（生物医学工程专业论文）单分子水平上的量子点荧光性质和生物芯片研究.pdf

单分子水平上的量子点荧光性质和生物：苍片研究 a b s t r a c t s i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o n ( s m d ) i so n eo ft h eh i g h e s ts e n s i t i v et e c h n i q u e s i t c a nb eu s e dt os t u d yo nt h ea c t i v i t yo fs i n g l em o l e c u l e sa n di ti st h el a s tm i l e s t o n ei n t h ef i l e do fd e t e c t i n gm i n u t es a m p l e c o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lf l u o r e s c e n c ed y e s ， q u a n t u md o t s ( q d s ) ，a sf l u o r e s c e n c el a b e l s ，h a v em a n ye x c e l l e n to p t i c a lp r o p e r t i e s i t h a sb e e np l a y i n gi m p o r t a n tr o l e si nt h ef i e l d so fm o l e c u l a rb i o l o g y , c e l lb i o l o g y , m e d i c i n e ，e t c s t u d yo nt h ep r o p e r t i e so fs i n g l eq u a n t u md o t sc a np r o v i d eam e n t a l i t y t oi m p r o v et h ep r o p e r t i e so fq u a n t u md o t s ，a n dc o n t r i b u t et oab e t t e ra p p l i c a t i o no f q d si nv a r i o u sf i e l d s ，s u c ha s ，t h ea p p l i c a t i o no fm i c r o a r r a ya ts i n g l em o l e c u l e sl e v e l t o w a r dm i n u t e s a m p l ea n dl o wa b u n d a n tg e n ee x p r e s s i o n ，t r a d i t i o n a lm i c r o a r r a y r e q u i r e ss a m p l ea m p l i f i c a t i o n h o w e v e r , m i c r o a r r a ya ts i n g l em o l e c u l e sl e v e l ，w h i c h d o e s n tn e e ds a m p l ea m p l i f i c a t i o n ，c a l lf u t h e ri m p r o v et h es e n s i t i v i t ya n dq u a n t i t a t i v e a c c u r a c yo fg e n ec h i p t h i st h e s i ss t u d i e dt h ep r o p e r t i e sd i f f e r e n c eo fq d si nw a t e r a i r a n dq u a n t i t a t i v em e t h o do nm i c r o a r r a yc h i pa ts i n g l em o l e c u l e sl e v e l t h em a i nw o r k w e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ep r o p e r t i e sd i f f e r e n c eo fs i n g l eq u a n t u md o t sa tl i q u i d - s o l i di n t e r f a c ea n d g a s - s o l i di n t e r f a c e f o rt h eq da t l i q u i d - s o l i di n t e r f a c e ( i nw a t e r , f o rs h o r t ：w e ts a m p l e ) a n d g a s - s o l i di n t e r f a c e ( i na i r , f o rs h o r t ：d r ys a m p l e ) ，w es t u d i e do nf i v ep h e n