（微生物学专业论文）粟酒裂殖酵母中programmed+cell+death+2_c蛋白功能的研究.pdf

摘要a b s t r a c t 摘要 舢舢幽舢舢m j j j f 册删 y17 , , 2 , , , j lp6fi , , i 6 l l l l 10l r l l i,2ii i i i 。 背景：凋亡是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在清除 无用的、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。最早对 p r o g r a m m e dc e l ld e a t hp r o t e i n2 ( p d c d 2 ) 研究发现该蛋白可能参与细胞凋亡。 但随着对其研究的深入，发现该蛋白似乎与细胞凋亡无关，但是和细胞的发育， 细胞周期以及某些疾病有一定的联系。p d c d 2 蛋白具有一个重要的功能结构域 一p d c d 2 _ c 结构域。将带有p d c d 2 一c 结构域的蛋白都归为p d c d 2 _ c 蛋白。调查发 现p d c d 2 一c 蛋白似乎只存在真核生物细胞中。并且这类蛋白由看家基因编码，在 人和小鼠各个组织都有表达。在裂殖酵母中存在两个p d c d 2 一c 蛋白： s p a c l 3 g 6 0 9 ，p d c d 2 的同源蛋白本文中命名为p o d l ；s p b c 2 5 h 2 1 5 ，芽殖酵母 p d c d 2 一c 蛋白( 硒膨) 的同源蛋白本文中命名为p c d 2 0 这两个蛋白在裂殖酵母中 的功能还未有报道，本文主要探究这两个p d c d 2 蛋白的功能。_c 实验和结论：1 首先用同源重组和随机孢子分析法，证明了裂殖酵母中p c d l 为必需基因，p c 以为非必需基因。这提示这两个p d c d 2 一c 蛋白在裂殖酵母中的 功能可能不同。接着用高表达和低表达的p c d l 的质粒，都能救活因敲除p c d l 致 死的单倍体。直接敲除裂殖酵母单倍体p c d 2 , 敲除菌株能正常生长。这两个实 验都再次证明p c d l 为必需基因，p c 以为非必需基因。 2 用高表达和低表达n 端带2 个f l a g 标签p c 棚的质粒都能救活敲除p c 以的 单倍体。但是用高表达的人p d c d 2 、芽殖酵母t s r 4 , n 端为p c 棚，c 端为人p d c d 2 蛋白p d c d 2 一c 结构域的融合蛋白、裂殖酵母p c d 2 和c 端带5 个f l a g 标签p c d l 的质粒都不能救活敲除了p c d l 的单倍体。这些实验提示：n 端2 个f l a g 标签对 p c d l 的定位和功能没有太大影响；人和芽殖酵母的p d c d 2 一c 蛋白与裂殖酵母p c d l 功能不同，也有可能在裂殖酵母中p c d l 还有其他必需功能；人p d c d 2 _ c 结构域 也不能替代裂殖酵母p d c d 2 c 结构域，可能因为人p d c d 2c 结构域替代裂殖酵母 的结构域后整个蛋白的空间结构遭到破坏，导致蛋白功能丧失；p c d l 和p c d 2 功 能不同；c 端的5 个f l a g 能破坏p o d l 的空间结构导致蛋白功能丧失或者5 个f l a g 阻碍了p c 棚与其相互作用蛋白的结合。 3 敲除p c d 2 的单倍体在面对逆境压力时，生长状态和野生型几乎一致。这表 示p c d 2 在裂殖酵母的应对逆境过程中没有必需的作用。 4 利用酵母双杂交系统中的筛选，与p c d l 和p c d 2 相互作用的蛋白。发现m o e l 和4 0 s 蛋白r p s 2 6 0 2 片段可能和p c d l 相互作用。而s p a c l 0 9 3 0 5 ( a t p d e p e n d e n t r n ah e l i c a s eh c a 4 ) 的片段可能与p c d 2 相互作用。但是验证上述蛋白全长是否 摘要a b s t r a c t 和p c d l 和p c d 2 相互作用时，都未能检测出相互作用。利用该系统仍未检测了 p c d l 和s p a c l 0 0 2 1 4 ( 裂殖酵母中泛素化连接酶z 3 ) 相互作用。 5 双敲除p c d 2 和g c n 5 的单倍体不能存活。但是双敲除p c d 2 和s t y l 后单倍 体生长和敲除p c d 2 的单倍体生长状态几乎一致二这提示p c d 2 和g c n 5 有可能存 在一定的联系，或者共同参与了某种信号传导途径；而s t # 可能不是p c d 2 的磷 酸酶。 关镁t i r , q 粟酒裂殖酵母，p d c d 2 一c 蛋白，功能研究 摘要a b s t r a c t 一一一 a b s t r a c t b a c k g l r o u n d ：a p o p t o s i si sa l la u t os u i c i d em e c h a n i s mt h a tc a l lc l e a nt h eu s e l e s s ， p l u s ，c a r c i n o m a t o u s c e l l st ok e e p 也eo r g a n i s m sb a l a n c e 。