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浙江工商大学硕士学位论文 鲛觫鱼皮硫酸皮肤素的提取、纯化、结构和活性研究 摘要 本文旨在建立从鲅鲸鱼皮中提取、纯化硫酸皮肤素( d s ) 的方 法，并对其结构和抗凝血活性进行研究。为觖觫鱼皮的利用与硫酸皮 肤素的开发提供理论依据。 鲛鲸鱼皮硫酸皮肤素的提取采用酶解法，通过正交试验法和响 应面分析法对提取参数进行优化，得到最佳提取工艺如下：鲛艨鱼皮 原料加入2 5 的复合酶( 木瓜蛋白酶：胰酶- - - - l ：2 ，w w ) ，按液料 比2 6 ：l ( v w ) 加入蒸馏水，7 6 下提取1 9 小时，3 倍体积乙醇沉 淀，冷冻干燥后得到粗品。 采用三氯乙酸( t c a ) 法、s e v a g 法和c p c 法对提取所得d s 进 行纯化，结果显示s e v a g 法和c p c 法纯化效果均较好，三氯乙酸法 纯化效果较差。s e v a g 法操作简便，比c p c 法更具优越性。经液相色 谱法和醋酸纤维薄膜电泳法双重鉴定表明纯化后的d s 为单一组分， 纯度为9 9 1 5 。 通过化学法对鲛觫鱼皮d s 的基本组成进行分析，结果表明d s 中氨基己糖含量为3 5 7 5 1 7 0 ，己糖醛酸含量为2 9 0 2 2 9 0 ， 硫酸基含量为1 8 8 3 + 0 6 0 ，硫酸基与羧酸基的比值为1 0 2 0 1 4 - 1 。 与来源于猪皮、鸡皮和牛蛙皮的d s 相比，簌鲸鱼皮d s 中硫酸基含 浙江工商大学硕士学位论文 量最高且它在组成上有别于其它来源的d s 。 根据高效凝胶渗透色谱( h p g p c ) 、气相色谱( g c ) 、毛细管液相 色谱( c l c ) 、质谱( m s ) 、红外光谱( i r ) 的分析结果，结合其他理化性 质，对簌鲸鱼皮d s 的化学结构进行了初步确认。鲛觫鱼皮d s 的分 子量为1 5 9 1 0 9 ，其结构中存在木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、艾杜 糖醛酸和n 乙酰氨基半乳糖五种单糖，摩尔比为0 0 7 ：o 0 4 ：0 0 7 ： 1 1 2 ：1 1 9 ，其中木糖与半乳糖是存在于糖链与核心蛋白连接区的少 量单糖。簌鲸鱼皮d s 可被硫酸软骨素a b c 酶酶解，3 7 。c 反应4 小 时可完全酶解，其糖链是以艾杜糖醛酸【1 3 】- n 乙酰氨基半乳糖4 硫酸( a d i 4 s ( i d o ) ) 为主要二糖重复单位构成的，此外还含有少 量的艾杜糖醛酸【l 一3 】n 一乙酰氨基半乳糖6 硫酸( a d i - 6 s ( i d o ) ) 和葡萄糖醛酸【1 _ 3 】n - 乙酰氨基半乳糖( a d i 0 s ) 二糖单位。 d i o s 、d i 4 s ( i d o ) 与d i 6 s ( i d o ) 三种不饱和二糖的摩尔比为 0 0 1 ：1 7 1 ：0 0 1 。簌鲸鱼皮d s 具有糖胺聚糖的特征红外吸收，其单 糖环型为吡喃型。， 鲛觫鱼皮d s 的体外抗凝血活性实验以肝素为对照，研究了不同 剂量d s 对凝血时间( c t ) 和血浆凝血酶原时间( p t ) 。的影响。结 果表明，d s 对凝血时间( c t ) 的影响较大，对血浆凝血酶原时间( p t ) 无显著性影响，说明其凝血机制主要是作用于内源性凝血途径。而肝 素对c t 和p t 的影响均较显著，抗凝效果大于d s 。在1 0m g m l 的 剂量范围内随着剂量的升高，d s 的抗凝效果增强。d s 的抗凝血效果 虽然低于肝素，但由于其出血副作用较小，因此具有很大的应用潜力。 关键词：鲛鲸鱼皮；硫酸皮肤素；提取；纯化；组成；结构；抗凝血 浙江工商大学硕士学位论文 s t u d i e so nt h e e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ， s t r u c t u r ea n da n t i c o a g u l a n ta c t i v i t y 0 f d e rm a t a ns u l r 虹ef r o m 三d 脚e z s 口砒0 s k i n a bs t r a c t i nt h i sp a p e r t h ee x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，s t r u c t u r ea