o m e n o n si n t h eb l e a c h i n g ，b r i g h t e n i n g ，b l i n k i n g ，b l u i n ga n df l u o r e s c e n c el i f e t i m e c o m p a r e dw i t ht h ew e ts a m p l ei np r o p e r t i e s ，w ef o u n dt h ed r ys a m p l es h o w e d h i g h e rr e s i s t a n c eb l e a c h i n g ；h i g h e rf l u o r e s c e n ei n t e n s i t y ；s h o r t e rf l u o r e s c e n el i f e t i m e a n dl o w e rf r e q u e n c yo fb l i n k i n g ，t h a ti st os a y , t h ep o w e r - l a wd i s t r i b u t i o ne x p o n e n t i a l ( a o f f a o n ) i nd r ys a m p l ei ss m a l l e rt h a nt h a ti nw e ts a m p l e t h eb l u e s h i f tw a v e l e n g t h a n dr a t eo fd r ys a m p l ei ss m a l l e rt h a nw e ts a m p l e s c o m p a r e dw i t hq d 5 8 5 ，t h er a t eo f b l u e s h i f ti nq d 5 2 5 q d 6 5 5i sm o r e w i t ht h ei n c r e a s eo ft h eq ds i z e ，t h ea b s o l u t e v a l u eo fb l u e s h i f tw a v e l e n g t hi so nt h er i s e 2 q u a n t i t a t i v em e t h o do nm i c r o a r r a yc h i pa tt h es i n g l em o l e c u l e sl e v e l as i n g l em o l e c u l e sc o u n t i n gm e t h o dw a sd e v e l o p e dt o q u a n t i t a t i v e l ya n a l y z e m i r n ae x p r e s s i o no nam i c r o a r r a yc h i p ，i nw h i c ha g e n e r a lf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e e x c i t e dw i t ham e r c u r yl a m pa n da ne l e c t r o n m u l t i p l i e dc c dw e r eu s e d a f t e r c o n s i d e r i n gm o l e c u l en u m b e r si ne a c hh y b r i d i z es p o tb yt r a c k i n gt h ep h o t o b l e a c h i n g l l i 硕士学位论文 s t e p s ，t h em o l e c u l ed e n s i t yw a sc a l c u l a t e d t h ec o m p a r e dr e s u l t so fm o l e c u l ed e n s i t y a n df l u o r e s c e n c es i g n a lo fc o m m e r c i a lp l a t f o r mi n d i c a t e do u rs i n g l em o l e c u l e s q u a n t i t a t i v em e t h o dw a sf e a s i b l ef o rm i c r o a r r a yc h i pa n da b e t t e rl i m i to fd e t e c t i o nc a n b eo b t a i n e d k e yw o r d s ：s i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o n ；p h o t o p r o p e r t i e s o f q u a n t u md o t s ； m i c r o a r r a yc h i p i v 硕上学位论文 第1 章绪论 常规系综测量所表示的是由一种或多种对象组成的一个整体所表现出来的平 均效应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而相比之下，达到了分 子检测灵敏度极限的单分子检测( s i n g l em o l e c u l e sd e t e c t i o n ，s m d ) 就可做到对体 系中单个分子的行为进行研究，可以得到在特定时刻，特定分子的特殊位置和行 为，能够对异质群体中的单个分子进行观察、鉴定和分类、能提供直接的生物大 分子的结构和功能之间关系的信息。