a tt h ee a r l y s ts t a g e , i p r o g r a m m e d c e l ld e a t hp r o t e i n2 ( p d c d 2 ) w a sr e p o r t i n v o l v e di nt h e a p , o p t o s i s h o w e v e r , t h e r ea l e m o r ea n dm o r ed a t at os h o wt h a tt h i sp r o t e i ns e e m sn o t h a y ec o n n e c tw i t ha p o p t o s i sb u tt h ed e v e l o p e m e n ta n dt h ec y c l eo fc e l l w h a tm o r e ， t h em u t a n t so ft h i sp r o t e i ni ss e e m sf o rt h ec a u s eo fs o m ed e s e a s e s p d c d 2o w n so n e i m p o r t a n td o m a i nf o r i t sf u n c a t i o n - p d c d 2 _ cd o m i a n t h i ss t u d ys o r ta l lt h ep r o t e i n s w 1 1 i c hl 刖et h i sd o m a i nt ot h ep d c d 2 一cp r o t e i n w ec a no n l y f r e dp d c d 2 一c p r o t e i ni ne u k a l y o t i co r g a n i s m t h i sg e n ei sl i k et ob ea h o u s e k e e p i n gg e n e ，b e c u s e i t sp r o t e i nc a nb ef r e di ne v e r yt i s s u eo fh u m a na n dm o u s e t h e r ea r et w op d c d 2 一c p r o t e i n si ns c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ：s p a c l 3 g 6 0 9 ，t h eh u m a n p d c d 2 o r t h o l o g ， n a m e dp c d li nt h i ss t u d y ；s p b c 2 5 h 2 15 ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a et s r 4o r t h o l o g , n a m e d p c d 2 i nt h i ss t u d y t h ef u n c t i o no ft h e s ep r o t e i n sc a i l tb ef i n d , ，s ot h i ss t u d yt r y t oe x p l o r et h e i rf u n c t i o n t e s i s & c o n c l u s i o n ：1 w ec e r t i f i c a t et h a tp c d li sae s s e n t i a lp r o t e i na n dp c d 2i s n o n e s s e n t i a lb yt h em e a n so fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n k n o c k o u ta n da n d t e a b a n t - s p o r ea n a l y s i s w er e s c u et h ep c d l as t a i nw i t ht h em 曲a n dl o we x p r e s s i o no f p c d is u c c e s s f u l l y , a n dt h ek n o c k o u to f p c d 2 i nh a p l o i d , 。