Lp-PLA2(人血浆脂蛋白相关磷脂酶A2)定量检测试剂盒ppt课件.ppt

人血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)定量测定试剂盒,中美合资天津康尔克生物科技有限公司,1,125,000+,受试者,在国际主流专业杂志和会议报告中，已有超过100项临床研究和综述分析的结果支持Lp-PLA2作为一个心血管疾病的标志物在传统危险标志物的基础上提供了新的信息,国际研究一致结果,2,国际权威指南一致推荐,2010ACCF/AHA无症状成人心血管风险评估指南可考虑对中等风险的无症状成人进行Lp-PLA2检测以进一步评估风险。,2011AHA/ASA卒中一级预防指南在未有心血管疾病的患者中检测炎症指标如hs-CRP或Lp-PLA2可以鉴别出有较高卒中风险的患者。,2012AACE高脂血症管理与动脉粥样硬化预防指南一些研究证明，在有必要进一步对患者进行风险评级时，Lp-PLA2检测比hs-CRP具有更高的特异性。,2012ESC欧洲心血管疾病预防临床实践指南对有复发急性血栓事件的高风险患者可以检测Lp-PLA2以进一步评估风险。,3,国内专家一致认可,“脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2)是血管内皮炎症的独立危险因子，也是目前检测血管内皮炎症的新指标。对心脑血管栓塞性疾病的预测、治疗和预后的判断具有重要意义。”,中华医学会心血管病学分会主任委员，著名心血管专家胡大一教授,中国工程院院士，美国心脏病学院院士，著名心血管专家张运教授,“脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2)已成为AS抗炎治疗的新靶点，初步研究发现通过抑制磷脂酶A2，可以减少血管壁脂质的沉积和巨噬细胞的浸润。”,摘自动脉粥样硬化不稳定斑块的研究进展,摘自2012中国脑卒中大会主题论坛报告,4,临床一线期待已久,“心血管医生最关心的一点就是高危患者心血管事件发生风险。如果能够早期预防，在发生重大事件之前把危险控制住，那就可以减少病死率。但目前临床常用的检测指标如肌苷激酶等出现时为时已晚，而脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测为临床提供了一个预警及风险评估的有力工具。”北京大学第三医院心内科主任高炜,“现有的检验指标如胆固醇、LDL、HDL确实在心血管疾病风险评估方面发挥一定作用，但并不全面。甚至有些方法如血小板活化检测还不够稳定。因此实验室迫切需要一个方法稳定、特异性强又独立于胆固醇之外的风险评估方法，而脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测就提供了这样一个方法。”中国医师协会检验医师分会会长丛玉隆,“我国一年心外科手术量已达到18.5万例，但还远不能满足我国患者需要，原因就在于我国心血管疾病发病率太高，每年新增冠心病患者300万。因此预防的作用比治疗更重要，并且其社会效益要远高于手术。而脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测为心血管疾病预防提供了一个有力武器。”中国医师协会心脏外科医师分会副会长孙立忠,5,2011.7.16北京钓鱼台国宾馆,6,国家863高科技成果中国首家和唯一上市产品,中国首家和唯一上市产品国家863科技攻关项目高科技成果快速监控和预测心脑血管栓塞性疾病填补中国心脑血管疾病快速预警检测的空白与会专家：中国人民解放军总后卫生部原副部长陈新年广东省卫生厅副厅长耿庆山中国医药生物技术协会副会长于修成科技部火炬高技术产业开发中心处长雷庆西中国医师协会心脏外科医师分会副会长孙立忠中国医师协会检验医师分会会长丛玉隆北京大学第三医院心内科主任高炜北京大学首钢医院心血管医学中心主任王宏宇卫生部北京医院心内科主任许峰,7,心脑血管疾病是造成人类死亡的主要病因,恶性肿瘤,心脏病,脑血管病,呼吸系统疾病,来源：2012中国卫生统计年鉴,来源:美国国家健康中心2012年统计数据,8,心脏猝死：经常是首次心脏病爆发,MyerburgRJetal.Circulation.2012;125:1043-1052,9,研发背景,动脉粥样硬化（AS)是造成心脑血管疾病的主要原因AS是一种炎症反应性疾病在粥样斑块形成、进展和最终破裂的过程中均有炎性介质的参与寻找一个能够反映这种动态变化过程的炎性介质就能够检测并跟踪动脉粥样硬化的严重程度目前脂蛋白相关磷脂酶A2（Lipoprotein-AssociatedPhospholipaseA2，Lp-PLA2)已被国际专家公认为一种新的炎性反应标志物,10,内容,心脑血管疾病现状及研发背景Lp-PLA2与动脉粥样硬化的关系临床研究临床意义康尔克Lp-PLA2定量检测试剂盒简介产品详解与注意事项,11,Lp-PLA2,脂蛋白相关磷脂酶A2，英文缩写Lp-PLA2。