s m d 为分析化学开辟了一个新的领域，将分 析化学推向了灵敏度的极限，在化学，生物，医学，纳米材料等领域已取得了惊 人的进展，也为分子世界打开了一个崭新的景象【l l 。 目前，单分子检测的研究方法按原理不同可分为以下几类：基于光学的显微 技术和光谱技术，包括宽场荧光显微镜( f a r f i e l df l u o r e s c e n c em i c r o s c o p y ) 、近场 扫描光学显微镜( n e a r - f i e l ds c a n n i n go p t i c a lm i c r o s c o p e ，n s o m ) 、表面增强拉曼 光谱( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 、光镊技术( o p t i c a lt w e e z e r ) 等； 基于电学或力学的扫描探针显微技术，包括扫描隧道显微镜( s c a n n i gt u n n e l m i c r o s c o p y ，s t m ) 、原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 等；基于化 学反应的检测技术，包括包括电化学检测( s m e d ) 、化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 检测等【z j 。这些方法实现单分子检测的共同优点在于：一、空间分辨率高；二、 能捕捉单分子的性质和行为；三、能收集微弱信号且放大检测，并做相应的分析 处理以获取准确的信息。 单分子宽场荧光成像是单分子检测方法中最常见，也是最简便的方法之一。 此方法是通过对研究目标物进行荧光标记，然后检测荧光信号来进行单分子检测 的一种方法。该方法以其高通量、实时追踪的特点逐渐成为单分子检测的主流技 术。自从1 9 7 6 年h i r s c h f e l d 3 】首次实现了多染料标记的单分子荧光检测后，这一 技术为越来越多的科研工作者所青睐。近年来发展起来的半导体量子点，是一种 有望代替传统有机染料的荧光标记物，已成为近期一个研究热点。与传统的有机 荧光染料相比，量子点具有许多优良的光学特性。作为一种荧光标记物，已广泛 应用于多个领域。上世纪9 0 年代发展起来的生物芯片为生物医学提供了海量数据， 科学家们发现同种样品，不同的实验平台得到的实验数据不尽相同，为了提高数 据的可靠性，单分子水平上的微阵列生物芯片由此应运而生。 本章主要对量子点的光学特性，单分子宽场荧光成像及单分子生物芯片作简 要的综述。 单分子水甲上的量子点荧光性质和生物芯片研究 1 1 量子点的基本特性 1 1 1 量子点的概述 自2 0 世纪7 0 年代末，半导体纳米材料以其独特的光学性质引起了物理学家、 化学家，材料学家以及电子学家们广泛的研究兴趣，其中研究最多的就是半导体 量子点。 量子点一般由i i b 和a 族( 如c d s e 、c d t e 、c d s 、z n s e 等) 或i a 和v a 族( 如 i n p 、i n a s 等) 元素组成【4 7 1 。其半径2 8n m 8 枷】，小于或接近激子波尔半径，量子 点内的载流子( 电子，空穴) 的运动处于强受限的状态，其径越小，能隙越大， 光吸收和发射能量越高。这种量子限域效应导致量子点产生非线性光学响应，引 起尺寸效应【1 1 1 、介电限域效应、表面效应【1 2 】等，从而派生出不同于宏观体系的低 维度物性，表现出自身独特的物理化学性质。量子点的早期研究主要集中在光学 物理性质、纳米结构以及在微电子学和光电子学中的应用【4 】。在生物学中的应用， 最早见于1 9 9 6 年m a h t a b 等人【1 3 】对蛋白质的检测。1 9 9 8 年，两个研究小组分别报道 了量子点作为荧光标记试剂应用于活细胞或固定细胞【1 4 l5 1 ，初步解决了量子点的 水溶与生物相容性；自2 0 0 0 年后，量子点就用于生物医学领域就以指数形式迅速 增a n 引。近年来，量子点在荧光探针的识别和成像方面取得了重大的突破，如生物 大分子之间的相互作用、细胞及组织的单色和多色标记、生物体组织和在体光学 成像、基因测序等。 在系综层面上作为荧光标记物，与常规的有机荧光染料相比，量子点有如下 优势【1 6 】：( 1 ) 吸收光谱宽，能够在很宽的波长区域被激发产生荧光【4 1 ，因此可用 同一束激发光源激发多种量子点，得到可分辨的发射光谱；( 2 ) 发射光谱窄而对 称，而且可以通过改变量子点的粒径大小，可使相同组成的量子点发射出不同波 长的荧光；( 3 ) 斯托克( s t o k e s ) 位移大9 1 ，吸收光谱与发射光谱容易分开【1 7 】；( 4 ) 量子产率高 7 - 8 】；( 5 ) 光稳定性好，不易光漂白【4 ，9 】等。