f i s s i o ny e a s tc a ns t i l ll i v ea s n o r m a l l y t w oo ft h ea b o v e t e s t sc a np r o v et h ec o n c l u s i o na g a i n 2 b o t ho ft h eh i 曲a n dl o we x p r e s s i o no f p c d lw i t ht w of l a gi ni t sn t e r m i n a lc a n r e s c u et h eh a p l o i dw i t h o u tp c d l t h ep d c d 2 ( h t t m a n ) ：，t s r 4 ( p d c d 2 _ cp r o t e i n i n b u d d i n gy e a s t ) ，f i s s i o np r o t e i n ( nt e r m i n a lo fp c d la n dc t e r m i n a lo fp d c d 2 ) ，p c d 2 a n d 口c d f i s s i o nw i t h5f l a gi nce n d i n g i sh i g he x p r e s s i o nc a n ts a v et h eh a p l o i d w i t h o u tp c d l t h ea b o v et e s t ss h o wt h a t ：t h e2f l a g a tt h ent e r m i n a lh a v en o j n 日u e n l c et ot h ea c t i v a t i o no fp c d l t h ep d c d 2 一cp r o t e i n si nh u m a na n db u d d i n g v e a s th a v ed i f f e r e n tr o l e st ot h ef i s s i o ny e a s t w h a t sm o r e ，t h ep d c d 2 一cd o m a i n s h a v eb i gg a pb e t w e e nh u m a na n df i s s i o ny e a s t 5f l a ga tt h ece n d i n gi sd e s t o r yt h e f u n c a t i o no f p c d l 3 t h e h a p l o i dw i t h o u tp c d 2 l i v ea sw e l la sw i l dt y p ei ns o m ei n a p t i t u d e s u r r o u n d i n g t h i sc l u et h a tt h ep c d 2p r o t e i nh a sn oc o n n e c t w i t ht h em e c h a n i s mf o r t h ea g a i n s tt h eu n p l e a s a n tc o n t e x t 4 s c a l lt h ee d n al i b r a r yo ff i s s i o ny e a s tb yy e a s tt w oh y b r i ds y s t e m w ef i n ds o m e c a n d i d a t e s p a r to fm o e la n dr p s 2 6 0 2s e e mi n t e r a c tw i t hp c d l ，a n ds p a c l 0 9 3 0 5 s 3 一 p a r tw i t hp c d 2 h o w e v e r , w h e nw ec o n f i r mt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n t h et o t a ll e n g t ho f c a n d i d a t e sa n dt h ep d c d 2c p r o t e i n , a 1 1o f t h et e s t sf a i l 5 k n o c k o u tt h ep c d 2a n dg c n 5 ，t h eh a p l o i ds t r a i nc a n ts u r v i v a l ，a n dt h ed o u b l e k n o e k o uo f p c d 2a n ds t y lh a v en oi n f l u e n c et ot h es t r a i n sl i v ec o n d i t i o n t h i si n f o r m s t h a tg c n 5m a yh a v es o m ei n t e r a c t i o no rc o n n e c t i o nw i t hp c d 2 ，a n ds t y lw o u l dn o tb e t h ep h o s p h o t a s et op c d 2 k e yw o r d s s c h y z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e , p d c d 2 _ cp r o t e i n ，r o l e se x p l o r a t i o n 4 第一章 第一章绪论 1 p d c d 2 一c 蛋白研究进展 1 9 9 1 年o w e n s 等人报道，在大鼠未成熟的胸腺细胞用伽马射线处理时( 诱导 细胞凋亡) 发现r p 一8 蛋白( p d c d 2 一c 蛋白) 表达量在1 小时内升高数倍，因此 作者认为r p 一8 蛋白参与细胞的凋亡过程n 3 。