（食品科学专业论文）棉籽粕蛋白的制备及其性质研究.pdf

含量高，价格低廉，是一种急待开发利用的重要蛋白质资源。由于粕中棉酚的毒性限制， 利用率低，先前研究主要集中在棉酚脱毒饲养动物方面，对棉籽粕蛋白的制备及性质研 究相对较少。本论文以预榨浸出的高温棉粕为原料，系统研究了棉籽粕蛋白的生产，包 括浓缩蛋白的制备及分离蛋白的提取，并对蛋白的理化功能性质进行较为全面的研究， 以期为深度开发和利用棉籽粕资源提供更加有效的途径。 首先，采用酶处理结合醇洗法制备棉籽浓缩蛋白。选用v i s c o z y m e l 、糖化酶对棉 粕进行作用，再用乙醇溶液浸洗。研究表明，在添加糖化酶1 6 0 0u g ，v i s c o z y m e l0 6 0 f b g ，液料比1 0 ，5 0 。c 条件下作用1 4 0m i n 后，再用7 0 乙醇溶液，液料比7 ，6 0 醇 洗2 次，每次4 5m i n ，得到棉籽浓缩蛋白蛋白含量为6 4 3 9 。 其次，采用碱提酸沉法提取分离蛋白。通过单因素和响应面优化确定最佳提取工艺 为：p h i1 ，液料比1 6 5 ，提取温度6 0 ，提取时问1 0 5m i n ，在此条件下碱提提取率为 6 7 2 7 。经酸沉及冷冻干燥后提取率为5 6 0 2 ，蛋白含量为8 6 1 6 。碱提残渣用碱性 蛋白酶进一步水解，提取率为2 4 4 2 ，产品蛋白含量6 2 1 2 。两步相加棉籽蛋白总提 取率为9 1 6 9 。 再次，对高温棉粕分离蛋白的理化功能性质进行了测定，并与从低温粕中提取蛋白 的性质进行比较，以研究油脂提取过程中高温对蛋白质的影响。结果表明，棉粕蛋白氨 基酸组成合理，除l y s 含量稍低外，其他必需氨基酸均能满足f a o w h o 规定的2 5 岁儿 童推荐摄入量，经高温作用后l y s 、l e u 、t h r 等含量有所降低。低温粕以清蛋白、球蛋 白为主，经高温影响的高温粕则以球蛋白、谷蛋白为主。较低温粕蛋白，高温粕蛋白的 羰基含量增大，表面疏水性增强。高低温粕提取蛋白的变性温度分别为8 7 2 7 、9 2 7 3 。 s d s p a g e 电泳知棉粕蛋白主要有8 条谱带，主要分子量为5 9 7l a 和5 3 6k d a 。 棉粕分离蛋白的功能性质较所购买的大豆分离蛋白的功能性质差。受p h 、盐离子浓 度、温度等环境因素影响较大，一定浓度的盐离子可改善蛋白的功能性质，尤其对低温 粕提取蛋白的起泡性改善明显。棉籽蛋白在油脂压榨浸提过程中，受高温影响，部分变 性，导致蛋白提取率、营养价值及功能性质均有所下降。 最后，采用胰蛋白酶对高温棉粕分离蛋白进行酶法改性。研究发现，水解后蛋白溶 解性增加，中性条件下，d h 3 4 7 时溶解度达8 8 1 0 ，d h l l 3 4 达9 2 4 0 ，相比酶解前 溶解性增加6 7 7 0 ；d h 6 3 7 时乳化活性最好，比原来提高了8 7 3 0 ：起泡能力随着水 解度的增大也逐渐增大，d h i1 3 5 时起泡性最好为1 7 0 ，提高1 2 0 ，起泡稳定性也较 摘要 好。可见，适度的酶解可使棉粕蛋白的功能性质得到明显改善。 关键词：棉籽粕；浓缩蛋白；分离蛋白：理化性质；功能性质；酶法改性 l i s e l d o mr e s e a r c h e da t p r e s e n t u s i n gp r e p r e s s e dc o t t o n s e e dm e a la sm a t e r i a l ，t h i sa r t i c l e s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e dc o t t o n s e e d p r o t e i np r o d u c t i o n ，i n c l u d i n gp r o t e i nc o n c e n t r a t e p r o d u c t i o na n dt h ee x t r a c t i o no fi s o l a t e dp r o t e i n ，a n dt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ，i no r d e rt o p r o v i d ea l la l t e r n a t i v ee f f e c t i v ea p p r o a c hf o rd e e pu t i l i z a t i o no fc o t t o n s e e dm e a l f i r s t l y , c o t t o n s e e dm e a lw a sh y d r o l y z e