 再加入用抗 fitc 抗体包被的磁微粒, 抗 原抗体复合物结合在磁微粒上, 在磁场中经分离、洗 涤后加发光底物, 用冷光分析仪检测发光强度, 测定 玉米样品中黄曲霉毒素 b1 的含量(图 1).1引言黄曲霉毒素(aflatoxins)是由黄曲霉、寄生曲霉产 生的一类化学结构类似的代谢产物, 目前已分离鉴 定出十余种毒素. 黄曲霉毒素 b1 常存在于玉米、花 生、棉花籽和一些干果中, 是危险的致癌物, 世界各 国对黄曲霉毒素 b1 在食品、农产品和饲料中的最高 允许量作了规定, 因此, 快速、准确地检测食品、农 产品和饲料中黄曲霉毒素 b1 的含量对于提升我国农 业高技术的自主创新能力与国际竞争力, 保障国家 食品、农产品质量安全, 提高人民生活质量, 实现农 业可持续发展均有重要意义. 目前, 常用的检测黄曲 霉毒素 b1 的方法有电化学分析法14、高效液相色谱 法(hplc)58、酶联免疫分析法(elisa)911等. 本实 验应用化学发光免疫分析法(clia)高灵敏度和高特 异性的特点, 利用磁性微粒子的分离特性, 快速、准 确地对玉米样品中黄曲霉毒素 b1 的含量进行了化学2实验部分2.1试剂与仪器flashn glow lb955 30 管全自动进样冷光分析郑国金等: 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素 b1图 1 磁微粒化学发光免疫分析法测定黄曲霉毒素 b1 的分析原理示意图仪(berthold 公司); 高速离心机(beckman 公司), 转速 13000 r/min; 磁性分离器(北京科美生物技术有限 公司定制, 磁场强度 2800 高斯); xw80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司); 试管 12 60 mm(浙江拱 东医用塑料厂); 磁性微粒子(磁性分离剂, adaltis 公司).黄曲霉毒素 b1 标准品(sigma 公司 a6636); 黄曲 霉毒素 b1 单克隆抗体(sigma 公司 a9555); 黄曲霉毒素 b1-bsa 结合物(sigma 公司 a6655); 抗 fitc 抗体包被的磁性微粒子(5 mg/ml)、fitc 标记的黄曲霉毒 素 b1 单克隆抗体、hrp 标记的黄曲霉毒素 b1 (北京科美生物技术有限公司提供);pbst 洗涤液(0.05mol/l pbs, 含 0.05% tween-20), 分析缓冲液(0.05 mol/l 的 pbs 缓冲溶液, ph 7.4, 含 2.0%bsa、0.5 %的水解明胶、0.1%的 proclin-300); 发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液); 其他试剂均为 ar 级;实验用水为二次蒸馏水.度为 2.5 mg/ml 的溶液 a;取溶液 a 400 l 加 1300l 甲醇, 300 l 水, 配成 2 ml 0.5mg/ml 的溶液 b;取溶液 b 50 l 加 50%的甲醇水溶液 2.45 ml, 配成2.5 ml 10 g/ml 的溶液 c; 取溶液 c 200 l, 加 0.18 ml 甲醇, 1.62 ml 水, 配成 2 ml 1 g/ml 的溶液 d.取溶液 d, 用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制100、10、5、1.5、0.5l、0.15、0.05 ng/ml 的 afb1标准溶液, 4 保存.afb1-bsa-hrp 溶液的配制: 取 afb1-bsa- hrp 溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的 afb1-bsa-hrp 溶液,4 保存. fitc-afb1 单克隆抗体溶液的配制: 取fitc-afb1 单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制 1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的 fitc-afb1 单克隆抗体溶液, 4 保存.2.3数据处理通过测量标准品和样品溶液的发光强度(rlu), 使用 flashn glow lb955 发光分析仪自带软件中的数 据处理程序对测得的数据进行处理. 