n da n t i c o a g u l a n t a c t i v i t yo fd e r m a t a ns u l f a t e ( d s ) f r o mt h es k i no fl o p h i u sl i t u l o nw a s i n v e s t i g a t e d t h es t u d yi st op r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i sf o ru t i l i z a t i o no f l o p h i u sl i t u l o ns k i na n dd e v e l o p m e n to fd s ， t h em e t h o do fe n z y m a t i cd e g r a d a t i o nh a db e e nu s e dt oe x t r a c tt h e d sf r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i n t h ec o n d i t i o no fe x t r a c t i o nw a so p t i m i z e d u s i n go r t h o g o n a ld e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c et e c h n i q u e s t h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rd se x t r a c t i o nw a sas o l v e n t - b i o m a s sr a t i oo f26m l 儋，a t 7 6 。cf o r19 hu s i n g2 5 m ge n z y m e ( p a p a i n ：p a n c r e a s = 1 ：2 ，w w ) p e rg r a m o ft i s s u e a f t e rc e n t r i f u g a t i o n ，3v o l u m e so fe t h a n o lw e r ea d d e dt ot h e s u p e r n a t a n t ，t h ep r e c i p i t a t ew a sf r e e z e d r i e dt oa f f o r dc r u d ed s t c am e t h o d ，s e v a gm e t h o da n dc p cm e t h o dw e r eu s e dt op u r i f y t h ec r u d ed sf r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i n b o t hs e v a ga n dc p cm e t h o dc a n i i i 浙江工商大学硕士学位论文 e f f e c t i v e l yp u r i f yd s ，w h i l et c a m e t h o dc a nn o t s e v a gm e t h o di se a s y t op e r f o r m ，s oi ti sb e t t e rt h a nc p cm e t h o d t h ed sf r o m l o p h i u sl i t u l o n s k i nw a sv e r i f i e dt ob em o n o f r a c t i o nb yh p g p ca n dc e l l u l o s ea c e t a t e e l e c t r o p h o r e t i cm e t h o d ，i t sp u r i t yi s9 9 15 c h e m i c a lm e t h o d sw e r eu s e dt oa n l y s i st h eb a s i cc o n s t i t u e n t so fd s i ts h o w e dt h a tt h ed sf r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i nc o n t a i n sh e x o s a m i n e ( 3 5 