dw i t hv i s c o z y m ela n dg l u c o a m y l a s e ，a n dt h e n i m m e r s i o n e db ya l c o h o lt o p r e p a r a t ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o n t h er e s u l ti l l u s t r a t e dt h a t g l u c o a m y l a s e16 0 0u g ，v i s c o z y m e l0 6 0f b g g ，s o l v e n t s o l i dr a t i o1 0 ，5 0 t oh y d r o l y z e d 14 0m i n ，t h e n7 0 e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，s o l v e n t s o l i dr a t i o7 ，6 0 d i p p e d2t i m e s e v e r y t i m e4 5m i n t h ep r o t e i nc o n t e n to fc o t t o n s e e dp r o t e i nc o n c e n t r a t ew a s6 4 3 9 s e c o n d l y , c o t t o n s e e dp r o t e i ni s o l a t e ( c p i ) w a se x t r a c t e db ya l k a l i n ee x t r a c t i o na n da c i d p r e c i p i t a t i o n a c c o r d i n gt ot h es i n g l ef a c t o ra n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y , t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d ：p h l l ，t e m p e r a t u r e6 0 ，s o l v e n t s o l i dr a t i o1 6 5 r e a c t i o nt i m e 10 5m i n 1 1 1 ep r o t e i ne x t r a c t i o nr a t ew a s6 7 2 7 t h ep u r i t yw a s8 6 16 a n dt h ey i e l dw a s 5 6 0 2 t h e n ，t h er e m a i n i n gd r e g sw e r ef u r t h e rh y d r o l y z e db ya l c a l a s e t h er a t i oo f e x t r a c t i o nw a s2 4 4 2 t h et o t a le x t r a c t i o nr a t i ow a si m p r o v e dt o9 1 6 9 b yt w os t e p s e x t r a c t i o n t h i r d l y , p h y s i c o c h e m i c a la n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fp r o t e i ne x t r a c t e df r o mt h eh i g h a n dl o wt e m p e r a t u r ep r e t r e a t m e n tc o t t o n s e e dm e a lw e r er e s e a r c h e d r e s u l ti n d i c a t e dt h a t ， a m i n oa c i dc o m p o s i t i o no fc p lw a sc o m p l e t e da n dt h ec o n t e n tw a sr i c h b e s i d e sl y s ，t h e c o n t e n to ft h eo t h e ra m i n oa c i d sw a sf u l l ya b o v et h er e c o m m e n d e di n t a k ef o rc h i l d r e nf r o m2 t o5y e a r so l db yf a o w h o t h r o u