这使得量子点在生物化 学、分子生物学及细胞生物学等领域获得了广泛应用。 1 1 2 单个量子点的光学特性 近些年，单个量子点的荧光特性研究主要有：荧光间歇( f l u o r e s c e n c e i n t e r m i t t e n c y ) 或称“眨眼( b l i n k i n g ) ”，光谱蓝移( s p e c t r a lb l u i n g ) ，光漂白( p h o t o b l e a c h i n g ) 以及荧光增强( p h o t o l u m i n e s c e n c ee n h a n c e m e n t ) 。这些光学特性对环 境非常灵敏，比如温度【1 8 】，光强对光谱蓝移和光漂白的影响；不同气体，不同溶 剂及p h 值影响荧光的强度和“b l i n k i n g ”等【1 9 】。通常情况下，量子点的光谱蓝移、光 漂白及荧光间歇等特性不利于其作为荧光标记物应用，尤其是单分子检测。科学 家们已在不断尝试如何改善量子点的光学性能。 硕士学位论文 目前，从改善量子点光学特性的研究方式来看，可分为两大类：第一类是根 据环境对单个量子点的影响，寻找能够改善量子点的较优条件及其合理的解释， 同时为量子点的合成提供思路。c o r d e r o 等人【2 0 】比较了不同气体及真空环境下量子 点的量子产率，阐述了极性水分子存在于量子点表面对量子产率影响的可能原因； m y u n g 等人【2 l j 发现氧气对溶解于氯仿中的量子点具有强烈的增强作用；在甲苯溶 剂下，j o n e s 等人【2 2 】发现荧光光谱先发生红移，后才发生蓝移；然而在水溶液中， w a n g 等人【2 3 】并没有发现红移；n a z z a l 等人【2 4 】检测到在p m m a 薄膜上的量子点蓝移 的速率，同时量子点的蓝移幅度在氮气中要比在氧气中小；n i r m a l 等人【2 5 】开启了 量子点“b l i n k i n g ”现象研究的先河；而后h o l l i l g 等人【2 6 】在溶剂中加入巯基乙醇和二 硫苏糖醇抑制量子点的“b l i n k i n g ”；本人【2 7 】所在课题组发现了巯基乙胺能有效的抑 制量子点的“b l i n k i n g ”和光谱蓝移，并能大幅提高量子点的耐漂白性能。通常认为 量子点的光漂白常常伴随着光谱蓝移，量子点的荧光效率与“b l i n k i n g ”相关，但是 光漂白与光谱蓝移之间，量子产率与眨眼之间，以及光漂白与眨眼之间究竟怎样 相互关联，如何相互影响，这些问题至今还没有统一的定论。 第二类是通过改变量子点的结构以及合成量子点的方法，从本质上来改善量 子点的光学特性。量子点的尺寸，结构样式对荧光特性起到决定性的作用。从最 初单纯的核结构到核壳结构，再从不同的核壳结构到壳外包被高聚物结构，量子 点的量子产率及是耐漂白性能较最开始都有较大幅度的改善。不同的核壳结构及 外包高聚物，量子产率也不一样【2 引。u e m a t s u 等人【2 9 】在量子点的核壳结构的外围 沉积一层s i o x 薄膜，当x = 0 6 到1 9 时量子点的量子产率增加近1 0 倍。然而量子点的 “b l i n k i n g ”现象仍然存在。m a h l e r 等人【3 0 】利用晶格错配合成一种新型的带有厚壳的 c d s e c d s 核壳量子点，检测统计有6 8 的量子点不眨眼，为合成 n o b l i n k i n g ”量 子点奠定了基础。最近w 锄g 等人【3 l 】通过模糊量子点的核壳界面，合成出完全不眨 眼的c d z n s e z n s e 量子点，在纳米材料领域，这种量子点合成的实现是一个新的里 程碑。然而它的多个发射峰将影响其成像方面的应用【3 引。上述这些努力或多或少 抑制了量子点某一方面的弱点，但遗憾的是，迄今并没有哪一种合成方法能够同 时消除量子点上述的几个缺陷。 1 2 单分子水平上的荧光成像 1 2 1 分子荧光与量子点荧光的发射原理 1 2 1 1 分子荧光的发射原理 根据分子的电子能级理论，每个分子都具有一系列严格分立的电子能级，而 每一个电子能级中又包含了一系列的振动能级和转动能级，如图1 1 所示。图中 s o 表示基态，s l 和s 2 分别表示第一电子激发单重态和第二电子激发单重态，t l 为 单分子水平上的量子点荧光性质和生物芯片研究 第一电子激发三重态，三重态的能级要比相应的单重态能级略低。当处于分子基 态单重态的一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发态单重态的能级轨道上，也 可能跃迁至能级更高的单重态上。单重态的分子具有抗磁性，其激发态的平均寿 命为l o - 5 1 0 一s ，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命大约为1 0 q l s 以上。处于激发态的分子是不稳定的，通常要以辐射跃迁或非辐射跃迁方式返回 基态，在此过程中，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。 