7 5 - 4 - 1 7 0 ) ，u r o n i ca c i d ( 2 9 0 2 4 - 2 9 0 ) a n ds 0 4 一( 1 8 8 3 4 - 0 6 0 ) ，a n d t h er a t eo fo s 0 3 一：c o o i s1 0 2 + 0 1 4 ：1 t h es 0 4 一c o n t e n tw a sm o s ti n t h ed sf r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i nc o m p a r e dw i t ht h ed sf r o mp i gs k i n ， c h i c k e ns k i na n db l o o d yn o u ns k i n c h e m i c a lc o m p o s i t i o no ft h ed s f r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i ni sd i f f e r e n tf r o mo t h e r s t h es t r u c t u r e so ft h ed sf r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i nw e r ed e m e r m i n e d b yg p c ，g c ，c l c ，m sa n di rt e c h n i q u e s t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h e d sw a s1 5 9 x10 9 ，i ti sc o n s i s t e do fx y l o s e ，g a l a c t o s e ，g l u c u r o n i ca c i d ， i d u r o n i ca c i da n dn - a c e t y l d g a l a c t o s a m i n e ，a n dt h e i rm o l er a t i oi s0 0 7 ： 0 0 4 ：0 0 7 ：1 1 2 ：1 19 x y l o s ea n dg a l a t o s ea r et h ef e wm o n o s a c c h a r i d e s b e t w e e np o l y s a c c h a r i d ec h a i n sa n dc o r ep r o t e i n t h ed sf r o ml o p h i u s l i t u l o ns k i nc a n b ew e l ld i g e s t e db yc h o n d r o i t i n a s ea b ca t37 cf o r4 h o u r s p o l y s a c c h a r i d e c h a i n so ft h ed sc o n s i s t so fap r e v a i l i n g d i s a c c h a r i d eu n i ti d u a 一【1 3 】一g a l n a c - 4 sa n ds o m ei d u a 一【l _ 3 】一g a l n a c 6 s a n dg l c u a 一【l _ 3 】一g a l n a c ，t h e i rm o l er a t i oi s1 71 ：0 01 ：0 01 d sh a sa c h a r a c t e r i s t i ci rs p e c t r u ma sg l y c o s a m i n o g l y ，i t sm o n o s a c c h a r i d ei s i v 浙江工商大学硕士学位论文 p y r a n o s e t h ea n t i c o a g u l a n ta c t i v i t yo ft h ed sf r o ml o p h i u sl i t u l o ns k i nw a s i n v e s t e di nt e r m so fe f f e c t i o no fd so nc o a g u l a t i o nt i m e ( c t ) a n d p r o t h r o m b i nt i m e ( p t ) w i t hh