g hp r o t e i nc l a s s i f i c a t i o n w ec o n c l u d et h a tm a i np r o t e i no f h i g h t e m p e r a t u r ep r e t r e a t m e n tm e a lw a dg l o b u l i na n dg l u t e n ，a n dl o w - t e m p e r a t u r e p r e t r e a t m e n tm e a lw a sg l o b u l i na n da l b u m i n t h ed e n a t u r a l i z a t i o nt e m p e r a t u r e so fp r o t e i n f r o mh i g ha n dl o wt e m p e r a t u r e p r e t r e a t m e n tm e a lw e r e8 7 2 7 c ，9 2 7 3 r e s p e c t i v e l y c a r b o n y lc o n t e n ta n dh y d r o p h o b i c i t yo fh i g ht e m p e r a t u r ep r e t r e a t m e n tp e o t e i ni n c r e a s e d s d s - p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h ep r o t e i nw a sm a i n l yc o m p o s e do f e i g h tb a n d sw i t hm o l e c u l a r w e i g h t s ：5 9 7k d a ，5 3 6 k d a 。 f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c so fc p lw e r ei n f e r i o rt os p i t h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r s s u c ha s p h ，s a l tc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r ee t c c o u l da f f e c tf u n c t i o n a lp r o p e r t i e s w i t ha p p r o p r i a t e i n c r e a s i n go fs a l tc o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r e ，f u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r ei m p r o v e d e f f e c to fs a l tc o n c e n t r a t i o no np r o t e i nf r o ml o w - t e m p e r a t u r et r e a t m e n tm e a lw a se s p e c i a l l y i l l a b s t r a c t s i g n i f i c a n t c o m p a r e dw i t ht w op r o t e i n s ，w ec o u l dc o n c l u d et h a tw h e nc o t t o n s e e do i lw a s e x t r a c t e da n dp r o c e s s e d p r o t e i nd e n a t u r a l i z a t i o nr e s u l t e di nd e c l i n e de x t r a c t i o nr a t i o ， n u t r i t i o n a lv a l u ea n df u n c t i o n a lp r o p e r t i e s i ti l l u s t r a t e dt h ep r o c e s so fo i le x t r a c t i o nw a s i m p o r t a n tt ot h el a t e rt r e a t m e n to fc o t t o n s e e dm e a l f i n a l l y , c o t t o n s e e