RNA病毒内部核糖体进入位点IRES研究进展.docx

rna病毒内部核糖体进入位点(ii迮s)研究进展赵晔张靖溥 (北京协和医学院研究生院、中国医学科学院医药生物技术研究所，北京100050)摘要：mrna翻译的起动有两种机制：帽结构依赖性的翻译和ires(internal ribosome entry sites)介导的非帽结构 依赖的翻译。在rna病毒和细胞内的部分mrna中，蛋白合成的起始是由包含在5端非翻译区(5-tur)结构 中的ires介导的，ires能够在一些反式作用因子的参与下，募集核糖体40s亚单位，开始mrna的翻译过程。 不同病毒的ires在结构和功能上，既存在保守性，又有各自的特点。病毒ires序列在病毒基因的表达、复制 和致病性上具有至关重要作用，对病毒ires功能和调控的研究是当前病毒学研究热点之一。本文概述了近年来 rna病毒ires的几种分型及各自的特点以及ires的应用。 关键词：内部核糖体进入位点(ires)，rna病毒，hcv，emcv，pv，蛋白翻译在真核细胞中存在着两种蛋白翻译起始的机制。大多数真核细胞蛋白的翻译起始依赖于对mrna5端7的帽结构(m gpppx，x代表任意核苷酸)的识别。细胞内的翻译起始因子elf4e能够识别帽结构并与之结合1，募集核糖体亚单位与mrna的结合，在细胞内其它翻译起始因子的参与下，起始翻译2，这种方式 称为帽结构依赖的主体翻译(cap-dependent translation)。而近些年来，人们逐渐发现有些蛋白的翻译过程 不需要依赖于帽结构。最早提出这一机制的是在1988年，jang，sk等人通过分别构建单双顺反子，在微 球菌核酸酶处理后的hela细胞提取物和兔网织红细胞系统中检测报告基因的表达情况，发现脑心肌炎病 毒(emcv)rna序列5端ntr区域包含有一个潜在的核糖体内部结合位点，简称ires，该序列的260 至484位核苷酸对于翻译起到重要的作用3。同年，pelletier等人利用脊髓灰质炎病毒(poliovirus)的5ncr 构建双顺反子，发现只有当5ncr置于上游时顺反子才能被翻译，从而发现了微小核糖核酸病毒 (picomavirus)家族的又一成员脊髓灰质炎病毒(poliovirus)的5末端的utr也具有核糖体结合作用4。chen等人通过将微小核糖核酸病毒的ires连接至一个缺少5末端的环状rna上。该rna能够被正常翻 译，证实了ires能够起始翻译这一机制的可行性5。之后人们对这一全新的机制展开大量研究工作，从发 现ires结构及其作用至今，已经发现了至少有39种病毒的rna和85种细胞内的mrna含有ires结构 6，这使得ires介导翻译的机制成为真核细胞蛋白翻译机制的重要补充。研究发现这些病毒ires在结构上保守性较强，而细胞内mrha的ires尚未发现保守性6，已经发现 细胞内的mrna所包含的ires二级结构较弱，结构的稳定性较强，推断其可能与帽依赖的翻译具有相似 的机制7。ires在细胞应激、细胞发育及细胞疾病(如癌变等)中能够起到重要作用，例如多功能再生性胚胎干细胞中有一种中枢转录因子oct4，该因子的一个亚型oct4b的mrna中存在一个潜在的核糖体 内部结合位点，推测能够保护在应激条件下细胞免于凋亡；人的微管相关蛋白tau的mrna包含有一个 ires结构，该结构参与蛋白的合成，研究证明高度磷酸化的tau蛋白可导致阿尔茨海默病m。因此推测ires可能在维持细胞生理状态和病理进程中发挥重要作用。本文仅对rna病毒ires的功能及特性展开简要叙 述。3951rna病毒按照ires的分类11含有ires的rna病毒的宿主分布情况在39种含有ires的病毒中，感染人的病毒有10种，包括丙型肝炎病毒(hc11、卡波济肉瘤相关疱 疹病毒(kshv)12、人类t细胞亲淋巴病毒i型htlv1、脑心肌炎病毒emcv3、柯萨奇【肠道病毒b3 (cvb3)、肠道病毒71(ev71)、脊髓灰质炎病毒(pv)4甲型肝炎病毒(hav)、沙利斯伯里病毒、人鼻病毒 (hrv)、人免疫缺陷病毒1型。除htlv1，hiv 1 gag之外，其余均属于微小核糖核酸病毒科。除感染人 的病毒外，还在其他哺乳动物、植物、昆虫中发现了包含ires结构的rna病毒6。 12基于ires作用机制的病毒分类随着人们对ires功能特点研究的不断深入，对ires病毒出现了多种分类方式。