e p a r i n u ma sc o n t r 0 1 t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ed sh a ss i g n i f i c a n te f f e c to nc ta n dh a sn oe f f e c to np tw h i c h i n d i c a t i n g t h a tt h ed sm a i n l ye f f e c to ni n t r i n s i c p a t h w a y t h e a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t yo fh e p a r i n u mi sb e t t e rt h a nt h ed sf r o ml o p h i u s l i t u l o ns k i nb yp o s s e s s i n gs i g n i f i c a n te f f e c to nb o t hc ta n dp t t h e a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t i e so ft h ed sw e r er e l a t e dt ot h e i rd if f e r e n c e si n c o n c e n t r a t i o n t h ea n t i c o a g u l a n ta c t i v i t yo fd si sw o r s et h a nh e p a r i n u m ； h o w e v e ri th a sp o t e n t i a lu t i l i z a t i o nb e c a u s eo fi t sr e l a t i v e l yl o ws i d e e f f e c to fh e m o r r h a g e k e y w o r d s ：l o p h i u s l i t u l o n s k i n ；d s ；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n ； c h e m i c a lc o m p o s i t i o n ；s t r u c t u r e ；a n t i c o a g u l a n ta c t i v i t y v 浙江工商大学硕士学位论文 中英文名词术语对照表 7 5 浙江工商大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本 人为获得浙江工商大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 签名：岔兰! k日期：钟弓月j 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文 的规定：浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：塑兰坚垒 导师签名： f v 日期：汐d 诊年弓月1 日 浙江工商大学硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 硫酸皮肤素的研究现状 1 1 1 引言 糖胺聚糖( g a g ) 是由重复二糖单元组成的带有负电荷的长链大分子【l 】，因 其二糖单位中都含有氨基己糖而得名，又称为氨基多糖、酸性粘多糖等。硫酸皮 肤素( d e r m a t a ns u l f a t e ，d s ) 属于糖胺聚糖的一种，其二糖主要由n 乙酰氨基 半乳糖和l 广艾杜糖醛酸以p l ，4 或p l ，3 键连接而成，通常在n 乙酰氨基半乳 糖的四位氧上有硫酸基【2 1 ，己糖醛酸除l 一艾杜糖醛酸外还含有部分d 葡萄糖醛 酸【3 1 。硫酸皮肤素广泛存在于哺乳动物组织中【4 1 ，尤其是在细胞表皮和细胞外基 质中，它参与心血管疾病、肿瘤发生、感染、伤口修复及纤维化等多种病理、生 理过程【孓们。 1 1 2 硫酸皮肤素的提取研究 硫酸皮肤素作为糖胺聚糖的一种，只是相应蛋白聚糖整体分子结构中的含糖 片断，后者通过共价键与蛋白聚糖的核心蛋白相连。此外，d s 还通过静电作用 或立体化学效应和其他蛋白质发生专一性程度不一的结合。因此，制备d s 时常 采用降解蛋白质的手段而使与之结合的键得以释放。