dp r o t e i nw a se n z y m a t i cm o d i f i e du s i n gt r y p s i n w i t ht h ei n c r e a s eo f h y d r o l y s i s s o l u b i l i t yi n c r e a s e d t h es o l u b i l i t yo fd h 3 4 7w a s8 8 1 0 a n dd h l l 3 4w a s 9 2 4 0 a tp h 7 ，i n c r e a s e db y6 7 7 0 t h a nb e f o r e e m u l s i f y i n ga c t i v i t yw a sb e s ta td h 6 3 7 ， w h i c hw a s13 0 4 4m 2 g i m p r o v e db y8 7 3 0 t h eh i g h e rh y d r o l y s i sd e g r e ec o u l dr e s u l ti n i m p r o v e m e n to f f o a m i n ga b i l i t y , a td h l l 3 5w h i c hw a s1 7 0 ，i n c r e a s e db y1 2 0 t h e r e f o r e a p p r o p r i a t ee n z y m eh y d r o l y s i sc o u l di m p r o v e f u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fc o t t o n s e e dp r o t e i n o b v i o u s l y 。 k e y w o r d s ：c o t t o n s e e dm e a l ；c o n c e n t r a t e dp r o t e i n ；i s o l a t e dp r o t e i n ；p h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t y ； f u n c t i o n a lp r o p e r t y ；e n z y m a t i cm o d i f i c a t i o n 。 i v 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i f 了j 灵i lj ；i 言1 1 1 棉籽粕概况1 1 2 棉籽粕的脱毒方法l 1 3 棉籽蛋白的营养价值：1 1 4 棉籽蛋白的开发和应用2 1 5 近年来国内外棉籽蛋白研究进展2 1 5 1 浓缩蛋白的制备2 1 5 2 分离蛋白的提取分离2 1 5 3 蛋白理化和功能性质3 1 5 4 蛋白酶法水解3 1 6 立题背景和意义4 1 7 研究内容和目的：4 2 实验材料与方法5 2 1 主要材料与试剂5 2 2 仪器与设备5 2 3 实验方法5 2 3 1 原料基本成分的测定：5 2 3 2 棉籽浓缩蛋白的制备5 2 3 3 分离蛋白的提取制备6 2 3 4 蛋白质理化性质的测定8 2 3 5 蛋白质功能性质的测定9 2 3 6 蛋白质的酶法改性1 0 3 结果与讨论1 1 3 1 棉籽粕基本成分分析结果1 l 3 2 棉籽浓缩蛋白的制备1l 3 2 1 酶的筛选1 1 3 2 2 酶解反应单因素实验结果与分析1 1 3 2 3 响应面优化酶解工艺的结果1 3 3 2 4 醇沈因素对浓缩蛋白纯度的影响1 2 3 2 5 产品的基本成分及氨基酸组成1 4 3 3 棉籽分离蛋白的提取制备1 5 目录 3 3 1 棉籽蛋白的酸沉等电点1 5 3 3 2 碱法提取蛋白质单因素实验结果与分析1 5 3 3 3 响应面优化碱法提取蛋白工艺的结果1 6 3 3 4 不同提取方式对棉粕蛋白提取率和纯度的影响1 7 3 3 5 碱提残渣蛋白酶提取的结果1 8 3 4 棉粕分离蛋白理化和功能性质研究1 9 3 4 1 高低温棉粕提取蛋白主要成分分析1 9 3 4 2 棉籽粕蛋白质的组分分级1 9 3 4 3 棉粕的蛋白溶出率j 1 9 3 4 4 氨基酸的组成及其分析评价：2 0 3 4 5 热稳定性的分析2 l 3 4 6 羰基含量及疏水性的变化一2 1 3 4 7 棉粕蛋白分子量分布2 2 3 4 8 溶解性：2 2 3 4 9 持水性和持油性2 3 3 4 1 0 起泡性和泡沫稳定性2 4 3 4 1 1 乳化性和乳化稳定性2 5 3 5 高温粕分离蛋白的酶法改性研究2 6 3 5 1 蛋白酶的选择2 6 3 5 2 灭酶处理时间的选择2 7 3 5 3s d s p a g e 电泳结果2 7 3 5 4 不同水解度对溶解性的影响2 8 3 5 5 不同水解度对乳化特性的影响2 8 3 5 6 不同水解度对起泡特性的影响2 9 论文主要结论3 1 致谢3 2 参考文献3 3 附录3 7 i i i 引言 1 1 棉籽粕概况 1 引言 棉花是重要的经济作物，脱去皮棉后的棉籽是一种很好的油源，也是一种急待开发利用的重要 蛋白质资源。