又称血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）。分子量为45KDa。由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎性介质的调节。水解ox-LDL-C上的磷脂，生成促炎物质lyso-PC和ox-FA，因此具有促炎症和促动脉粥样硬化的作用。,12,Lp-PLA2在粥样斑块形成中的作用,粥样斑块形成,血管腔,氧化型LDL,内膜,中膜,溶血卵磷脂氧化脂肪酸,泡沫细胞,单核细胞,粘附分子,巨噬细胞,细胞因子,13,稳定斑块vs易损斑块组织学特征对比,小型坏死脂质池,血栓,大型坏死脂质池,稳定斑块Lp-PLA2含量较低(深色染色)纤维帽厚，胶原含量高小型坏死脂质池炎症程度较轻,易损斑块Lp-PLA2含量较高(深色染色)纤维帽薄，胶原含量低大型坏死脂质池炎症程度较重,CorsonMAetal,AmJCardSuppl2008:101(41F-50F),14,斑块易损性与其Lp-PLA2含量成正比,Lp-PLA2染成棕红色,早期斑块出现脂质池,稳定斑块纤维帽变薄，出现小型坏死脂质核,易损斑块薄纤维帽,破裂斑块血管中出现血栓,KolodgieF,etal.ArteriosclerThrombVascBiol2006,血栓,15,25已发表研究结果显示:Lp-PLA2升高导致心血管事件风险加倍,Packard(WOSCOPS),NEnglJMed2000CHDBlake(WHS),JAmCollCardiol2001CHDBlankenberg(AtheroGENE),JLipidRes2003-CADBallantyne(ARIC),Circulation2004-CHDLDL0.05,BallantyneCM,etal.AHA2004BergerK,etal.Stroke1998TanneD,etal.Circ.2001,4.BowmanTS,etal.Stroke1998OeiHH,etal.Circ.2005WannametheeSG,etal.Stroke2000,24,传统风险因子在冠心病患者中的流行程度,KhotUM,etal.JAMA2003.,62.4%冠心病患者仅含有0-1个传统风险因子,25,Mayo研究:利用Lp-PLA2预测心梗后生存期,0.0,3.0,4.0,5.0,6.0,1.0,2.0,5.4*,2.2,1.0,166ng/mL,167-218ng/mL,219ng/mL,*p0.001aftermultivariateadjustmentforage,sex,hypertension,BMI,diabetes,smoking,LDL-C,GerberY,etal.ArteriosclerThrombVascBiol2006,HazardRatio,发生MI后，高水平Lp-PLA2患者1年内死亡风险是低水平患者的5倍,26,Mayo研究：利用Lp-PLA2预测冠心病患者主要心血管事件发生率,95%的Lp-PLA2200ng/ml患者4年内未发生心血管事件,BrilakisESetal.MayoHeartStudy.EuroHeartJ2005,27,北曼哈顿卒中研究(NOMAS)：利用Lp-PLA2预测卒中复发风险,复发性卒中事件N=80,其他心血管事件N=122Adjustedfordemographics,traditionalriskfactors,strokeseverity,andbothmarkers,ElkindMS,etal.ArchIntMed2006.,Lp-PLA2升高，卒中复发风险加倍,28,一级预防对急性冠脉综合征的预测评价,经冠脉造影证实无冠脉狭窄者(对照)28例、急性冠脉综合征(ACS)27例、稳定型心绞痛(SAP)28例。检测血浆Lp-PLA2水平。组别例数Lp-PLA2(ng/ml)急性冠脉综合征(ACS)27706.00149.91*稳定型心绞痛(SAP)2427.7544.58*无冠脉狭窄者(对照组)28267.6992.67注:与对照组比较*P0.001,陈锦峰,等.