目前，蛋白酶水解和碱水解 是g a g 提取过程中使蛋白质与聚糖分离广为应用的两种方法【刀。但在提取d s 的过程中，酶解法较为常用，而碱解一般只作为蛋白酶水解的补充手段，而以酶 解法消化组织时通常选用对肽键断裂作用专一性低的微生物酶和植物酶，如链霉 蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶【8 】等。单独的蛋白酶只能有限地从组织中水解 底物，而多种酶类的混合物则具优越性【9 】，而且该类酶不仅有水解蛋白质的广谱 性，还可以水解脂肪使提取易于操作。 国外文献大多使用离液序列高的试剂，如c a c l 2 、m g c l 2 、l a c l 3 或盐酸胍 等提取糖胺聚糖，用该法所提取的糖胺聚糖的完整结构未受破坏。其中盐酸胍的 使用是最普遍的，相对于其他离液序列高的试剂它有很多优点，尤其是其在较宽 的浓度和p h 范围内都能有效地提取糖胺聚糖；利用4m o l l 盐酸胍能够解离糖 浙江工商大学硕士学位论文 胺聚糖聚合物，使糖胺聚糖单体、结合蛋白以及透明质酸等从组织中分离出来， 提取物在高盐溶液中透析又能重新生成糖胺聚糖聚合物；在p h 6 0 左右，且有蛋 白酶抑制剂存在下，未观察到任何糖胺聚糖受到破坏。要注意的是，在该提取试 剂中要加入一些蛋白酶抑制剂，如氨基乙酸、盐酸苯甲脒、e d t a 、n 一乙基顺 丁烯二酰亚胺、p m s f 等【1 0 1 。在d s 的提取过程中也有人采用此类试剂进行提取， 但是通常与酶法提取结合使用。 提取d s 最常见的原料是猪皮【1 1 1 2 】，这也是商品d s 制剂的主要来源。但是 近年来也有人研究从猪肠粘膜f 13 1 、牛肺中提取d s 9 1 ，这些都是以制备为主要目 的。而国外较多学者提取d s 只是为了进行结构和活性研究，用于此类目的的 d s 来源则比较广泛，有鳗鲡【1 4 , 1 5 】、缸鱼【1 6 1 、海鞘【1 7 】、鸡冠【3 1 、羊鼻软骨、动物 肠粘膜、动脉组织等。来源不同的d s ，其提取的基本思路是类似的，无非有的 采取上述中的一种方法，有的将多种方法结合使用，而在d s 的纯化方面，由于 实验条件的不同，不二一样的研究者采用的方法会有较大的差异。 1 1 3 硫酸皮肤素的纯化研究 1 1 3 1 分离纯化 糖胺聚糖( 除透明质酸) 的天然存在形式是蛋白多糖，蛋白多糖一般通过与 丝氨酸和苏氨酸的羟基间形成。一糖肽键而连接在多肽链的骨架上。与糖胺聚糖 通过共价结合的蛋白质一般称为核心蛋白，在核心蛋白与糖胺聚糖之间需要通过 一个寡糖片断把二者连接起来，一般称之为连接区域。经过蛋白酶处理后的糖胺 聚糖链还原性端基还保留长度不一的肽链，这些连接区域的肽链可通过稀碱水解 而除去，从而得到完整的糖链。然而碱过量的话又容易造成糖链的降解，为了避 免这种现象，常在碱性水解时加入四氢硼钠( n a b h 4 ) ，这样水解下来的糖链的 还原末端糖基即被还原成糖醇，从而阻止过度降解。d a t h o o c h a r i s 等【l8 】在对羊 鼻中d s 进行正式纯化分离前就曾采用n a o h 和n a b i - 1 4 进行了碱解。 提取和碱解都会使硫酸皮肤素粗品中含有较多的蛋白质，除蛋白可用蛋白沉 淀剂如三氯乙酸、鞣酸等1 9 1 ，也可用s e v a g 法【2 0 1 。s e v a g 法是较常用的方法，该方 法是将多糖的水溶液与氯仿混合，并震摇成乳化液，此时蛋白质变性成胶状，离 心后蛋白层存在于有机相和水相之间。为了加速蛋白质的变性，通常加少量正丁 醇或正戊醇。另外，也可以利用蛋白酶可水解蛋白质的特性，在多糖的水提液中 加人中性蛋白酶和糜蛋白酶，与s e v a g 法结合进行脱蛋白；或将蛋白酶与三氯乙 2 浙江工商大学硕士学位论文 酸法结合除蛋白。有机溶剂与蛋白酶结合的除蛋白法效率要高得多，可节省许多 试剂和资金【2 1 1 。 由于同一组织中存在多种蛋白多糖，后者又含有不止一种糖胺聚糖，在去除 蛋白质之后，糖胺聚糖中很可能含有多种组分，因此要获得均一的硫酸皮肤素需 要对糖胺聚糖混合物进行分级并纯化。 ( 1 ) 沉淀法 。 沉淀法是利用不同的糖胺聚糖在有机溶剂中的溶解度不同而进行分离。乙醇 是最常用的多糖沉淀剂。据参考文献【2 2 1 ，用乙醇沉淀从猪皮中得到的硫酸软骨素 和硫酸皮肤素混合物，当乙醇浓度为1 8 一2 5 时，沉淀物为硫酸皮肤素；当乙 醇浓度为3 0 - 4 0 时，沉淀物为硫酸软骨素a ；当乙醇浓度为4 0 一5 0 时，沉淀 物为硫酸软骨素c ；硫酸角质素在乙醇浓度达5 0 以上时才沉淀。