世界棉籽年产量约3 0 0 0 万吨，我国是第一产棉大国，每年棉籽产量达9 0 0 万吨以上， 其土产区在华北平原和西北地区，全国各地均有一定的产量。提油后的副产物棉籽饼粕，年产 。 量达4 0 0 - - 5 0 0 万吨，约占各类植物饼粕总产量的3 0 i 。棉籽饼粕不仅资源丰富，分布广泛，营养 价值也很高。粕中蛋白质含量高，约为3 3 2 1 - 4 5 0 9 1 2 | 。棉籽饼柏水解后得到1 7 种氨基酸，除了 蛋氨酸含量稍低外，其余必需氨基酸含鼍均能达到联合国粮农组织和世界卫生组织推荐的标准1 3 l 。 此外，相比大豆饼粕，棉籽饼粕价格低廉，可以人人降低成本。由于棉酚毒性的限制作用、现有提 油 ：艺导致棉籽粕的质量低f 以及植酸等抗营养冈子的存在，使棉籽饼粕长期以来没有得到很好的 利用，一小部分脱毒后作为动物饲料，约8 0 用作肥料直接下地，对于蚩白资源日益匮乏的今天， 是一种极大浪费。 1 2 棉籽粕的脱毒方法 几十年来，关于棉籽粕的研究主要集中在棉酚脱毒上，现在棉粕脱毒技术已比较成熟。常用的 脱毒方法主要有： ( 1 ) 化学法：利用棉酚的化学性质，在棉粕中添加硫酸盐( f e 2 s 0 4 、g u s 0 4 ) ，其金属离子与游 离棉酚形成络合物达到脱毒目的。缺点是形成的络合物仍留在棉粕中，粕的适口性差，不易被消化。 ( 2 ) 物理法：利用棉腺体在密度、尺寸、形状与其他组分如蛋白质之间的差异，在一定的介质中 将其与蛋白质分离。 ( 3 ) 生物发酵法：利用微生物发酵将棉酚转为其他物质。微生物发酵后，棉粕营养价值大大提高， 但转化机理不明，生产周期较长，工艺条件的控制难度人【引。 ( 4 ) 混合溶剂萃取法：利用棉酚在醇类溶剂中的溶解特性，采用两种溶剂混合后( 轻汽油和乙醇 或丙酮) 从棉4 - ：中同时提取棉油和棉酚。混合溶剂_ 萃取法是研究较多的方法，优点是避免了蛋白质 的热变性和蛋白质氨基酸与游离棉酚的结合。但存在溶剂分离和回收困难( 溶剂互溶及共沸现象严 重) ，溶剂消耗大，成本高；溶剂配比复杂，萃取出的毛棉油中含有大量的棉酚和色素，油品质量下 降等问题。 ( 5 ) 液液同三相萃取法【5 】：是一种新型的棉籽脱毒方法，在低温环境下，采用6 。溶剂油和甲醇 ( 8 0 水溶液) ，分步萃取棉籽油和脱除棉酚，得到棉酚低于4 0 0p p m ，蛋白含量高于5 0 的脱酚棉 籽蛋白产品。两种溶剂分步萃取易于溶剂的分离和同收，溶剂消耗降低；直接浸出，可减少油脂制 取过程中蛋白质的破坏：在浸出提油之后，对含溶剂的湿粕直接进行萃取提酚脱毒，粕未经高温烘 干处理，避免了蛋白质的热变性，保证了产品的营养价值不受损失。 1 3 棉籽蛋白的营养价值 棉籽蛋白具有较高的营养价值高，在质鼍上近似豆类蛋白，优于谷类蛋白，氨基酸除蛋氨酸稍 低外，其他必需氨基酸均达到联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 推荐的标准。与大豆蛋 白相比，棉籽蛋白i ：3 味温和，没有豆腥味和其他异味，且人体中不能消化的低聚糖含量低，不会导 致肠胃胀气，是一种很好的食用蛋白和饲用蛋白1 6 1 。从表1 1 棉籽蛋白与其他蛋白的比较可知，棉籽 蛋白的营养价值优丁大豆，可与牛乳酪蛋白媲美【7 1 。另外，棉籽蛋白还含有矿物质及c a 、p 、f e 、z n 江南人学硕士学位论文 等多种微量元素和维生素类营养成分。 表1 1 棉籽、小麦、大豆、牛乳酪蛋白的营养价值比较【7 j t a b 1 1c o m p a r i s o no fn u t r i t i v ev a l u e sa m o n gc o t t o n s e e d ，w h e a t ，s o ya n db o v i n ec a s e i n 1 4 棉籽蛋白的开发和应用 棉籽蛋白是高质量的蛋白，其生物效价为2 3 2 7 ，是天然的食品强化剂。国外许多国家，如美 国、法国、原苏联、日本及两欧一些国家很早地展开了棉籽蛋白的应用研究。 将棉籽蛋白加入到面粉中，可使面团的水合性能增强，延长食品的保鲜期和贮存期。如棉籽蛋 白添加到面包中，可使蛋白质含量高达2 1 ，比不加棉籽蛋白的纯标准面包高一倍，且产品松软可 口，柔韧性强，体积增大，保湿性良好，易贮存【8 1 ；棉籽蛋白也可代替动物蛋白用于肉馅、肉丸子、 香肠等肉食制品中。