这是p d c d 2 一c 蛋白第一次被报道。 此后对于p d c d 2c 蛋白的研究开始展开。 但是m e l l o 及其同事在1 9 9 3 年报道：尽管r p 一8 在小鼠的胚胎交感神经元和分 化p c i 2 细胞中有表达，但是在诱导这些细胞凋亡的过程中该蛋白的m r n a 量却没 有变化。作者提出r p 一8 可能没有参与细胞凋亡晗1 。此后澳大利亚科学家v a u x 等 发现在小鼠的淋巴和骨髓细胞的凋亡过程中表达量也并没有变化，作者也得出 r p 一8 蛋白并不是真正参与细胞的凋亡结论b 1 。同年，日本东京癌症研究所的t k a w a k a m i 等人从胎儿肺的c d n a 文库中分离得到了人细胞中的p d c d 2 一c 蛋白，他 们命名为p d c d 2 ( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h 一2 ) 。该蛋白由开放阅读框长度为1 0 3 2b p 编码3 4 4a a 。并且这个p d c d 2 的核苷酸序列和蛋白序列与鼠源的p d c d 2c 蛋白， r p 一8 的核苷酸序列和蛋白序列分别有8 1 和8 3 的一致性。并且利用f i s h ( 荧光 原位杂交) 实验证明该基因位于人染色体带的6 q 2 7 位置上，见图1 - 1 ，该位点通 常在急性非淋巴细胞性白血病人细胞中发生染色体易位。6 q 2 7 还是其他疾病， 如胰岛素依赖性糖尿病，全身性红斑狼疮的易感区域。不仅如此，英国曼彻斯特 大学的h i n k s 等人报道( 大会报告) ，他们利用s n p 分析发现：p d c d 2 是自体吞 噬疾病一类风湿性关节炎的易感基因。 图卜1 原位荧光杂交实验 4 作者利用原位荧光杂交技术发现p d c d 2 位于人染色体6 q 2 7 ，箭头所指为检测出p d c d 2 在 染色体上位置。 第一章 此后对p d c d 2 - c 蛋白的研究热点从老鼠细胞扩展到了人细胞。b a r o n 等报道人 细胞中p d c d 2 能被b c l 6 蛋白抑制。b c l 6 是一个转录抑制蛋白，其基因位于3 q 2 7 ， 在b 细胞淋巴瘤细胞中该位点通常发生易位。b c l 6 通过联合n - c o r ，s m a t m ，m s i n 3 a 和b c o r 抑制组蛋白脱乙酰基酶的活性，降低了p d c d 2 的表达量嘲。最近k u s a m 等发现在b 细胞中高表达b c l 6 也明显的降低了p d c d 2 的表达量，见图i - 2 。这 也支持b c l 6 能抑制p d c d 2 的表达量，说明b c l 6 起着调控p d c d 2 在人细胞的含量 作用，作者发现降低了p d c d 2 在人细胞的含量有利于经历转化后细胞的存活1 。 正常细胞中p d c d 2 相对表达量 删曩- 妻羹眦6 绷中一相对 图1 - 2p i ) c d 2 在b 细胞中表达量 6 作者用正常细胞的表达量为对照，检测了高表达b c l 6 细胞p d c d 2 表达量 第一章 半部分为实验结果。 t r a c h t u l e c s 实验室在1 9 9 7 年发现：位于小鼠1 9 号染色体上的r p - 8 基因和 t a t a - b i n d i n gp r o t e i n ( t b p ) 以及p r o t e a s o m a ls u b u n i tc 5 ( p s m b i ) 蛋白基因存 在线性关系。而且这种线性关系在人6 号染色体上也是保守的西1 。这发现提示这 种基因间保守的线性关系可能在脊椎动物染色体上是保守的。之后该实验室有分 析了其他物种中是否也存在这种保守的线性关系。2 0 0 1 年，他们报道在蛇，果 蝇，线虫，裂殖酵母中这种线性关系也很保守。并且他们还根据已经报道了序列 的p d c d 2 一c 蛋白的m p 进化树，见图卜4 n 伽。 9 5 8 8 a r a t 9 7 41p d c d 2 ( m u d o1 7 p d c d 2 ( h o s a6 q 2 7 砖蠹笛 l _ 一o l 3 g 6 0 9 b c p o1 ) 图卜4 根据蛋白序列构建的肝进化树 i 0 3 删d o 为小鼠p d c d 2 ，h o s a 为人p d c d 2 ，d r m e 为果蝇r p 一8 ，c a e l 为线虫p d c d 2 ，s c p oi ，1 1 分别为裂殖酵母中p c d l 和p c d 2 ( 正是本文研究对象) ，s a c e 为芽殖酵母p d c d 2 ( 7 酗硒，a r a t 为拟南芥p d c d 2 。 在接下来的工作中该实验室调查了更多脊椎动物的基因组，发现p d c d 2 、t b p 和p s m b l 基因在这些脊椎动物中也存在保守的线性关系，见图1 - 5 。这更加证 明了该保守的线性关系在不同物种中都存在。