广东医学2011;32(10):1263,29,二级预防对进展性脑梗死的预测评价,168例急性脑梗死(ACI)患者每天进行NIH卒中量表(NIHSS)评分，其中进展性脑梗死40例，稳定性脑梗死128例。检测血浆Lp-PLA2水平。组别例数Lp-PLA2(g/L)ACI组16812.0587.104*进展性脑梗死组4017.30410.630*稳定性脑梗死组12810.4194.576正常对照组727.2683.112注:与正常对照组比较*P0.01;与稳定性脑梗死组比较P0.01,王磊,等.临床神经病学杂志2011;24(4):309.,30,病情评估对神经功能损伤程度的评价,选择动脉硬化性脑梗死(ACI)患者128例和未卒中对照者88例为研究对象，检测血浆Lp-PLA2的水平。按NIH中风量表(NIHSS评分)进行神经功能缺损程度评估。分析神经功能缺损程度与血浆Lp-PLA2水平相关性。结果r=0.829，P=0.001。组别例数Lp-PLA2(g/L)轻型梗死组3253.455.47*中型梗死组6665.686.07*重型梗死组3077.115.12注:与重型梗死组比较*P0.05,梁江红,等.实用医学杂志2009;25(14):2264.,31,疗效评价不同剂量阿托伐他汀治疗急性脑梗死,选择急性脑梗死患者86例，随机分为2组：阿托伐他汀常规剂量组43例：20mg/天，大剂量组43例：40mg/天，分别于治疗前及治疗14天后测量患者血浆Lp-PLA2水平。另选择43例健康体检者为对照组，不予阿托伐他汀治疗。阿托伐他汀治疗前后血浆Lp-PLA2(g/L)变化的比较常规治疗组大剂量组对照组急性脑梗死组治疗前治疗后治疗前治疗30.522.9143.955.70#44.226.2537.634.53*43.695.1635.634.16*注:治疗前和治疗后比较*P175ng/ml,4.0mmol/L,3.3mmol/L,2.5mmol/L,1.8mmol/L,测试测量中高危患者的Lp-PLA2水平,治疗达到合适LDL-C水平,35,产品组成及安全性,本试剂盒中采用的试剂都不具有毒性、致畸致突变性，也不含有人血液制品，因此不具有生物学危害，但仍需作为一般生物试剂加以防护。,36,检验原理ELISA,37,样品处理,样品收集、处理和保存：血浆：用EDTA抗凝管取血2ml，1500r/min离心10分钟，收集上清液。血清：用普通管或促凝管取血2ml，4下放置30分钟后，1500r/min离心10分钟，收集上清液。保存:血浆（清）如不即时检测，则须于-20保存，并避免反复冻融。,38,操作方法,1）从冰箱中取出试剂盒，室温平衡20min，将标准品离心，1000r/min，1min2）分别加入80ul稀释液（1倍)和20ul待测样品或标准品于反应孔内,混匀,37温育20min3）弃去孔内液体，每孔加300ul洗液(1倍），振荡20-30sec后弃去洗液，重复4次，拍干残液4）加入100ul酶标记物，混匀，37温育30min5）重复步骤3）6）每孔加入显色液100ul，混匀，37温育20min，避光7）加入50ul终止液8）立即用酶标仪在450nm条件下测定各孔OD值9）以OD值为纵坐标（Y），相应Lp-PLA2标准品浓度为横坐标（X），制作标准曲线10）根据样品的OD值计算得出样品的Lp-PLA2含量,39,检验结果的解释,对临床的检测结果进行统计分析之后，175ng/ml以下正常,175ng/ml以上为危险。如样本的Lp-PLA2的含量低于临界值，则视为正常；如高于临界值则提示为其动脉可能有粥样硬化炎症，且炎症与Lp-PLA2的含量成正比。,40,产品性能指标,剂量-反应曲线的线性用logistic数学模型或其他数学模型拟合，剂量-反应曲线相关系数（r）应不低于0.9900。,r2=0.99998,r2=0.97917,41,准确性试剂盒标准品与相应浓度的企业校准品同时进行分析测定，用logistic数学模型或其他数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行（t检验，t2.447），以企业校准品为对照品，试剂盒标准品的实测值与标示值的效价比的平均值应在0.9001.100范围内。灵敏度试剂盒的最小检测值10ng/ml。,产品性能指标,42,精密度批内变异度（CV%）和批间变异度（CV%）均应不高于15.0%特异性以试剂盒测定下列物质，测定值应符合要求：人血清白蛋白（浓度60mg/mL）、癌胚抗原(浓度100ng/mL），在本试剂盒上的测定结果OD值应不高于0.10。稳定性试剂盒在2-8条件放置6个月，检测结果应符合上述几项要求。,产品性能指标,43,开封/瓶后，酶联反应板放入铝箔袋中封口干燥