在牛肉馅饼中加入8 棉籽浓缩蛋白，可降低油煎时的重量损失，其味道更为 鲜美。同样在肉丸子、肉汤等中加人适量棉籽蛋白，可防止脂肪和水分的损失，使产晶增重约1 0 ， 并保持其良好的品质和风味【9 , 1 0 】；利用存贮蛋白酸性易溶的特性生产酸性蛋白饮料，使饮料中蛋白质 的含量提高到6 ；将棉籽中的大部分蛋白质酶解，使产品具有较好的发泡和乳化功能，用于蛋糕、 冰淇淋等食品中；棉籽蛋白用作药媒，可替代大豆蛋白、玉米浆、鱼粉用做抗菌素、酶制剂等发酵 生产原料，可大大降低生产成本。 棉籽蛋白作为食品添加剂，既可以提高食品的营养价值，改善口感，又可以降低生产成本和销 售价格。所以要加快棉籽蛋白在食品上业的开发利用。 1 5 近年来国内外棉籽蛋白研究进展 1 5 1 浓缩蛋白的制备 浓缩蛋白是指除去非蛋白成分制得的蛋白产品。浓缩蛋白制取方法有空气分级法、水力旋流法、 溶剂浸提法。s w a i n t l l l 、g 嬲t r o c k 【1 2 1 分别用空气分级法和水力旋转法制备了浓缩蛋白，但这两种方法 对原料要求比较高且操作凼难。胡传荣1 3 1 分别用乙醇、盐酸处理无腺体棉粕，得到了蛋白质含量为 7 0 的浓缩蛋白。崔志芹( 1 4 1 则以双液相萃取棉粕为原料，用k 2 c 0 3 液选法制备了蛋白质含量为6 6 浓 缩蛋白。 1 5 2 分离蛋白的提取分离 从棉籽粕中提取分离棉籽蛋白主要有传统的碱提酸沉法、盐溶法等。碱提取主要考虑溶液f f 勺p h 值，盐提需要考虑盐浓度。赵莹等f l5 j 考察了氨溶、盐溶以及碱溶对棉籽粕中棉籽蛋白提取的效果， 认为n a o h 溶液萃取得到的蛋白质纯度低，很难达到分离蛋白的要求，采用2 n h 3 h 2 0 或4 n a c l 蟹白质纯度可达9 0 以上，但提取率相对不高。张娜等i i6 j 也比较了碱法和盐法从棉籽柏中提取棉籽 蛋白的效果，发现两种方法提取率接近，都在7 0 左右，但盐法提取的蛋白产品纯度较高，色泽浅， 且游离棉酚含量相对较低。而刘军【l7 j 在比较了不同溶剂提取后得出热碱法既能保证较高的蛋白得率 和含量，还有很好的脱酚效果。通过优化得到最佳工艺条件为p hl o 7 1 ，温度6 0 2 ，时间1 0 7h ， 液料比1 6 7 ，其蛋白得率三6 0 ，蛋白质含量芝9 0 。崔志芹以双液相棉籽粕为原料，在传统的碱溶酸 沉丁艺基础上也对上艺进行优化，获得了较好的萃取率，利用超声波辅助提取有效地缩短了时间， 2 l 引言 进一步提高了萃取f7 1 。不同的研究者结果各有差异，可能与原料处理方法不同有一定关系。l a w h o n i l 8 】 比较了四种粕不同加工方法对棉籽蛋白提取率和蛋白功能性质的影响，经过热处理的，其提取率和 功能性质相对较差，同时采用沉淀p h 值不同也有较大影响。 棉籽蛋白中含有非存贮蛋白和存贮蛋白，二二者沉淀的p h 值不同。b e r a d i 等1 1 9 】得出非存贮蛋白和 存贮蛋白一起沉淀时，蛋白质等电点为p h 5 0 ；非存贮蛋白和存贮蛋白单独沉淀时等电点分别为p h 4 0 、7 0 。r i o l s o n 和f r a z e u r 【2 u j 根据非存贮蛋白和存贮蛋白等电点的不同，运用分段沉淀法制备了 蛋白非存贮蛋白和存贮蛋白，先碱液在p i l l 0 1 0 5 浸提，然后调节p h 至7 0 沉淀得存贮蛋白，蛋白质 含量9 5 5 ，收率6 0 9 ；继续调节清液p h 至4 0 ，沉淀得到非存贮蛋白，蛋白质含量8 0 5 收率2 2 8 。 此外，李学琴等【2 l 】通过反胶束法从棉籽粕提取棉籽蛋白，其提取率可达8 4 ，反胶束法萃取蛋 白可大大降低碱溶酸沉所带来的污染问题，但该技术还不成熟，需要的设备比较先进，有待进一步 改进后应用在生产中。 1 5 3 蛋白理化和功能性质 蛋白质良好的功能性质，很大程度上决定了其在食品t 业中应用的可行性。蛋白质的功能性质 与蛋白质分子量大小、结构特征、氨基酸组成、带电情况等理化性质直接相关，还与加t 条件及p h 、 温度、离子强度等外部环境等因素密切相关。 功能性质方面，国外主要是t s a l 酗等【2 2 ，2 3 1 研究- j p h 、糖度和盐浓度对在不同p h 条件下沉淀得到 的棉籽分离蛋白的起泡性、乳化性的影响，发现一定浓度的糖和盐都能改善棉籽分离蛋白的乳化性 和起泡性。国内，崔志芹1 2 4 】考察了棉籽浓缩蛋白、沉淀蛋白和溶解蛋白3 种棉籽蛋白的功能性质，发 现棉籽溶解蛋白的乳化性和起泡性较佳；浓缩蛋白和沉淀蛋白，除吸油、吸水能力强之外，其他功 能特性均较差。 理化性质方面研究较少，张娜【2 5 】研究得出棉籽蛋白的等电点( p 1 ) 为5 0 ，变性温度为6 7 。