本文概括了目前为大 多数研究者接受的分类方式，将含有ires结构的病毒根据翻译时所需翻译起始因子的情况、ires的二级 结构、起始密码相对于ires的位置和在网织红细胞系统中ires起始翻译的作用等分为四类6，13，14：第一类病毒的ires能够直接与核糖体亚单位结合，不需要其他蛋白因子和甲硫氨酰trnai的参与， 这些病毒的rna的结构对其功能起到决定性作用。因此，这类ires基本能够取代参与翻译起始的蛋白因 子和甲硫氨酰一trnai的作用，单独调控其与核糖体的结合。该类为ires是四类中长度最小的，约有190至220个核苷酸14。代表病毒为双顺反子病毒科(dicistroviridae)蟋蟀麻痹病毒(crpv)属于这一类型，该 类ires被称为基因间区域ires(igr ires)。第二类病毒的ires rna在真核起始因子elfs(elf3，eif2)和mettrnai参与的情况下能够结合40s 亚单位，起始mrna的翻译。这类病毒例如丙型肝炎病毒(hcv)和猪瘟病毒(csfv)。第三类病毒ires rna不仅需要elfs，mettrnai的参与，还需要ires反式激活因子(rrafs)的参与， 这些病毒能够在网织红细胞系统中能够有效起始翻译，核糖体结合在aug附近，无需划动，不与eif4g 的水解产物作用，代表病毒为脑心肌炎病毒(emcv)。第四类病毒ires rna需要elfs，mettrnai and itafs参与，不能单独在网织红细胞系统中翻译， 需要核糖体结合后滑向下游的起始密码子以后的30150个核苷酸，ires能够被elf4g的水解产物激活：elf4g(dap5p97)可被病毒蛋白水解酶水解为dapsp86从而增强ires介导的翻译”。此类包括脊髓 灰质炎病毒(pv)和鼻病毒属(rhinovirus)。2，ires的结构21基因间区域ires的结构第一类病毒的ires的二级结构和三级结构较为复杂，含有3个假结体(pki，ii and iii)和2个高度保守 的颈环结构(sliv和slv)，rna紧密折叠成环状结构，假结体能够结合于核糖体的p位点，从而在a位 点起始翻译160 jennifer等人通过结晶和x-ray技术，解析出双顺反子病毒科(dicistroviridae)病毒基因间区 域ires(igr ires)各个区域的结构170 irbsmos的冷冻电镜结果显示，sl与rps5在40s亚基的e位点和出12通道相互作用18costantino分析该基因间区域(igr)ires的晶体结构，发现其能与核糖体 解码区相互作用，这类rna在结构上精确模拟trna反义密码子mrna密码予的相互作用，该机制解释 了没有(初始)肽键形成的情况下核糖体的易位19。第一类和第二类病毒ires能够引起核糖体的变构，包括影响mrna在核糖体的解码位置的进入、定398位和固定，稳定起始trna的结合至核糖体40s亚基的p位点，启动最终起始复合物进行后续翻译，包括第一个肽链延长反应中的核糖体亚基的连接和易位14。 22以hcv为代表的第二类病毒ires的结构第二类病毒以hcv为代表，hcv病毒为单股正链rna病毒，属于黄病毒，其基因组全长约96kb， 由5 7和3端的非翻译区和1个约编码3 000个氨基酸残基的开放阅读框orf组成。通过nmr，xray， 结晶技术和冷冻电镜技术，已经解析出hcv的ires的结构。其ires的具有保守的二级结构，跨度为基因组的44372位碱基，包含有起始密码子aug(342344)和5端的一段序列20， 按照结构分为4个结 构域(i，ii，iii，iv)，结构中起主要作用的是结构域和121。最大的结构域i包含有6个分支发夹结构 (abcdef)，顶点处的结构域iiiab为真核起始因子eif3的结合提供了结构上的平台，hid结构包含有富含 鸟嘌呤的发夹结构，其底部为假结体iiif和小颈环结构iiie， iiie包含有保守结构5ga(uc)a3序列。 iiid的发夹结构u2“ugggu269对于40s的小亚基的结合具有重要作用。ires的三级结构有2个螺旋结合处作为40s小亚基和elf3的识别位点22。结构域iii的颈环结构能够结合真核起始因子elf3和核糖体蛋白 s9，eif3 p170和pl 16pl 10亚基的结合依赖于结构域iii顶端颈环区域的二级结构的折叠，iiid发夹结构 对于s9的结合具有重要作用23 0 ires的iiid二级结构有2个被分开的3bp的螺旋区，和一个6个核苷酸的终端环。