特别是p d c d 2 在这些物种中都是尾 靠尾。不仅如此，作者还发现在人和鸡的细胞中存在不同长度的p d c d 2 的m r n a 。 作者推测该保守性出现的原因可能是这几个基因形成一个m a t r i x a t t a c h e d r e g i o n s ( m a r s ) ，该结构域在进化上存在保守性。也有可能这三个基因的共用正 常转录过程中必需的调节因子。或者这三个基因分别编码一个信号途径的不同组 分，而这种线性关系保证了不同组分相互匹配的对等性n 1 1 。 第一章 h u m a n 6 q 2 7 m o 恤姆1 7 c h i c b n3 q 2 s n a k e f 啦i u 虹t c r pdcd2tbp p s 越b 1 a l 0 31 2 5 9 p r d m 7 送遘卜i 卜- i l - i 叫一 a c 0 9i 5 6 g i v p a t ， d 1 3 1 7 8 2 c o n t t g st 0 8 9 6 , 2 9 0 0 6 a l 7 7 2 3 8 8 c t 9 2 0 5 7 9 图卜5p d c d 2 、t b p 和p s m b l 基因在各个物种中基因位置关系示意图 1 1 从上到下物种分别为：人、小鼠、鸡、蛇、河豚、绿河豚、斑马鱼 此后，t r a c h t u l e c s 等人将重点放在小鼠身上。作者首先发现尽管m r n a 长度 不同，但p d c d 2 在各个组织中的表达都有表达，见图卜6 。因此他们认为p d c d 2 可能为看家基因n 2 1 。 4 o o 3 2 0 2 4 0 1 6 0 o 8 0 d o o k i d n e y h e a r t l i v e rb r a i n l u n gs p l e e n t e s t e s 名p d c d 2 c o n s l 心p d c d 2 a l t 彩a n t i s b o t h 心p d c d 2 a s 2 图卜6 小鼠肾，心，肝，脑，肺，脾，睾丸中不同长度的p d c d 2 表达量 1 2 3 接着他们发现在各个生长阶段，p d c d 2 表达量也有变化，见图卜7 。这个表达 量的变化说明p d c d 2 很有可能和动物发育有关蚴。 1 1 第一章 p d c d 2 一c o n s t b - a c t in 心p d c d 2 一a l t 1 3 一a c t i n 名a n t i s b o t h p - a c t i n 心p d c d 2 a s 2 1 3 一a c t i n 麓t b p a , 1 3 - a c t i n 图卜7 小鼠睾丸细胞中在各个生长时期p d c d 2 相对于b - a c t i n 的表达量 1 2 2 0 0 5 年，英国研究人员报道，他们应用m ic r o r r a y 和r t - p c r 分析慢性疲乏 综合征患者的外周血单核细胞，发现p d c d 2 的表达量较正常人的外周血单核细胞 上升数倍n3 l 。这提示p d c d 2 的高表达可能与该疾病的发生有关联。 上面的报道发现或提示p d c d 2 一c 蛋白在人和小鼠细胞中，可能与发育相关n 2 1 ， 也可能与某些疾病有关h 13 1 。而非最早发现与凋亡有关n 1 。这引起了更多科研工 作者的兴趣。很多揭示p d c d 2 一c 蛋白功能的工作纷纷展开。 2 0 0 5 年浙江大学陈秋报道：他们发现人细胞中有三种p d c d 2c 蛋白，p d c d 2 i s f o r m l 、p d c d 2i s f o r m 2 、p d c d 2 l ( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h2 - 1 i k e ) 。其中p d c d 2 l 蛋白第一次被报道，该蛋白与人中其他的p d c d 2 一c 蛋白相比缺少n 端的z f m y n d 结构域，见图卜8 4 】。这提示p d c d 2 l 可能与p d c d 2 功能不相同，因为根据上面数 据看出，p d c d 2 很多时候通过n 端的z f m y n d 结构域调节下游蛋白功能叶1 。 ：o：，j10二“o0 ；n f：e 乎 一i i ii i l ： ”e j 1 ；：1 1 一：二。1 7 ：二t 】“ ：0 0 隧缓麓笼汹 卫遵匿e 二 图卜8n c b ic o n s e r v e dd o m a i n 构建的各个蛋白结构域示意图 1 4 第一章 除此，作者还发现p d c d 2i s f o r m l 与i n t e r l e u k i n - 2 ( i l - 2 ，白细胞介素- 2 ) 有 一定的联系。因此他们推测p d c d 2i s f o r m l 可能与参与消炎过程。 该实验室发现在患i i 型糖尿病( 该类型的糖尿病对胰岛素有抗性) 小鼠的肾细 胞中p d c d 2 l 表达量升高。这与之前相关报道结果比较一致：在i i 型糖尿病人的 骨骼肌细胞中，p d c d 2 l 表达量较正常人的高出数倍n 6 1 。