n i c o l av o l p i l 9 把从牛肠粘膜中提取的肝素、硫酸皮肤素和牛气管中提取的硫酸软骨素混合在一 起制成混合糖胺聚糖，然后研究了甲醇、乙醇和丙醇浓度对这三种糖胺聚糖的沉 淀作用，以琼脂糖凝胶电泳法和吸光度法分离定量。结果表明：快迁移率肝素和 慢迁移率肝素可在加入0 5 0 7 体积的甲醇中沉淀，在这个浓度范围内随着甲醇体 积的增加慢迁移率肝素含量降低而快迁移率肝素含量上升；在加入0 8 1 6 体积的 甲醇中，含有不同浓度的快迁移率肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素。加入0 1 0 4 体积的乙醇中肝素得以沉淀，而0 5 0 8 体积的乙醇沉淀的混合物中包含不同浓度 的硫酸皮肤素和硫酸软骨素，在加入1 2 体积的乙醇中得到的硫酸软骨素纯度可 达1 0 0 。加入丙醇体积为0 3 0 4 时可沉淀肝素，0 5 0 6 时可得到纯度大于8 5 的 硫酸皮肤素，0 8 以上时可得n l o o 的硫酸软骨素。除醇类外，钡盐或锌盐( 用 ， ：于硫酸皮肤素) ，硫醇铵一毗啶( 用于透明质酸) 、乙酸钾( 用于肝素) 等也是常 用的沉淀剂。 ( 2 ) 季铵盐络合法 ，：在d s 的纯化中季铵盐络合法是比较常用的方法。糖胺聚糖能够与氯化十六 _ 烷基吡啶( c p c ) 和十六烷基三甲基溴化铵等季铵盐形成络合物。这些络合物在 低离子强度的水溶液中不溶解，其溶解度根据无机盐浓度的改变而改变。不同的 糖胺聚糖由于聚阴离子的电荷密度不同，所以溶解络合物所需的盐离子浓度也不 同，因此，可以通过控制盐浓度来分离不同的糖胺聚糖【2 3 1 。d a t h e o c h a r i s 等人 f 1 8 】在纯化糖胺聚糖时先加入- j o 0 0 5 m 的n a c i 和过量c p c 使硫酸角质素留在溶液 3 浙江工商大学硕士学位论文 中，而其他糖胺聚糖均形成络合物，通过离心除去硫酸角质素后，剩下的糖胺聚 糖混合物通过离子交换层析得n d s 。 ( 3 ) 色谱法 色谱法是利用填料对不同种类的糖在吸附作用上的差异，使混合物中各糖分 达到彼此分离的目的。根据不同的多糖特性选用不同的色谱柱。离子交换色谱以 离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流 动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得到分离。糖胺聚糖中己糖 醛酸的羧基与s 0 4 2 的取向、类型及数量的差异，重复二糖单位的负电荷数量不 同、显微结构的不均匀性等，这些都是采用不同色谱方法的依据【l 们。d s 在溶液 中以聚阴离子形式存在，因而可用阴离子交换剂进行交换吸附。提纯d s 常用的 离子交换剂有d e a e s e p h a c , e l ，d o w c x 2 4 】等。如果要在分子量水平上对其进行进 一步分级，凝胶过滤是最合适的方法，常用的凝胶色谱有s e p h a d e x 和s e p h a r o s e 。 在d s 的纯化中，经常将上述方法结合起来使用，这样可以达到比较好的效 果，而如果采用其中一种方法就已能够达到纯化要求，那就没有必要采用其他方 法了。如s c h i l l e r 等人只利用了季铵盐络合法就成功地分离了h a ，c s 和h p i z 引。 1 1 3 2 纯度鉴定 多糖纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即使多糖纯品其 微观也并不均一，所以一般要有两种以上测定方法的结果才能肯定其均一性。测 定多糖纯度的方法有比旋度法、凝胶过滤法、高压电泳法、超离心分析法等。不 同的多糖具有不同的比旋度，所以如果其水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉 淀物具有相同的比旋度，则证明该多糖为均一组分阴。凝胶过滤法即凝胶柱层析， 可分常压及高压柱层析，前者装置简单，可自己装柱，但误差大，后者具有速度 快、分辨率高、重现性好等优点，高效凝胶柱层析法已越来越多地应用于多糖的 纯度鉴定。高压电泳法是鉴定糖纯度的常用方法，鉴定d s 纯度采用较多的是醋 酸纤维薄膜电泳法和琼脂凝胶薄膜电泳法【2 6 1 。超离心法是根据不同多糖的微粒在 离心场中的沉降速度不同而进行区分的，在d s 的纯化鉴定中应用不多。 1 1 4 硫酸皮肤素的含量测定研究 硫酸皮肤素的含量测定方法主要有分光光度法、电泳法和色谱法。 