nmr和分子图形学的三位模型中发现非经典的模体结构和非watsoncrick碱基对。有一个模 体结构包含有rrna的alpha八叠环24。ires能够通过结构域hiiv与核糖体40s小亚基结合，而结构域ii能够在解码过程中诱导核糖体构象 变化，kalliampakou等人通过广泛突变，研究ires结构域ii的心尖区，表明尽管大部分该区域的核苷酸序列较为保守，但单个点突变会影响ires的活性25lukavsky等人通过核磁共振分析，结构域ii形成一 个独立的l形折叠模块，这种保守的l形结构、与40s亚基的构象改变相关26。结构域iib包含一个环e 模体，和一个高度保守的发夹环(u80agccau86)和3端的一个动态环外尿嘧啶260 ires结合核糖体40s 小亚基形成二元复合物，接着在翻译起始点处募集eif3形成三元复合物48s样复合物，再在gtp依赖下 募集60s亚基形成80s复合物，该过程为限速过程。这些过程都依赖于ires的结构27。23微小核糖核酸病毒ires的结构特点微小核糖核酸病毒(picomaviruses)是感染哺乳动物的正链rna病毒，是ires病毒的主要成员。该病 毒家族分为5个属：肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口蹄疫病毒群、肝病毒属船，这类病毒基因组的5非翻译区长度大约有400个核苷酸，作为核糖体内部结合位点(眦s)，该结构相对保守。不同微小核糖核酸病毒的ires在体内和体外的作用相似，但序列和结构不完全相同。rivera等人发现肠道病毒和鼻 病毒的5端具有高达64-99的相似性29。jang等人报道称心脏和口蹄疫病毒属的ires也表现出种属的相似性加。这些ires元件均包含有保守的yrnxmaug单元(y代表嘧啶，x代表任意核苷酸)，且这些 ires可以结合细胞蛋白p57。肠病毒属和心病毒属(如脑心肌炎病毒)还能够结合细胞蛋白p522830。脊 髓灰质炎病毒(pohovirus)属于肠道病毒属，是二十面体正义rna病毒粒子，基因组全长约7500个核苷 酸：基因组的5端连接一个小的蛋白(genome-linked peptide)vpg，3端具有多聚腺嘌呤结构31；其5端非翻译区结构见图la28，包含有6个颈环结构，其中颈环至颈环构成ires，颈环与v为翻译的起始区域。脑心肌炎病毒(emcv)脑心肌炎病毒(emcv)属于心病毒属，其5端共有10个颈环结构，ires 结构跨度在260至833位核苷酸，包含颈环结构d至l。颈环i至k为翻译起始的重要区域姐，见图lb。397建菠图1微小核糖核醴病毒典型5，末端utr结构的比较。图a，为pv sncr。颈环ij至颈环vi构成ires，颈环11与v为翻译的起始区域”图b为emcv 5，端ires结构跨度为260至833，包含颈环结构d至l。颈环1至k为翻译起始的重要区域”。24hav、gbvb及其他病毒的ires结构特点bmwn等人选择了遗传学上分类不同的2种肝病毒属甲型肝炎病毒hav株pa21和cf53，通过系统 进化分析法，预测出它们的保守的二级结构，建立了一个5ntr二级结构模型，该模型分析结果显示 hav的5n rr由6个结构域组成，结构域i和ii(1到95碱基)包含55端芨夹结构和2个颈环结构， 碱基96 io 1 54医段为单链富舍嘧啶的高变区，剩余部分(结构域iir到vi，从155到734)包含有一些颈 环复台物，其中有一个可能形成假结体，末端有个高度保守的区域，包含一个寡嘧啶区域，距离潜在的 起始何点13个碱基。通过在网组红细胞系统中用碱基缺失的片段起始翻译，表明该序列3端的355位碱 基在翻译中起到重要作用该结构与鼠脑心肌炎旃毒的ires具有很多保守结构特征”。gbvb是一种与hcv相似，能够堪染小的是长类动物的病毒，可作为hcv研究的替代病毒。其5 端的非编码区折叠形成4个结构域，其中iiiiiiv结构域组成病毒的ires war【|er等已报道嵌合体 fvgbili(1qc)包含hcv的结构域iii，通过构建一些列gbvb与hcv嵌合病毒复制于发现gbv-b 5qqtr 结构域i和11不能被hcv的序列取代，说明该段包含有病毒特异性复制元件。而结构域iii可以相互替代”其他黄埔毒科肯有ires的病毒gbv-b，bvdv和csfv同hcv具有相似的二级结构。