并且他们在人的胚肾 2 9 3 t 、h 5 、b 1 2 细胞中高表达p d c d 2 l ，发现细胞被抑制在s 期，见图1 - 9 。接着 作者发现p d c d 2 l 在各个组织中都表达，这提示该基因也是一个看家基因。并且 调查了各个组织中该蛋白的表达量，发现该蛋白在肺，结肠，乳腺，子宫颈，胃， 小肠中表达量较高n 副。 8 0 7 0 ：6 0 0 5 0 = 4 0 33 0 _ 2 2 0 1 0 o e ：se 2 图卜9 在h e k 2 9 3 t ，h 5 ，b 1 2 细胞高表达p d c d 2 l 后处于各个时期细胞比例 1 9 2 0 0 7 年，他们又报道称，用脂多糖处理d a u d i 细胞( 非洲淋巴瘤细胞) 后 发现，p d c d 2 l 表达量升高而p d c d 2 的表达量降低。在用脂多糖处理d a u d i 细胞 时，细胞会表达t n f - q ( 肿瘤坏死因子) 。在处理的细胞中高表达p d c d 2 l 能抑 制t n f q 表达，但能提高p d c d 2 和i l 一6 ( 白细胞介素) 的表达量。不仅如此， 高表达该蛋白还能抑制转录因子：a p - i ，c r e b ，n f a t ，n 卜k b 的转录活性，提高 s t a t l ( 信号转导子及转录激活子) 的活性。以上这些证据都表明p d c d 2 l 参与细胞 的消炎反应n 刀。此外在陈秋的博士论文中，p d c d 2 l 通过p d c d 2结构域与自身 和 相互作用形成同源或异源多聚体n 羽发挥功能。_ c p d c d 2 i s f o r m l 在常染色体隐性遗传性帕金森症病人的黑质细胞中，由于泛素连接酶e 3 的突 变，导致该蛋白不能将p d c d 2 泛素化，进行正常的蛋白降解。f u k a e 等人利用酵 母双杂交系统检测到p d c d 2 和e 3 的相互作用，并在细胞能证明了p d c d 2 是e 3 的底物以及e 3 是p d c d 2 正常降解的必需蛋白之一n 。 综上所述，p d c d 2 _ c 蛋白在小鼠和人中各个组织都有表达，很有可能是一个看 家基因。此外越来越多的证据表明，p d c d 2 _ c 蛋白的功能与凋亡没有关系，而与 各种疾病或发育相关。 此外对p d c d 2 _ c 蛋白在果蝇和芽殖酵母细胞中功能也有了相关报道。2 0 0 7 年， 一t 一 一g 一9 一2 一 一k 2 一 一疆髓m 一 一0 口一 第一章 d e v e l o p m e n t 杂志上一篇文献对果蝇细胞中p d c d 2c 蛋白( z f r p - 8 ) 的功能进行 了报道。作者发现z f r p 8 不仅是果蝇造血过程是必需的，该蛋白还与p a n n i e r ( 一 种g a t a 转录因子) 相互作用共同参与淋巴腺的发育 2 0 l 。2 0 0 9 年，z h i h u al i 在 他的文章中称发现芽殖酵母中p d c d 2 一c 蛋白( t s r 4 , y o l 0 2 2 c ) 在细胞的2 0 sr r n a 加工有关，该蛋白可能参与2 0 sr r n a 聚集雎。此外，在线虫全基因组的相互作 用调查中发现，线虫的p d c d 2c 蛋白( r 0 7 e 5 i 0 ) 与c l k - 2 ( b i o l o g i c a lt i m i n g a b n o r m a l i t yf a m i l ym e m b e r ) ，d a f 一2 ( a b n o r m a ld a u e rf o r m a t i o nf a m i l y m e m b e r ) ，e g l 一1 5 ( e g gl a y i n gd e f e c t i v ef a m i l ym e m b e r ) ，l e t 一2 3 一7 5 6 ( l e t h a l f a m i l ym e m b e r ) ，p r y 一1 ( p o l y r “f a m i l ym e m b e r ) 相互作用口2 1 。在植物拟南芥 中，有两个p d c d 2 _ c 蛋白：a t 5 g 6 4 8 3 0 ( n 端没有z f - m y n d ， h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n e 8 3 6 6 0 6 ) ，a t 4 g 0 2 2 2 0 ( n 端有z f 州n d ， h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n e 8 2 8 1 0 6 ) 。从上面看出p d c d 2 _ c 蛋白单细胞 真核生物进化到多细胞真核生物时，功能发生了很大的变化。 查询n c b i 蛋白库，没有发现原核生物、古细菌和病毒中具有p d c d 2 _ c 蛋白。 因此推测p d c d 2 _ c 蛋白只在真核生物中存在。 1 2 粟酒裂殖酵母的介绍 粟酒裂殖酵母是继芽殖酵母之后又一个被广泛使用的真核模式生物；其细胞形 态呈单细胞杆状，细胞直径约3 - 4 i - t m ，长约7 - 14 p m 。