1 1 4 1 分光光度法 4 浙江工商大学硕士学位论文 分光光度法是基于长链的硫酸皮肤素大阴离子能与染料阳离子之间反应引 起染料吸收光谱的变化进行分析测定的。常用的染料有天青a 、甲苯胺蓝和阿利 新蓝等。研究者们考察了影响反应的各种因素，如离子强度、溶剂、温度、干扰 物质等。实验表明，离子强度增大或加入乙醇等溶剂，均引起溶液中游离态的染 料分子增加，即对染料与多糖之间的作用起到了破坏作用。温度升高不利于染料 分子间的聚合，也不利于染料和多糖之间的结合。另外，对许多体系的研究均表 明，以染料作为光谱探针对多糖进行测定的选择性很好，大部分常见离子、氨基 酸等都不干扰，可用于实际样品测剧。有人曾利用阿利新蓝测定糖胺聚糖，此 方法不需加热、离心、长时间平衡和复杂的仪器，蛋白质和单糖不影响测定【i 】。 n i c o l av o l p i 等人【2 7 】的研究结果显示，天青a 、甲苯胺蓝和阿利新蓝均可用于对 肝素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素的染色定量测定，其中天青a 具有最高的灵敏度。 另外，e u n y o u n gl e e 等人1 2 8 】采用在琼脂胶中以天青a 和银结合染色的方法测定 尿液中的糖胺聚糖含量，即首先利用琼脂胶将g a g 各组分分离后固定，用天青a 染色后再辅以银加强，沉淀的银对c s 、d s 和h s 均有线性响应。 1 1 4 2 电泳法 电泳法由于具有分辨率好、准确度高的优点，近几年来发展迅速，尤其在糖 胺聚糖的研究中应用广泛。它可以同时分离、鉴定和定量不同种类的糖胺聚糖。 在d s 的定量中应用得较多的电泳法是琼脂糖凝胶电泳法，此外还有硝酸纤维薄 膜电泳法和醋酸纤维薄膜电泳法等。 n i c o l av o l p i 等人【2 9 】曾采用琼脂糖凝胶电泳法同时测定小鼠腹部皮肤中得 到的微量透明质酸和硫酸皮肤素。以甲苯胺蓝和全染色法染色，电泳液是0 0 5 m h c i 0 0 4 m 乙酸钡缓冲液。该方法在0 0 1 - 0 0 5 1 t g 的浓度范围内线性系数在0 9 4 以 上，检出限达到了微克级，比起其他方法具有很大的优势。采用该方法最终测得 透明质酸和硫酸皮肤素含量分别为1 2 4 o 2 6 9 9 m g 和5 0 3 2 4 - 2 3 8 r t g m g 。他们同 时以h p l c 法对结果进行验证，测得透明质酸和硫酸皮肤素含量分别为1 2 0 0 3 3 1 t g m g 和4 9 6 6 4 - 2 5 3 1 t g m g ，可见他们所建立的琼脂糖凝胶电泳法具有很高的 准确性。 在另一篇文献中，n i c o l av o l p i 等人f 2 7 1 又以硝酸纤维薄膜电泳法分离了肝 素、硫酸皮肤素和硫酸软骨素，根据每种糖胺聚糖的浓度和光吸收成正比而进行 定量，最低检测限可以达到0 2 0 3 9 9 。他们采用此方法测定了牛动脉和牛肺中提 5 浙江工商大学硕士学位论文 取得到的糖胺聚糖，结果显示牛动脉糖胺聚糖中含h p 、d s 和c s 的量分别为 1 1 、2 3 和6 5 ，牛肺糖胺聚糖中含h p 、d s 和c s 的量分别为6 2 、1 5 和 2 2 。 m a r kl e b w o h l 等人【3 0 1 研究了弹力纤维性假黄瘤受损皮肤中的透明质酸和硫 酸皮肤素。含量测定采用醋酸纤维薄膜电泳法，缓冲液由p h8 4 的1 0 m m e d t a 5 0m ml i c l 组成，在1 0 0v 电压下4 0 。c 电泳4 5m i n ，用0 1 的天青a 染色， 0 1 的醋酸脱色，不同的条带区剪下后用氯仿：甲醇( 9 ：1 ；v v ) 溶解掉醋酸 纤维膜，在6 2 5 n m 波长下通过吸光度进行定量测定。 1 1 4 3 高效液相色谱法 在糖胺聚糖的定量分析中，高效液相色谱法由于具有快速方便、灵敏度高和 样品不需要衍生化等优点而被越来越多的人所采用。 y o n gh u a n g 等人f 3 1 】采用柱后衍生化荧光高效液相色谱法同时测定血浆中的 d s 和过硫酸化d s 。采用a s a h i p a kn h 2 p 5 0 色谱柱，d s 和过硫酸化d s 的检出 限分别可达到1 0 和2 0 n g 。 h p l c 法用于定量h p 3 2 , 3 3 , 3 4 】和c s 3 5 , 3 6 的报道较多，但应用于定量d s 的报 道较少。在对d s 的研究中，h p l c 法主要是应用在对其结构的研究上，例如对 d s 酶解二糖组成的研究等，而且往往通过与质谱联用来进行分析。 