2 3 c ， s d s p a g e 电泳图谱中主要9 条谱带。 1 5 4 蛋白酶法水解 一 从目前研究中发现棉籽分离蛋白的功能性质并不是很理想，要扩大其在食品工业中的应用，需 要进一步进行改性研究。蛋白改性主要有物理改性、化学改性、酶法改性等。物理改性和化学改性 研究相对较甲也较少。c h o i 、l u s a s l 2 酬、胡传荣f 27 】等人曾对棉籽蛋白进行了酰化改性，并证明酰化改 性可以明显改善其吸水性、吸油性、乳化性和起泡性。但化学改性一般会引入化学物质，产生副反 应，一般不用于食用蛋白的改性。 酶法改性是在酶催化下有控制性的水解，将蛋白质分子中肽键打开，从而改善棉籽蛋白的溶解 性、起泡性和乳化性等。或是酶直接水解棉籽饼粕得到理想的棉籽蛋白。酶法条件温和，副反应少， 不破坏氨基酸，且产品的颜色和味道较好，是近年来研究的热点。而且酶法水解已从单酶向多酶方 向发展，再结合膜分离方法，能够很好地得到所需要的多肽组分。 在通过酶水解改善功能性质方面，何慧娟【2 8 】发现酶解后棉籽粕蛋白的起泡能力较酶解前有显著 性的提高，匀浆速度对酶解后蛋白的起泡性也具有显著影响。张汆1 2 9 】用胰蛋白酶限制性酶解脱酚棉 籽蛋白，使蛋白在p h1 1 1 范同内均具有了较好的溶解度。生物肽方面，郭城【3 0 】发现使用两种酶分步 水解棉籽蛋白的效果优于单一酶水解，先经碱性蛋白酶a l c a l a s e 水解后再加入中性蛋白酶a s l 3 9 水解， 最终水解度可达到2 0 0 8 。刘纠引j 采用多酶组合方式连续水解制备棉籽低苦味活性肽，水解度达 2 6 6 7 ，肽得率8 5 2 6 ，并探讨了活性肽的抗氧化和a c e 抑制活性，结果表明分子量分布在4 0 0 1 0 0 0 d a 间的短肽有a c e 抑制活性，对s h r 人鼠具有降血压作用；棉籽蛋白各组分具有抗氧化活性，但抗 氧化能力都比较差。g a o 掣强j 用中性蛋白酶n e u t r a s e 水解棉籽蛋白得至- i j 4 个具抗氧化活性组分，其中 3 江南人学硕士学位论文 分子量为0 8 1 2k d a 组分抗氧化活性最强，可作为天然抗氧化剂加入食晶中。对丁棉籽功能性多肽 的开发刚起步，还有待进一步拓宽。 1 6 立题背景和意义 蛋白质是人类赖以生存的重要的物质基础。油料作物蛋白是我国重要的蛋白质资源。大豆蛋白 生产应用由来已久，菜籽、花生蛋白也成为近年来研究开发的热点。棉籽是和大豆、菜籽、花生等 同样重要的食用油脂资源，棉籽蛋白也是一种急待开发利用的重要蛋白质资源。 棉籽饼粕资源丰富，分布广泛，营养价值高。全世界棉籽年产量约3 0 0 0 万吨，棉籽饼粕年产量 约 各类植物饼粕总产量的3 0 。我国棉籽年产量达9 0 0 万吨以上，主产区为华北平原和西北平原， 全国各地均有一定的产量。脱油后棉粕蛋白含量高约为3 0 - 4 5 ，蛋白质氨基酸组成合理，质量优 异，口味温和，是一种很好的食用和饲用蛋向质。此外，棉籽饼粕价格低廉，现时售价是大豆饼粕 价格的2 3 ，可大大降低成本。但由于棉酚的毒性限制作用，除小部分脱毒后作为动物饲料，约8 0 用作肥料直接下地，没有得到很好的综合利用。 棉粕，既可以精加工，应用剑食品工业中，制备成蛋白质丰富的食品；也可以粗加= r ：作为植物 蛋白饲料，解决蚩白质饲料供不应求的局面。目前棉籽蛋白研究主要集中在棉酚脱毒和动物饲养方 面【3 3 , 3 4 ，对棉粕蛋白的制各及性质研究报道相对较少。所以从棉籽粕中制备蛋白，探索其为一种新 的蛋白资源应用到食品和饲料工业中，促进棉副产品的综合利用，可以为我国蛋白来源提供新途径， 解决蛋白紧缺问题，还可以增加棉农收入，具有重要的社会和经济意义。 1 7 研究内容和目的 本课题以预榨浸提棉粕为原料，研究棉籽粕浓缩蛋白和分离蛋白最优的提取制备方法，然后对 其理化性质和功能性质进行研究，并对高温棉粕分离蛋白进行酶法水解改性，探索棉籽粕蛋白作为 一种新型的植物蛋白资源应用于食品工业，为促进棉副资源的综合利用提供理论依据和实验参考。 本课题研究的主要内容如下： 1 棉籽浓缩蛋白的制备 2 棉粕分离蚩白的提取制备 3 棉粕分离蛋白的理化和功能性质研究 4 高温棉柏分离蛋白的酶法改性研究 4 实验材料与方法 2 1 主要材料与试剂 验材料与方法 主要材料：预榨浸出棉籽粕，棉籽由山东邹平福海有限公司提供；v i s c o z y m el ( 酶活：1 0 0t o g g ) 、 糖化酶( 酶活：l o 万u g ) 、碱性蛋白酶( a i c a l a s e2 4 l ) 、复合蛋白酶( p r o t a m e x5 0 0 g ) ，丹麦 诺维信公司；纤维素酶( 酶活：4 万u g ) 、胰蛋白酶( t r y p s i n6 0 s ) ，购于无锡雪梅酶制剂有限公 司；大豆分离蛋白( 蛋白含量为8 5 2 4 ) ，购于山东冠华植物蛋白有限公司。 