s j n g e te x c i t e ds t | l e s 1 啊p i 醴c z c t t e ds t o l e a 伸幢秘d j a l k i n t e r n l l c o n v 删 v i b 糟t i o n m r e l a x a t i o n i n - - s t e m 栩口酗n 譬 a b j - o 6 0 n r e l “a t i o n n 图1 1 荧光、磷光能级图【3 3 】 在室温下大多数分子均处于基态的最低能级，当分子吸收了和它具有的特征 频率相一致的光辐射后，可被激发到激发态的任一振动能级，这就产生了光的吸 收。被激发的分子快速弛豫到激发态的最低能级，而后又以光的形式弛豫，回到 基态振动能级则产生荧光发射【3 4 1 。显然，荧光的产生是由第一电子激发态的最低 能级开始，而与荧光分子被激发至哪一个能级无关，因此，荧光光谱的形状和激 发态的波长无关。值得指出的是，激发态较高的振动能级通常弛豫跃迁到最低振 动能级的过程中能量以非辐射的形式丢失，使得发射荧光的能量比分子吸收的能 量要小，所以，荧光的特征波长比入射波长要长。同时，分子也可能从单重态系 间跨越到三重态，接着发生快速的振动弛豫到达三重态的最低振动能级，由此激 发态跃迁回基态时，便会发射出磷光。 1 2 1 2 量子点的荧光发射原理 块状半导体的能级为连续的能级，当半导体量子点的颗粒尺寸与其激子的波 尔半径相近时，半导体的载流子( e x c i t i o n ) ( 也称电子空穴对( e l e c t r o n h o l ep a i r ) ) 的运动被限制在一个小尺寸的势阱中，在此条件下，导带( c o n d u c t i v eb a n d ) 和价 ；。一1。 i赡；，1。| ；li p；ilii； 删一一 细 “c 硕上学位论文 带( v a l e n c eb a n d ) 过渡为准分立的类分子能级【3 5 】( 如图1 2 ) 。 半导体量子点的尺寸变得越小，其有效带隙增加，相应吸收光谱的阈值向短 波方向移动【3 6 。3 引。载流子的有效质量越小，电子和空穴能态受到的影响越明显， 吸收的阈值就越向更高光子能量偏移。块状半导体对光的反射能力很强，吸收能 力差，纳米颗粒对光的吸收很强，且呈宽频带强吸收。 图1 2 半导体量子点的发光原理图中实线表示辐射跃迁，虚线表示非辐射跃迁p 9 j 发光是一种物质将吸收的能量，不经过热的阶段，直接转换为特征辐射的现 象。半导体量子点的发光原理如图1 2 所示，当一束光照射到量子点上，吸收光子 后，其价带上的电子跃迁到导带，导带上的电子可以再跃迁回价带而发射光子， 即量子点的发光原理【3 9 1 。量子点发光的过程也就是量子点电子空穴对的复合过 程。导带上的电子也可以落入量子点的表面缺陷( 或称电子陷阱) 中，电子落入 量子点的表面缺陷有以下几种形式：空穴徙动( h o l em i g r a t i o n ) ：俄歇电离( a u g e r i o n i s a t i o n ) 等。当电子落入较深的表面缺陷中时，绝大部分电子以非辐射的形式 而猝灭，只有极少数的电子以光子的形式跃迁回价带或吸收一定能量后又跃迁回 导带，然后跃迁回价带与空穴复合而发光。 从量子点的复合发光途径可知电子空穴的复合途径主要有【4 0 j ：( 1 ) 电子和空 穴直接复合，产生激子态发光；这种复合发光类似于荧光分子发光。( 2 ) 通过表 面缺陷态间接复合发光。量子点表面原子所处的环境有别于内部原子，内部原子 被其他原子所包围，而表面原子只有部分原子与内部原子产生键合，另一部分则 以“悬挂键”形式存在量子点表面，从而形成了许多表面缺陷态【4 。光生载流子以 极快的速度受限于表面缺陷态，受限的载流子只有小部分最后能复合发光。这两 种复合过程相互竞争，共同决定了量子点的发光。其中电子与空穴的直接复合对 量子点的发光最有利。量子点的表面缺陷越严重，捕获电子的能力越强，电子与 空穴的直接复合几率越小，量子点的量子产率越低。通常在合成量子点时，以体 表比( 体积与表面积的比例) 最大的球形为最优选择。 qoil2盘葛屯蛊咨ii 单分子水平上的量子点荧光性质和生物芯片研究 | _ _ l _ i l _ _ _ _ i _ _ l e e e 目| g ! ! = 目= = = = = = 目e 目j e 目自l | e e = 自目e = = = ! = = 目l = 目_ _ e = l l e = = 自目目目| j l _ 目目_ _ 自_ i _ _ _ i 当量子点掺有杂质原子时，电子空穴还可以通过杂质能级复合发光【3 1 1 ，这种 复合发光最近在研究没有“眨眼”现象的量子点时发挥了重要的作用。 1 2 2 宽场单分子单个量子点的荧光成像方法 单分子单个量子点荧光检测形式可分为基本的三种：光子爆发检测，单分子 光谱测绘，单分子成像。光子爆发检测最为简单，直接用光电倍增管( p m t ) 或 雪崩二极管( a p d ) 为检测器进行光子计数。该方法具有较高的信噪比，微秒级 的时间分辨等优点，但不能同时进行多点检测，不能记录指定分子的轨迹。单分 子荧光光谱可在极短的时间内完成，分子无须固定，可以在自由溶液中进行，常 用于高通量筛查疾病标记物的单分子及监控单分子的相互作用。单分子成像可指 示分子在图像中的位置和发光强弱，实时跟踪记录单分子。