小同于其他(微) 小拉糖核酸病毒科病毒，其只单独依赖于rna序列翻泽起始点的3端和围绕在aug附近的结构”。pisarev 等人通过趾纹分析法证史黄病毒科的hcv的ires与微小核糖核酸病毒科的p1v-1在结构和功能t有很大相似性”。综上所述，rna病毒的ires存在着很多结构上的相似和不同的特性，日前正处于热点研究阶段，基丁网络的ires rna级结构预洲系统irss(丝g业塑堕剑幽的分析，为1res的研究挺供了有利的下具”。3ires的功能 3l第一类病毒ires的功能特点四种不同的ires分型巾，第一类病毒(代表为cricket pamlysis virus)的ires-火约有200个核苷酸能够直接结合梭糖体40s旺单位的中间位置，然后与60s单位形成具有活性的核槠体，不需耍其他因子的参与。crpv基因间区域(igr)ires能够占据核糖体p位点，起始trna进入a位点，体外实验证实 (crpv)基因间区域(igr)ires能够在没有起始因子和trna前提下聚集装配成80s核糖体复合物”。酵 母体内实验证实：igr ires介导的翻译不需要真核翻译起始因子elf4g1，elfsb，当elf2b，elf3b，elf4e 存在时翻译作用增强380 nishiyama等人通过实验证实真核核蛋白rps25能够与igr ires内保守的颈环 相互作用鲫。32第二类病毒ires介导翻译的特点第二类病毒的ires(代表为hcv)能够单独结合真核起始因子eif3，再与40s亚单位的esite结合， 之后结合eif2gtp起始trna复合物，形成48s复合物，最后与60s亚单位连接，在elf5elf5b的参 与下形成有活性的核糖体。hcv样ires还能够使起始trna稳定结合于核糖体40s亚单位的p位点，而 四型ires诱导核糖体构象的改变能够促进翻译过程中亚单位的连接和延长加。hcv及hcv样病毒粒子 ires的结构域和iii，起到募集40s小亚单位的作用，真核起始因子(elf)3和三元复合物 elf2mettrna(i)(met)lgtp和结构域ii促进亚单位的连接。猪捷申病毒(p，iv1)是微小核糖病毒成员，与 hcv属同类别，其主要作用集中于与核糖体40s亚单位结合的颈环结构iiid和iiie，该段同hcv相似，能够募集装配48s起始复合物，包含40s小亚单位、真核起始因子(eif)3和eif2gtpmettrna(i)(met)三 元复合物。这些ires在80s复合物的装配中也起到重要作用：促进elf5诱导的gtp水解和eif2gdp 从起始复合物上释放。研究表明这一功能与独立折叠的ires结构域ii弯折的构象和2个保守的rna模 体结构：发夹环和e环有关41。该功能可以作为hcv类似病毒ires的共有模式。hcv和hcv样ires 中包含的假结体结构与翻译的效率具有较大关联42。33微小核糖核酸病毒ires功能特点目前，微小核糖核酸病毒的三维结构尚未研究明白，只有较短的igr ires与hcv的部分结构域的三 级结构通过nmr、xray及其与核糖体复合物的冷冻电镜分析的方法被解析出来43，因此，此类ires的 功能特点还有待进一步探索。微小核糖核酸病毒的两个代表类型脊髓灰质炎病毒(pv)和脑炎心肌炎病毒(emcv)，其ires均可与细胞内57kda的多肽相互作用，该蛋白为大部分的核不均一核糖核蛋白(hili帅)，该蛋白的作用尚未研究明白44。kolupaeva等人通过体外重组的48s起始复合物的方法，研究发现不同的emcv相关ires需要 不同的ires反式作用因子(rrafs)，引物延伸抑制法研究表明该ires均能结合elf4gelf4a复合物， 从而促使核糖体靠近，并说明itafs的结合促进了这个过程45。多聚嘧啶结合蛋白(ptb)也被证实能够与emcv和fmdv的ires相互作用。m是一个多功能的rna结合蛋白(rbp)，包含4个rna结合模体结构，属于不均核糖蛋白(hnrna)家族。rna结合的模体结构能够识别富含u的短颈和uc序 列。ptb与itaf作用相似，可以促进微小核糖核酸病毒的ires的作用46。其他能够介导ires活性的因 子，如um(upstream ofnms)，通过与hrv和pv的ires的两个不同区域的作用，促进翻译拍。猴微小核糖核酸病毒9(spv9)5utr的ires结构与hcv和鼠疫病毒(hp)ires相似，能够结合40s 亚单位和真核起始因子(elf)3，iiid为主要结合结构域。