线性方程采用 的是 logit(y)-log(x)的线性回归数学模型, 以 logity 为 纵坐标 , logx 为横坐标 , 其线性方 程表达式为 2.2afb1 标准溶液、afb1-bsa-hrp 溶液、fitc-afb1 单克隆抗体溶液的配制afb1 标准溶液的配制: 取黄曲霉毒素 b1 标准品5 mg (瓶装规格为 5 mg), 加甲醇 2 ml 溶解, 配成浓1178中国科学: 化学2011 年 第 41 卷 第 7 期logit(y) = a + blog(x), 线性方程中 x 为标准品(或待管中加入 afb1-bsa-hrp 溶液 50 l; s0 管中加分析缓冲液 50 l, s1s5 管中加 0.05、0.15、0.5、1.5 和 5 ng/ml 的 afb1 标准溶液 50 l, 样品 111 管中 加 1 号至 11 号样品提取液 50 l, 混匀后于每支试管中加入 fitc-afb1 单克隆抗体溶液 50 l, 37 水浴加热 60 min. (2)在每支试管中加入抗 fitc 包被的 磁微粒(5 mg/ml)50 l , 37 水浴加热 10 min. (3)试管置于磁性分离器上, 磁微粒沉于试管底部, 倾去溶液, 试管脱离磁分离器, 振摇试管, 每管中加入 600l pbst 洗涤液, 试管再次置于磁性分离器上, 磁微 粒沉于试管底部, 倾去溶液, 如此洗涤 5 次, 每次需将试管静置在磁分离器上 3 min, 使磁微粒沉降完全. (4)在每支试管中加入 300 l 发光底物(发光底物 a 为鲁米诺和对碘苯酚溶液, b 为过氧化氢溶液, 用时需等体积混合), 37 水浴加热 10 min. (5)擦干试管外 壁的水, 置于冷光分析仪中, 测定发光强度(rlu),经线性拟合, 进行定量分析(包括灵敏度、线性范围和检出限等).测样品 ) 溶液的浓度 , log it(y ) = ln( y ) ,y = b ,1 yb0式中, b 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, b0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强 度. 根据标准品的浓度和发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品的发光强度值得样品的浓度.2.4 玉米样品的采集和处理从市场随机购买 11 份玉米样品, 处理方法是:粉碎玉米成玉米粉, 过 20 目筛后, 分别称取 2 g 置于10 ml 具塞玻璃瓶中, 加 20%的乙醇溶液 4 ml, 盖塞 后, 旋涡混合 1 min, 150 r/min 振荡 30 min, 再旋涡混 合 1 min, 转入离心管中, 4000 r/min 离心 15 min, 取上层清液, 4 保存备用. 使用时与分析缓冲液等体积混和.2.5玉米样品中 afb1 含量的分析过程玉米样品中 afb1 含量的分析过程如图 2 所示.3结果与讨论3.1fitc-afb1 单克隆抗体稀释浓度的优化按图 2 的分析过程和条件, afb1-bsa-hrp 的 稀释度为 1:2000, fitc-afb1 单克隆抗体稀释浓度 分别为 1:1000、1:2000、1:5000、1:10000 和 1:12000 时测定 b0、b1 和 b5 的数值, b0 为加入分析缓冲液 时的发光强度(rlu), b1 和 b5 分别为加入 0.05、5 ng/ml afb1 标准溶液时的发光强度(rlu), 实验结 果见表 1, 从 b/b0 的比值看, 反映了在标准品抗原存 在下, 酶标抗原与抗体的结合率, 由于本实验采用的 是竞争法, 酶标抗原与标准品抗原竞争抗体, 标准品 抗原浓度越大, 结合到抗体上的酶标抗原越少, 发光 强度越小, b/b0 值越小, 反之则越大. 为确保标准曲 线上每个浓度点的结合率之间有足够的落差. 保证 检测的灵敏度和准确度, 从结果分析, 选择 1:12000 的 fitc-afb1 单克隆抗体和 1:2000 的 afb1-bsa- hrp 较为合适.(1)取试管 17 支,编号为 s0、s1s5,样品 111,每3.2磁微粒加入量的优化按图 2 的分析过程, 加入分析缓冲液、1:2000 的 afb1-bsa-hrp 和 1:12000 的 fitc-afb1 单克 隆抗体, 使之发生免疫反应, 在其他条件不变时, 加图 2 磁微粒化学发光免疫分析法测定黄曲霉毒素 b1 的分析过程示意图1179郑国金等: 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素 b1表 1 fitc-afb1 单克隆抗体稀释浓度的优化发光强度(rlu)b/b0 值fitc-afb1 单克隆抗体afb1-bsa-hrpb0b1b5b1/b0b5/b01:10001:20001:50001:100001:20001:20001:20001:200098063543277335146822733295600941589832969320247850510213312496108529110.970.960.940.890.510.310.270.22 1:12000 1:2000 175519 152232 27086 0.87 0.15 入抗 fitc 抗体包被的磁微粒(5 mg/ml)的体积 10150 l, 加入量与发光强度(rlu)的关系见图 3 所示, afb1 测定实验中加入量为 50 l.