单分子荧光成像的方 法有很多，包括宽场形式下的落射式荧光显微成像和全内反射荧光显微成像，扫 描形式下的共聚焦荧光显微成像和近场光学扫描成像。下面重点介绍常用的宽场 单分子成像方法。 1 2 2 1 落射式荧光显微成像 就荧光显微镜的光路来分，可分为透射式荧光显微镜和落射式荧光显微镜 ( e p i i l l u m i n a t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ) 。由于透射式荧光显微镜的光路需要 穿过样品，这对样品的要求高，且背景高，限制了其在生物，医学等方面的应用。 而落射式荧光显微镜的光路能克服上述缺点。 落射式荧光显微镜是单分子成像最直接的成像方法。只要配置i c c d ( i n t e n s i f i e dc h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 或e m c c d ( e l e t r o nm u l t i p l y i n gc h a r g e c o u p l e dd e v i c e ) 以及恰当的滤光块组就可以实现单个分子的成像。能快速成像的 e m c c d 提高了检测单个分子的灵敏度，并能实时监测单个分子的运动轨迹1 4 引， 广泛就用于生物医学的各个领域【4 3 1 。由于是宽场成像，落射式荧光显微镜不需要 扫描，就能对样品进行较大范围的成像。但是当观测的样品较厚或者溶液中有运 动辐度较大的分子时，落射式荧光显微镜除了能清楚地检测的焦平面上的样品外， 焦平面以外的样品也能被观察到，这样就降低了信噪比，影响了荧光成像的质量。 一般用于多染料标记的生物大分子或者高量子产率荧光探针的单分子检测。 1 2 2 2 全内反射荧光显微成像 全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ， t i r f m ) ，利用在界面处以指数形式衰减的隐失场激发界面附近近百纳米深度以 内的荧光分子，与普通的荧光显微镜相比，激发体积小，信噪比高。 全内反射现象是生活中一种常见现象。当光从光密介质进入光疏介质时，入 硕士学位论文 射光在光密介质表面上一部分发生反射，另一部分则发生折射进入光疏介质。 入 射角与折射角间满足s n e l l 公式( 1 一1 ) n l s i n 0 i = n 2 s i n 0 2 式中0 l0 2 ，分别表示入射角和折射角，n l ，n 2 分别表示两介质的折射率，n l n 2 。 当入射角0 l 增大到临界角0 c 时，此时0 2 = 9 0 0 ，就会发生全反射。由于波动效应存在， 并沿平行于界面的方向传播，有少量的光能量会穿透界面渗透到光疏介质中，产 生隐失波( e v a n e s c e n tw a v e ) 。该隐失波强度i z 在光疏介质中随界面距离z 以指数关系 衰减，见公式( 1 2 ) 易= l o e x p - z d p 】 ( 1 2 ) 式中厶为逝波在界面的入射光强度，z 为距界面处的距离，磊为入射光减弱到原来 的j 尼时所通过的距离。激发深度磊表达式为： 吒= 凡2 n - 4 n 1 2 s i n 0 - n 2 2 ( 1 3 ) 式中，为入射光波长，n l 和n 2 分别为光密介质与光疏介质的折射率。由于隐失波 衰减速度过快，激发的深度约为l o o n m 以内的界面层里，只能激发在界面层的荧光 分子，界面以外的本体分子没法吸收光子，所以测定区域仅局限于界面层，避免 了来自本体的散射干扰与大量本体的荧光激发，其背景噪音较落射式宽场更低。 它具有高度的界面特异性，提供了一种表面的分析技术。1 9 7 6 年，h i r s e h f i e l d 等人 1 3 j 完成了第一个全内反射荧光实验，也正是他第一次尝试用全内反射荧光法测液体 中的单个分子的荧光；y e u n g 等, k t 1 3 】应用这种成像方式研究了单分子扩散，蛋白分 子固液表面的吸附等；w a t a r a i 等【4 4 l 用全内反射荧光方法，研究了甲苯水界面上罗 丹明的旋转动力学以及卟啉离子衍生物的离子结合吸附；另外，全内反射荧光方 法在c y 3 c a m p 与受体的作用i l 引、考察吸附在石英上的水解酶分子的重定向机制 【4 5 1 、等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动【4 6 1 、聚合物内单个分子的结构变 化【4 7 1 、以及观察细胞膜l o o n m 范围内的实时生命活动【4 8 】等方面有重要的应用。 1 2 3 单个荧光分子与单个量子点的判定 要对单个荧光分子进行光学成像，首先样品的浓度要足够小，目标分子与目 标分子之间能够彼此分开，即在光学成像的分辩率范围内有足够空白区域。其次 要确保单分子的信号大于背景干扰信号。故单分子检测的关键是如何把目标分子 的信号与相邻的以及大量的其他分子发出的背景信号区分开，既要区分其他目标 分子，还要排除来自背景信号的干扰。 如何来分析信号是来自单个荧光分子的信号呢? 