需要elf2和起始trna形成48s复合物，再在 elf5，eif5b，and 60s的参与下形成t 80s复合物。指纹分析法显示eifia能够稳定48s复合物，并能介导40s构象改变，但不同于hp的ires，spv9的ires的作用能被e肼aeif4f增强，另外ires可以不依赖eif2促进起始trna结合至核糖体p位点47。这也说明在结构上相似的ires，其功能上可能有所不同。39934 ires的其他功能特点猪瘟病毒(csfv)基因组的翻译是由ires介导的，xiao等人用包含有csfv 5utr的单顺反子的体 外系统，发现csfv ns5a能够剂量依赖的减少ires介导的翻译。缺失突变分析结果显示csfv活性的 起主要的区域集中在aa 390-414，nssa抑制csfv翻译起作用的位置为k399，t401，fa06 and l413氨基 酸残基。说明ns5a对于病毒的复制起到了重要的作用48。elf3是一个约750kda的复合物，在5端帽结构或ires结构中，都能够控制40s亚单位在mrna的 募集。siridechadilok等人通过冷冻电(子显微)镜术证明其是一个含有5个分裂结构的粒子，能与hcv的 ires和5帽结构结合复合物elf4f通过相同的区域结合，其与mrna的结合并邻近40s的e位点49。不同于溶细胞的微小核糖核酸病毒，hav的复制不能导致宿主细胞的复制的关闭，hav蛋白水解酶 3c能够抑制ires介导的病毒基因组的翻译，3c还能水解多聚嘧啶结合蛋白(ptb)，ptb能与ires相 互作用。这说明3c介导的ptb的水解可能下调病毒蛋白的翻译，使得病毒朝着大量复制的方向进行50。 贾第鞭毛虫病毒属(glv)的ires由基因组5zitr的253个核苷酸和开放阅读框架中的264个核苷酸 组成。garlapati等人研究发现贾第虫细胞中存在解旋酶家族成员ibpl和两种已知的ires结合蛋白la自身抗原和srp20，其在体外结合glv ires，说明这三种蛋白有可能参与核糖体的募集51。4ires的应用41以ires为靶点的药物研究目前利用ires为靶点进行的药物研究，主要集中在丙型肝炎病毒感染的治疗药物。dash等人证实了 ifn，ifnb and ifn-,t能够靶向作用于hcv的5端ires，抑制蛋白的翻译52 0 prabhu等人证实了靶向于 ires颈环结构ii的sirna能够在体外抑制hcv的六个基因型，因此颈环结构ii可以作为抑制hcv的靶 点，研究药物53。ray等人找到一种与ires颈环结构11i相对应的的rna分子，能够剂量依赖的抑制ires 介导的翻译，而对帽结构依赖的翻译无作用54。颈部和第四环(slrv)区域、起始密码子附近的gcac序列，对于介导核糖体在hcv rna上的聚集具有重要功能，subramanian等人实验证实了短发夹结构shsliv 在huh7细胞中对hcv rna的复制起到显著的抑制作用。das等人已经发现一种小的酵母rna(矾a) 能够特异地抑制脊髓灰质炎病毒(pv)ires介导的翻译。同时这种irna能够在体内和体外特异抑制hcvires介导的翻译，能够竞争la自身抗原与hcv ires的结合。这为抗hcv感染研究药物提供了新的基 础56。根据ires结构的特点，针对结构域1157，结构域iii如，结构域59设计了不同的rna适配子， 均证实具有抑制ires介导翻译的活性。另外，能够靶向性抑制ires活性的还有人工核糖核酸酶的，dnazyme(dz)分子61，反义寡核苷酸62-64，合成肽(lap)65一，肽核酸(pna)6768等，这些分子的研究为抗 hcv病毒药物研究奠定了基础。微小核糖核酸病毒如脊髓灰质炎病毒(pv)和脑炎心肌炎病毒(emcv的基因组翻译是由5端非翻译区 的ires介导的，细胞内riga结合蛋白反向作用于该过程，p57已被证实与一种核蛋白参与mrna前体 的形成的多聚嘧啶结合蛋白(pptb)相同，抗pptb的抗体在体外能够抑制微小核糖核酸病毒mrna的翻译，但不能抑制珠蛋白的翻译69口蹄疫病毒(fmdv)是接触传染的病原体，宿主为偶蹄动物。已经有报道称 i型干扰素(ifsalpha，betas)能够抑制fmdv的感染m，推测其抑制与ires相关。 42其他作用于ires抑制hcv病毒翻译的药物筛选40