强度随时间的增加而增大; 60 min 后, 变化不大.afb1 测定实验中温育时间选择为 60 min.1:12000 的 fitc-afb1 单克隆抗体 50l 和1:2000 的 afb1-bsa-hrp 50 l 在 37 均相体系中温育 60 min 后, 加入 50 l 的抗 fitc 抗体包被的磁 微粒(5 mg/ml), 37 温育时间 060 min, 对发光强度的影响情况见图 5 所示, 发现 1030 min 内体系发光强度变化不大, 计数值能够满足发光实验要求, 为 节约时间实验中选择温育时间为 10 min.按图 2 的分析过程, 辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 b1 与异硫氰酸荧光素(fitc)标记的黄曲霉毒 素 b1 单克隆抗体在均相体系中反生免疫反应, 再加入抗 fitc 抗体包被的磁微粒作分离剂, 温育反应后抗原抗体复合物结合在磁微粒上, 在磁场中经分 离、洗涤, 加入发光底物, 37 温育时间 030 min,对发光强度(rlu)的影响情况见图 6 所示, 1015 min期间达到最大值, afb1 测定实验中温育时间选择为10 min.3.3温育时间的优化按图 2 的分析过程, 加入分析缓冲液、1:2000 的 afb1-bsa-hrp 和 1:12000 的 fitc-afb1 单克隆 抗体溶液, 使之在 37 的均相体系中发生免疫反应, 在其他条件不变时, 温育时间 0100 min, 对发光强度的影响情况见图 4 所示, 060 min 时间段内,发光3.4影响发光强度(rlu)和测定结果的其他因素免疫反应、化学发光反应的温度对发光强度(rlu)有影响, 37 温育能缩短反应达平衡的时间.图 3 磁微粒的量对发光强度的影响图 4 fitc-afb1 单克隆抗体和 afb1-bsa-hrp 温育反应时间与发光强度的关系图 5 加抗 fitc 包被的磁微粒后温育反应时间与发光强度的关系1180中国科学: 化学2011 年 第 41 卷 第 7 期3.6 检测限在最佳反应条件下, afb1 标准品浓度为 0 ng/ml 时, 平行测定 10 管的发光强度(rlu), 发光强度(rlu) 值分别为: 140511、143734、141831、142024、142262、140913、144663、140592、142873、141831; 计算平均值为: 142123; 标准偏差(sd)为: 1342, 发光平均值 减去两倍标准偏差后的值为: 139439; 代入线性回归 方程: logit(y) = 0.20612.1655log(x), 所得浓度即为方法的检测限, 该方法的检测限为 0.02 ng/ml.3.7回收率在待测定的玉米粉样品 1 和玉米粉样品 2 中加入 已知量的 afb1, 经 20%的乙醇提取后, 按图 2 的分 析过程, 测定提取液中 afb1 的含量, 并与已知量相 比较, 其结果用样品加标回收率表示. 反映了该分析 方法的可靠性, 分析方法和结果见表 2 所示, 样品加 标回收率范围为 94.7%109%.图 6 加入发光底物后温育反应时间与发光强度的关系洗涤磁微粒时, 洗涤次数, 洗涤剂用量和磁微粒沉降时间, 对测定精密度有影响, 洗涤 5 次, 洗涤剂用量600 l, 磁微粒沉降时间 3 min, 测定的精密度好.3.5标准曲线在最佳反应条件下, afb1 标准品浓度分别为 0、0.05、0.15、0.5、1.5、5 ng/ml, 以 logity 对 logx 作 图, 得线性回归方程: logit(y) = 0.20612.1655log(x),3.8精密度按 2.4 的方法提取 1 号、2 号和 3 号玉米样品中 的 afb1, 提取液用分析缓冲液等体积稀释后进行分 析, 每次每个样品做 10 管平行, 连续测定 2 次, 分别 计算批内变异和批间变异. 批内相对标准偏差小于9%, 批间相对标准偏差小于 15%. 如表 3 所示.线性相关系数 r = 0.9955,ng/ml, 可用于准确定量分析.标准曲线如图 7 所示.