有以下几种方法：( 1 ) 同 一激发强度下，同种荧光染料的荧光强度有一饱和值，当被分析的目标荧光团的 单分子水平上的量子点荧光性质和生物芯片研究 值为饱和值的整数倍时，被分析目标荧光团的个数就为该整数；( 2 ) 单个荧光染 料的漂白过程应为单步漂白，如果被分析的荧光团为多步漂白，那么被分析的荧 光团就有多个分子：( 3 ) 检测到的荧光信号的个数或频率应与溶液浓度成线性关 系【1 】；其他可以用来确定检测信号来自单个分子的还有荧光信号的频率应满足自相 关函数等。 针对量子点，除了上述几种方法能判定信号是否来自单个量子点外，还有单 个量子点特有的“b l i n k i n g 现象也可作为一个重要的判定，这是因为单个量子点的 荧光强度随时间的变化会呈现出两条基线，当多个量子点聚集在一起的时候，荧 光强度随时间的变化不在呈现两条基线，而是杂乱的。 1 2 4 单分子水平上的荧光成像应用 1 2 4 1 荧光分子在单分子检测中的应用 单分子检测技术广泛应用于化学，生命科学，医学等重要领域。而单分子荧 光成像技术是一种能够提供实时，可见图像的单分子检测技术。因此，单分子荧 光成像更受关注。在单分子荧光成像领域内，按照成像的体系不同，可分为以下 几种：自由溶液中物质分离与示踪，界面上生物物理化学特性，活细胞内的各种 生物医学机理的研究等。 与毛细管结合起来的单分子荧光成像在物质的分离方面，有着重要的战略地 位。近二十年发展起来的毛细管芯片技术，将单分子水平上的分离不论在理论上， 还是在实际应用中都得已实现。y e u n g 等【4 9 】利用高速i c c d 成像提出了高通量单 分子电泳的方法，并建立了多帧法，条纹法，多点法三种测量单分子电泳淌度的 方法。另外，他们还利用微分干涉显微镜直接观察a , d n a 的方法【5 们，证实了嵌入 式染料y o y o 1 的加入影响d n a 分子的迁移淌度。在自由溶液中的单分子示踪的 研究，由于分子的扩散速度过快，现有的仪器在时间和空间上都不足以实时跟踪 单个分子的运动行为。增加研究体系的粘度有助于实时跟踪单分子的运动。当然， 细胞体系中，粘度要比自由溶液中小得多，在细胞体系中，进行单个分子的示踪， 单从跟踪速度来看，要容易。 界面单分子的研究，是指在单分子水平上对分子在各种不同的界面上的吸附 与解吸附，扩散，内吞与外包，界面分子的构象变化等各种动力学行为进行表征， 并探究其原因与机理的一种单分子检测的方法。k a n g 5 1 】等用t i r f m 检测了单个 藻红蛋白在水硅界面的吸附性质，发现当溶液的p h 值高于藻红蛋白的等电点时， 单个蛋白分子做自由运动，在等电点附近时，大部分蛋白分子被吸附到界面上， 而当p h 值降到等电点以下时，蛋白分子最终全部都被吸附到界面上，并发生聚合。 e w i n g 等应用荧光成像和电化学检测相结合，研究人工合成细胞及囊胞胞吐释放 过程【5 2 彤】。最近，l i 等【5 4 】人使用普通荧光显微镜进行了单分子成像，对牛血清白 硕上学位论文 蛋白和溶菌酶两种蛋白在亲水的玻璃和疏水的p d m s 表面的覆盖率进行了统计研 究，并对各自的吸附机理进行了分析。细胞膜表面是生化反应，物质运输，信号 转导等多种功能集中的区域，对细胞膜表面的各种生物物理现象的研究有着十分 重要的作用。s t a r t 等人应用全内反射荧光显微术与荧光相关光谱连用的方法，深 入研究了脂质双层膜表面，不同p h 值和离子强度下，荧光标记的单克隆i g g 扩散 系数与各局部蛋白浓度【5 5 。 与自由溶液中、界面上较纯的环境相比，细胞内有许多生物分子和荧光物质， 环境要复杂，单分子荧光成像要难得多。然而细胞内的单分子荧光成像，有助于 推动生物医学进一步发展，是单分子检测的最终目标。2 0 世纪8 0 年代，细胞内特 异蛋白的荧光成像研究技术已经成为了实验室内比较实用的方法。x i e 等【5 6 】人将 荧光蛋白与膜锚定蛋白的基因融合，在抑制表达的情况下，观测了细胞内单个荧 光蛋白的光强随时间变化的情况。n i e 等【57 j 用共聚焦荧光显微镜探测活细胞 ( h e l a ) 摄入四甲基若丹明标记的铁传递蛋白单分子。2 0 0 1 年，s e i s e n b e r g e r 等【5 3 j 首次实时监测了单个病毒对细胞感染过程，为在细胞内的单分子示踪奠定了基础。 全内反射荧光显微镜提供了一种非常接近表面的成像方法，是一种研究活细胞黏 合与迁移的理想方法。a l m e r s 等1 5 9 】用t i r f m 获得活细胞吞噬肌动蛋白动力学规 律。g o u l i n 等对猴的肾表皮细胞中的跟踪单个藻红蛋白分子的运动，观察了单个 分子在细胞质、细胞核中的扩散行为【6 0 1 。s a k o 等【6 l 】用荧光染料c y 3 标记人表皮细 胞( a 4 3 1 ) 的表皮生长因子( e g f ) ，e g f 是小肽激素，可诱导细胞增殖。现已有多种 方法来解决细胞内单分子荧光成像难等问题，在此不赘述。 1 2 4 2 量子点在单分子检测中的应用 量子点作为一种荧光标记物，几乎可以替代传统荧光标记物应用于单分子的 检测体系中。与传统的荧光标记物相比，具有更耐漂白，量子产率更高，亮度更 强等优点的量子点，是单分子荧光成像的较理想标记物。1 9 9 8 年，b r u c h e z 1 4 】和 n i e t l 5 】两个小组分别发表了量子点作为生物探针并适用于生物分析的突破性的论 文。