粟酒裂殖酵母最先于18 9 3 年分离自东非的一种粟米啤酒中，并因当地斯瓦黑利人的啤酒名称( p o m b e ) 而 得名。 在分类学上，粟酒裂殖酵母( p o m b e ) 属于真核生物原界( e u k a r y o t a ) 、真 菌界( f u n g i ) 、双核菌亚界( d i k a r y a ) 、子囊菌门( a s c o m y c o t a ) 、外囊菌亚门 ( t a p h r i n o m y c o t i n a ) 、裂殖酵母纲( s c h i z o s a c c h a r o m y c e t e s ) 、裂殖酵母目 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e t a l e s ) 、裂殖酵母科( s c h i z o s a c c h a r o m y c e t a c e a e ) 、裂殖酵母 属( s c h i z o s a c c h a r m y c e s ) 。 将栗酒裂殖酵母发展为一种实验模型材料始于2 0 世纪5 0 年代，l e u p o l d 在遗 传机制以及m i t c h i s o n 在生长调控和细胞循环方面的研究。2 0 0 1 年，p a u ln u r s e 以粟酒裂殖酵母为模式生物研究细胞周期调控而与t i mh t m t 以及l e eh a r t w e l l 二起分获了当年的诺贝尔生理学与医学奖。 2 0 0 2 年，由英国桑格实验室( s a n g e ri n s t i t u t e ) 领导的科研团队完成了粟酒裂 殖酵母( p o m b e ) 的全基因组测序工作四】，这是继芽殖酵母( & c e r e v i s i a e ) 、 线虫( ce l e g a n s ) 、果蝇( nm e l a n o g a s t e r ) 、拟南芥( at h a l i a n a ) 和人( h o m o s a p i e n s ) 之后第六个完成全基因组测序的真核生物。 第一章 粟酒裂殖酵母的单倍体基因组大小为1 3 8 m b ，共编码了4 8 2 4 个开放阅读框， 这是已知最小的真核生物基因组；与芽殖酵母和其它的生物不同，粟酒裂殖酵母 基因组没有大范围的基因组重复。与芽殖酵母相比，粟酒裂殖酵母在进化上与人 更为接近。 粟酒裂殖酵母单倍体细胞有3 条相对较大的染色体，大小分别为5 7m b 、 4 6m b 、3 5m b ；这些染色体具有典型的高等生物染色体的特征，包括大的弥散 的复制原点( 约l k b ) 和大的着丝粒( 约4 0 1 1 0 k b ，c e r e v i s i a e 着丝粒大小仅 几百b p ) ；在粟酒裂殖酵母中有约1 4 5 个基因在后生动物中有同源基因，而在芽 殖酵母中则没有这些基因的同源基因；这些基因的编码产物大多参与染色体功 能，包括异染色质因子、染色质修饰基因、端粒蛋白、着丝粒蛋白等；因此，粟 酒裂殖酵母是特别合适的哺乳动物染色体生物学研究的模式系统；同样，由于其 杆状的外形和严格二等分裂的繁殖方式，使其在极性和细胞周期调控等方面的研 究是比芽殖酵母更为合适的模式生物。此外，在芽殖酵母中使用的绝大多数遗传 学工具在粟酒裂殖酵母中也可以应用，在两个系统中可以应用相似的遗传策略。 与芽殖酵母的这些显著的进化差异使得粟酒裂殖酵母受到了越来越多的关 注，也使其做为模式生物应用到了更多的研究领域，包括有丝分裂期和分裂间期 的微管动力学研究、d n a 复制的起始、有丝分裂和减数分裂重组、染色体的内 聚性与分离、肌动球蛋白相关的胞质分裂、d n a 的修复途径、营养传感的信号 转导、性别分化、减数分裂和孢子形成的复杂进程等方面。 第二章 第二章裂殖酵母中p d c d 2 一c 蛋白的生物信息学查询及分析 在裂殖酵母中有两个蛋白具有p d c d 2c 结构域：s p a c l 3 g 6 0 9 ( 本文中命名为 p c 棚和s p b c 2 5 h 2 1 5 ( 本文中命名为p c d 2 ) 。 2 1p d c d 2 _ c 蛋白的基本信息 在裂殖酵母的数据库( h t t p ：o l d g e n e d b o r g g e n e d b p o m b e i n d e x j s p ) 中 查询两个蛋白的信息结果如下。 p c d l 基因位于裂殖酵母i 号染色体上，开放阅读框：1 9 0 3 2 2 1 9 1 2 9 1 ，长度为 9 7 0 b p 。有一个内含子，外显子为1 9 0 3 2 2 1 9 0 5 8 4 ，1 9 0 7 3 0 1 9 1 2 9 1 。具有p d c d 2c 结构域，是人p d c d 2 的同源蛋白，芽殖酵母中没有同源蛋白，在真核生物中保守。 