线 性范围 为 : 0.055数据处理原理见稀释实验按 2.4 节的方法提取1 号玉米样品, 提取液与分析 缓冲液等体积混后, 再用分析缓冲液倍比稀释, 得到 稀释度分别为 1、1/2、1/4 和 1/8 的样品, 按图 2 的分 析过程测定 afb1 含量, 以稀释度作为 x 轴, 样品中图 7 标准曲线表 2 样品加标回收率编号样 1a样 1b样 1c样 2a样 2b样 2c样品质量(g)100 ng/ml afb1 标液(l) 加标量(ng) 加标后样品的处理提取方法 提取样品的处理加标浓度(ng/ml)加标后测得值(ng/ml) 未加标测得值(ng/ml) 差值(ng/ml) 样品加标回收率1121.216061120121121.2160611201240风干 2 h, 混匀, 加提取剂 20%的乙醇 2 ml盖塞后, 旋涡混合 1 min, 150 r/min 振荡 30 min, 再旋涡混合 1 min, 转入试管中 4000 r/min离心 15 min,取上层清液, 加等体积的分析缓冲液0.31.351.030.321071.52.451.031.4294.734.041.033.011000.30.950.640.311041.5110133.900.643.261091181郑国金等: 管式磁微粒化学发光免疫分析法测定玉米样品中的黄曲霉毒素 b1表 3 化学发光检测 afb1 的精密度批内批间样品123123平行管数测得 afb1 浓度(ng/ml)相对标准偏差 rsd(%)101.147%100.959%100.688%100.648%100.748%100.537%201.0413%200.662%200.6315%afb1 含量测值为 y 轴作图,得关系曲线见图 8 所示.表 4 玉米样品中 afb1 的测定结果所得曲线的拟合直线方程 y = 1.4602x0.0570,样品编号c(ng/ml)abfx(ng /g)线形相关系数干扰.r = 0.9993. 分析缓冲液对样品分析无123456789101.020.620.520.410.850.360.630.250.470.052.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.002.000.390.390.390.390.390.390.390.390.390.3910.466.365.334.218.723.696.462.564.820.513.10玉米样品中 afb1 的测定结果从市场随机购买的 11 份玉米样品, 按 2.4 节的方法提取处理, 按 2.5 节的分析过程进行测定,afb1 的计算方法为:样品中x = abc 11 0.32 2.00 2.00 0.39 3.28 f式中: x玉米样品中 afb1 的含量, ng/g; c待测溶液中 afb1 的浓度, ng/ml; a每克玉米样品中加入提取剂的体积, ml/g定玉米样品中黄曲霉毒素 b1 的方法. 最佳反应条件为: 50 l 的 afb1 标准品(或待测样品)溶液与 50 l稀释度为 1:2000 的辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒 素 b1 混合, 加入 50 l 稀释度为 1:12000 的异硫氰酸荧光素(fitc)标记的黄曲霉毒素 b1 单克隆抗体,在 37 的均相体系中发生竞争性免疫反应 60 min,再加入 50 l 抗 fitc 抗体包被的磁微粒(5 mg/ml),37 温育反应 10 min, 抗原抗体复合物结合在磁微 粒上, 在磁场中分离磁微粒, 加入 600 l pbst 洗涤液, 洗涤 5 次, 洗涤后加发光底物 300 l, 37 温育反应 10 min, 检测发光强度. 根据标准品溶液的发光 强度, 作出标准曲线, 根据待测溶液的发光强度, 确定待测溶液中黄曲霉毒素 b1 的含量. 实验结果表明,此方法: 标准曲线线性范围为 0.055 ng/ml, 检出限 为 0.02 ng/ml, 具有很高的灵敏度, 批内相对标准偏差小于 9%, 批间相对标准偏差小于 15%, 具有良好的稳定性和重现性.b每毫升提取液与加入的体积之和, ml/ml;f提取剂的提取率;测定结果见表 4 所示.缓冲液的pbs-bsa4结论开发了一种管式磁微粒化学发光免疫分析法测图 8 稀释度与样品浓度的关系本工作得到国家高技术研究发展计划(863 计划) (sq2010aa0220249001)资助, 特此致谢.