主要试剂：盐酸、硫酸、氢氧化钠等，均为分析纯，国约集团化学试剂有限公司；低分子质量 标准蛋白，上海升正科技有限公司；棉酚标准品、1 苯胺基8 萘磺酸( a n s ) ，美国s i g m a 公司。 2 2 仪器与设备 d f y 5 0 0 摇摆式高速中草药粉碎机，温州温岭林大机械有限公司；k d n 0 8 消化炉，上海昕瑞 仪器仪表有限公司；t d l 5 低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；l g j 1 0 冷冻干燥机，北京 四环科学仪器厂；2 1 0 0 型紫外可见分光光度计，尤尼柯( 上海) 仪器有限公司；h i t a c h i6 5 0 6 0 荧光分光光度计，日本h i t a c h i 公司；p y r i s 1 差示扫描量热仪，美国p e r k i n e i m e r 公司；1 1 0 0 犁氨基 酸自动分析仪，美国安捷伦公司；p o w e r r a p a cb a s i c 稳流稳压电泳仪，美国b i o r a d 公司；t 1 8 高 速分散器，德国i k a 公司。 2 3 实验方法 2 3 1 原料基本成分的测定 水分的测定：1 0 5 。c 衡重法( g b t5 0 0 9 3 2 0 0 3 ) ； 粗脂肪的测定：g b t 5 0 0 9 6 2 0 0 3 ； 粗蛋白的测定：微鼍凯式定氮法( g b t5 5 1 1 - 2 0 0 8 ) ，其中凯式定氮系数取5 3 0 ； 灰分的测定：5 5 0 灼烧法( g b t5 5 0 5 2 0 0 8 ) ； 粗纤维的测定：酸性洗涤剂法； 总糖的测定：苯酚硫酸法； 植酸的测定：钼蓝比色法； 游离棉酚的测定：间苯三酚比色法1 3 5 1 。 2 3 2 棉籽浓缩蛋白的制备 2 3 2 1 浓缩蛋白的制备工艺 棉粕一多级粉碎过筛- - - a n 入一定去离子水一lm o l lh c ! 调p h 至4 5 一加入复合酶反应- 4 0 0 0 r m i n 离心分离2 0m i n 一沉淀加入一定乙醇溶液浸洗一离心分离一沉淀真空干燥一浓缩蛋白产品 2 3 2 2 酶的筛选 选用v i s c o z y m e l 、糖化酶、酸性纤维素酶、果胶酶及几种酶的复合在推荐条件下对棉籽粕进行 作用。称取2 0g 棉粕粉，以液料比1 0 加入去离子水，1m o l d , h c i 调p h 至4 5 ，根据推荐量加入酶，5 0 恒温水浴反应1 2 0m i n ，离心，沉淀加入7 5 乙醇溶液，6 0 醇洗2 次，每次4 5m i n ，沉淀真空干 燥即得浓缩蛋白产品，以浓缩蚩白产品的蛋白干基含量为指标确定酶的种类。对比实验不添加任何 酶，其他条件相同。同时，与醇法和酸法制备的浓缩蛋白做比较，醇法制备方法为棉粕粉加入1 0 倍 体积7 5 乙醇溶液，6 0 醇洗2 次，每次4 5m i n ，离心干燥；酸法制备方法为棉粕粉加入1 0 倍体积去 5 江南人学硕十学位论文 离子水调p h4 5 ，5 0 反应1 2 0m i n ，离心干燥。 2 3 2 3 浓缩蛋白制备工艺的优化 ( 1 ) 酶解反应单冈素实验 酶解反应在确定醇洗条件为7 5 乙醇溶液，6 0 c 醇洗2 次，每次4 5m i n 下进行，单因素实验条 件见表2 1 。 表2 1 酶解反应单因素实验条件表 t a b 2 - 1s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n to fe n z y m o l y s i s ( 2 ) 响应面优化酶辅助制备浓缩蛋白的工艺 在单因素试验的基础上，采用b o x - b e h n k e n 中心组合设计原理，对影响蛋白纯度的糖化酶添加量、 v i s c o 巧m e l 添加量、液料比、时间等因素，采用s a s 8 1 分析软件设计四因素二水平试验。 表2 2 试验因素水平及其编码表 t a b 2 2f a c t o r sa n dl e v e l sa n dc o d i n gt a b l e ( 3 ) 醇洗条件的优化 确定液料比7 不变，研究乙醇浓度、温度、醇洗次数以及每次醇洗时间对蛋白纯度的影响。 表2 3 醇洗单因素实验条件表 t a b 2 - 3s i n g l ef a c t o re x p e r i m e n to fa l c o h o ll e a c h i n g 2 3 3 分离蛋白的提取制备 2 3 3 1 蛋白质等电点的测定 称取一定量棉粕粉与去离子水按液料比1 0 混合，使用2m o l ln a o h 调整p h 至1 0 0 ，5 0 。