下面为其基因组序列( 下划线序列为内含子) ： a t g g 从g a t gt t g a t t t g g ga t t c c t t t c tc 从g 从从g ct c g a c g a a a aa g a c t a t c t g g a c a t c g a a tg c a g t a g a g tt 文g g t g c c t t c t t g 从t ga a t c c t t a g a 舢姐c t c g t t t 从c t c t g a 从t t t c g t a c c ac a g a a t a t t g c j 镪a c a g c a gg c t g g a c g a ga g g g t a a g t t c c t t t a t t c a t c a g a a a a a at g a t g c t g c t g a g t t t t t a at g c a a t t a t at g c a c c g 刖执 t a t a t a t t c at c a a c a g g g ac g g a g a c t c a a 从c a t t t a tt a g t a a a t c gt t t t a t a t t a g a c g a c t t g at g t c a a a a a aa t t a t t g g a tt t c g g a c c t aa t a t g t t t t tt g a a r c a c a t t g t 肌c c ag c a t t t a t c tt a a t t g t a c ta a c t t t a c a tt t a c t t a g t gt t a a a g t t t t t a g g g 从c a ag c t c g t g a a ac a g a t g a a a ta g a c t t t c a at t 从t t a c a tc a a 从g t 从c t a a a t t a a t tg a c t c t t c a ga a a t t g 从g tt g a t g c c g a ac c a a a a g a g ga a a a t a a a a a a g a a a t a c c gg a g 从g c t a a 从a a t g t a 从a g t a g a t a c tg a g a a t c c t tc c g c t g 从c c g t a t a c t a a ag c a a 从g g t ga t g t c t c a t tc c t g 从a t t tc a a a a a c g g ct t t c 从g a g c g c c t g a c c a aa t t a t g c g t t a t t a c c a t g cg a c t t c t a a tg a a t t t c c t gg t t t a t g g t g c a a t a a t g 从t g t a t a c c t tc a t c t a t a c cc a a t t g c g c tt g c g g a g c t aa a a g g c a g c t t g a a t t t c 从a t t t t a c c t ac t t t g a t a t c 从g t a t g 从ta t t g a t c a t tc t g c g a a a 从 t g c t c t g g a tt g g g g 从t a tt a t c t a t t t at g t t t g c t c tg c t t c g t g t ga t t t a g c c a a c t g c g g g c t gg c c g a a g 从ct t t g t t g g c tt c 从a c ，r ，r t tt c a g a g c a a gg a a t t a t a g c a c c t g 从t g a 其蛋白序列如下： m e d v d l g f l sq e k l d e k d y ld i e c s r v g g ap l f i r k n d 从f l n e s l e n s fe f l m q l y a p k n s e i s y h r i ly i f i n r d g d sq t a g w t r g ( v f r e q a r e t de i d f q l i t s kv t k l i d s s e i e v d a e p k e e nk k e i p e k l k nv k v d t e n p s ae p y t k a k g d vs f l k f q k r l s r a p d q i m r y y h a t s n e f p g lw c n n e c i p s si p n c a c g a k rq l e f q i l p t li s s m n i d h s ak n a l d w g i l s i y v c s a s c d la n c g l a e e l cw l q t f s e q g ii a p e 该蛋白有2 7 4 个氨基酸，分子量为3 1 0k d a ，等电点为4 5 ，电荷量- 1 3 5 。 p c d 2 基因