c o u r t y 等人【6 2 】以量子点标记驱动蛋白马达分子，依据已标记的量子点将做定 向运动与做布朗运动的未标记量子点相区分。c l a p p 等人【6 3 】以量子点为供体，有机 荧光染料为受体，研究了两种结构下的荧光共振能量转移现象。s a r k a r 等人【6 4 l 将 量子点连接到人血清白蛋白上，通过观察量子点与人血清白蛋白t r p 2 1 4 基团间的 f r e t 现象来研究蛋白结构的变化。但是量子点作为标记的主要缺点可能是毒性高 及体积过大造成的空间，科学家们正在为解决这个问题而努力。 基于1 1 2 中所述量子点的特殊的光学性质，量子点能够在光学成像衍射极限 的突破，多种金属离子的检测等方面，有着其它染料无法比拟的优势。 光学显微成像的分辨率在2 0 0 n m 左右，为了揭示纳米尺度的动态和结构特征， 单分子水平上的量子点荧光性质和生物芯片研究 提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求。在远场荧光显微镜的基础 上，科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨极限的成像技术。 而量子点特有的“b l i n k i n g ”现象为科学家提供了一种突破光学成像衍射极限的方 法。2 0 0 5 年，l i d k e 等【6 5 j 人巧妙地利用量子点的“b l i n k i n g ”现象使分辨率达到了 i 3 0 n m 。随后l a g e r h o l m 等【6 6 1 将其应用于生物学上d n a 的长度测量，成功的使分辨率 达到了 1 0n l l l 。另外，单颜色光激发不同尺寸量子点得到多颜色发射光，可为量 子点在突破光学成像衍射极限方面提供一种全新的成像思路。 i s a r o v 和c h r y s o c h o o s 6 7 j 第一次报道了金属离子与纳米量子点相互作用，发现 c u 2 + 离子会导致量子点荧光猝灭。认为可能是由于铜离子的存在引起电子空穴 非辐射猝灭，为应用量子点作为各种离子的荧光探针奠定了基础。基于该原理， 在2 0 0 2 年z e e vr o x e n z w e i g 等【6 8 】人率先实现了对金属离子的测定。z h u 等【6 9 】发现在 过量半胱氨酸存在下，a g + 能增敏l 一半胱氨酸- - c d s 的荧光。据此建立了一种高 灵敏、高选择性的测定银离子的方法。l i 等【7 0 】采用一种新的修饰剂l 一肉毒碱 ( l c a m i t i n e ) 合成了核壳结构的c d s e z n s 纳米量子点，同时他们发现c d 2 + 能与量 子点表面的l 一肉毒碱发生作用，导致量子点的荧光增强，据此可应用于c d 2 + 的检 测。 1 3 单分子微阵列芯片 1 3 1 微阵列芯片概述 微阵列芯片是2 0 世纪9 0 年代发展起来的一种检测型生物芯片，它通过平面 微细加工技术，在很小的平面固体表面上有序地排列成千上万的生物识别功能的 分子探针点阵，形成可寻址的探针微阵列。广泛应用于生命科学的各个领域，如基 因发现、基因表达谱分析、突变检测、杂交测序及表达与调控、药物筛选、疾病 早期诊断等研究。根据不同表达水平可分为：d n a 芯片( 基因芯片) ，蛋白芯片， 组织芯片，细胞芯片。 d n a 芯片是在表面上组装了多种已知序列的核酸的固体基片。通常由单链组 成探针阵列，通过与细胞或组织中提取的核酸杂交，实现基因信息的检测，是基 因表达水平上的一种芯片。基因芯片虽然还存在这样和那样的问题，但其在基因 表达谱分析，基因诊断，药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现了广阔的应用前 景。 蛋白芯片是芯片固体基片上固定的是肽或蛋白，是蛋白表达水平上的一种芯 片。利用蛋白质间的亲和作用，对样品中存在的特定蛋白质分子进行检测。在生 物体内，核酸分子通常是机体存储，传递信息和机体应激反应信息的载体，而最 终具有执行功能的基本是核酸所表达出的各种功能，结构，数量不尽相同的蛋白 硕i ：学位论文 质。所以，对蛋白质的直接检测和鉴定对于生物体自身性质和变化状况的研究而 言，是最具有说服力的【_ 7 1 】。蛋白质芯片是继基因芯片之后的又一热点。随着蛋白 质芯片的日臻成熟，必将大力推动蛋白质组学的发展。 组织芯片是将数百个组织片按预先设计的需要在某种载体上排列成矩阵的微 缩组织切片，是组织水平上的一种芯片。组织芯片主要用于不同组织中分子靶点 的高通量筛选和定位，研究分子的组织特性，是微观与宏观的桥梁。 细胞芯片研究的相对较少，比较典型的研究是z l a u d d i n 7 2 】在芯片上将不同的质 粒转染细胞，从而由不同性状细胞组成的细胞微阵列芯片。另外还有一种就是神 经生物芯片，因研究对象是神经细胞而得名。 1 3 2 微阵列芯片上的标记物 传统的微阵列生物芯片标记物主要为有机荧光染料，其中c y 3 与c y 5 最为常 见，也是应用最多的两种有机荧光染料【7 3 1 。这些有机染料主要的缺点是容易漂白 或淬灭，很大程度上减少了实验的可操作性。另外，它们的宽发射峰，导致检测 信号的交叉，降低了检测的灵敏度。近些年，纳米颗粒( 包括稀土络合物，贵金 属颗粒，半导体量子点) 因其特有的优点，也逐渐成为