致谢参考文献 1 tan y, chu x, shen gl, yu rq. a signal-amplified electrochemical immunosensor for aflatoxin b1 determination in rice. anal biochem,2009, 387: 82861182中国科学: 化学2011 年 第 41 卷 第 7 期2hajianr, ensafi aa. determination of aflatoxins b1 and b2 by adsorptive cathodic stripping voltammetry in groundnut. food chem, 2009,115: 10341037nagwa hs. ammida lm, palleschi g. electrochemical immunosensor for determination of aflatoxin b1 in barley. anal chim acta, 2004,520: 159164piermarini s, micheli l, ammida nhs, palleschi g, moscone d. electrochemical immunosensor array using a 96-well screen-printed microplate for aflatoxin b1 detection. biosen bioelec, 2007, 22: 14341440wejdan sk, bahruddin s, chew by, nor hh. determination of aflatoxins in animal feeds by hplc with multifunctional column clean-up.food chem, 2010, 118: 882886tan a, rosel mg l, guardino x. use of high-performance liquid chromatography to assess airborne mycotoxins aflatoxins and ochratoxina. j chromatogr a, 2004, 1047: 235240anders k, barbro a, kurt a. immunoaffinity column clean-up for the high-performance liquid chromatographic determination of aflatoxinsb1, b2, g1, g2, m1 and q1 in urine. j chromatogr b, 1995, 672: 253259quinto m, spadaccino g, palermo c, centonze d. determination of aflatoxins in cereal flours by solid-phase microextraction coupled with liquid chromatography and post-column photochemical derivatization-fluorescence detection. j chromatogr a, 2009, 1216: 86368641li pw, zhang q, zhang w. immunoassays for aflatoxins. trends anal chem, 2009, 28: 11151127debjani s, debopam a, dipika r, dilip s, tarun kd. simultaneous enzyme immunoassay for the screening of aflatoxin b1 and ochratoxina in chili samples. anal chim acta, 2007, 584: 343349sun xl, zhao xl, tang j, jun z, chu fs. preparation of gold-labeled antibody probe and its use in immunochromatography assay for detection of aflatoxin b1. int j food microbiol, 2005, 99: 18519434567891011development of a sensitive magnetic particles chemiluminescenceenzyme immunoassay for determination of aflatoxin b1 in cornzheng guojin1,2, chen hui2, ying xitang3, hu guomao3 & lin jin-ming11 department of chemistry, tsinghua university, beijing 100084, china2 department of chemistry, chuxiong medical college, chuxiong 675000, china3 beijing chemclin