1 。1 5 硫酸皮肤素的结构分析研究 对提纯的硫酸皮肤素纯品开展酶学和化学组成分析，包括对酶解产物( 主 要为不饱和二糖) 和经酸水解产生的组成糖基或基团的鉴别定量和糖基与其他基 团间的比值测定会对所研究的d s 的组成细节特征增加认识。虽然d s 是由一个 氨基己糖和一个己糖醛酸组成的二糖单元依据有规则的排列形成的直链多糖，但 其二糖单元是呈不均一性的，而且其硫酸基的取代形式、平均分子量和二糖单位 组成往往由于来源不同而不同【3 4 】，因此进行上述多层次的分析是很有必要的。 1 1 5 1 单糖组成分析方法 对糖胺聚糖的单糖进行分析，一般需要先水解。水解方法包括完全酸水解、 乙酰解和甲醇解等。完全酸水解是将多糖与强酸( 浓硫酸、浓盐酸) 等试剂作用， 在一定温度下( 8 0 1 0 0 ) 进行完全酸水解( 4 - 1 0h ) 。水解的难易程度与组成 多糖的单糖性质、单糖环的形状和糖苷键的构型有关。一般呋喃型较吡喃型易水 解，含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解。乙酰解是将多糖与乙酸酐、冰醋酸、浓 浙江工商大学硕士学位论文 硫酸等混合反应，可得到乙酰化单糖。甲醇解则是将多糖与盐酸甲醇混合反应， 可得到甲基化单糖【”】。 以前对单糖组分的分析采用的都是经典的化学物理法。比如氨基己糖的测 定，如果先用水解的方法得到游离糖，可用e l s o n - m o r g a n 法【3 8 】测定，如果是n 乙酰基糖则可用m o r g a n - e l s o n 法【3 9 】测定。己糖醛酸的测定可采用d i s c h e 法p , o l ( 即咔唑硫酸法) 和地衣酚法【刀。 目前，对单糖的定量和分析已经有了更快速和简便的方法。如纸层析、薄层 层析、气相色谱法、液相色谱法、离子色谱法等。纸层析、薄层层析、气相色谱 法都是以已知结构的单糖作为标准物，根据保留时问等特征数值来判断单糖的种 类。气相分析时还需先将单糖衍生化处理成易挥发的组分，常采用的衍生化方法 有硅烷基化和乙酰化。h p l c 法则可直接进样分析，克服了气相色谱法需衍生化 的缺陷。离子色谱法也不需要衍生化处理，而且检测灵敏度甚至e i , h p l c 更高。 1 1 5 2 二糖组成分析方法 在d s 的结构研究中，二糖组成是被研究得最多的。对不饱和二糖进行分析 通常需要用到各种特异性裂解酶，将d s 酶解后产生不饱和二糖然后通过常规或 仪器分析手段进行分析。常用的酶主要有硫酸软骨素a b c 酶，a c 酶、b 酶。普通 变形杆菌( p r o t e u sv u l g a r i s ) 来源的a b c 酶最适作用温度为3 7 ，缓冲液最适p h 值为8 0 ，文献报道多采用 i r i s 。h c i 缓冲液( p h8 o ) 作为反应介质。a b c 酶专属 性不强，可以降解软骨素a 、软骨素c 、d s ，但不降解k s 、h s 、h p 4 。硫酸软 骨素a c 酶只降解c s ，对d s 没有作用。b 酶适用于对d s 进行降解，但是极易失活， 应慎选用。 ， 毛细管电泳法和液相色谱法在二糖结构的研究中应用得较多。n i k o sk 【4 2 】认 为，结合各种酶和h p l c h p c e ( 高效液相色谱法高效毛细管电泳法) 的分析 手段使测定d s 中的二糖序列成为了可能，硫酸软骨素b 酶可将d s 酶解为寡糖， 大小和硫酸化程度不同的寡糖可以通过反相高效液相完全分开，而每个片断中的 二糖则可以先用硫酸软骨素a b c 酶酶解后再用h p l c 或反相h p c e 将其分开。 l s c a p o l 等【4 3 】采用毛细管电泳法分析肝素和硫酸皮肤素中的不饱和二糖，采用 硼酸盐缓冲液，在熔融石英毛细管中3 0 分钟之内就分离了肝素的1 1 种二糖标准和 硫酸皮肤素的8 种二糖标准。他们还发现，电泳液中加入三乙胺可以降低二糖朝 阳极的迁移速率，而加入乙腈则不利于二糖混合物的分离。n i c o l av o l p i l 4 4 】以高 7 浙江工商大学硕士学位论文 效毛细管电泳法分离了c s 和d s 酶解后的无硫酸二糖、单硫酸二糖和双硫酸二糖， 在熔融石英毛细管中6 0 分钟内可将其完全分离，分离电压为2 0 k v ，检测波长 2 3 0 n m 。这种方法适用于从牛气管、猪气管、鸡气管和鲨软骨中得到的c s 和猪皮 中得到的d s 。 近年来，除了毛细管电泳，国外很多学者均以质谱的方法来分析糖胺聚糖中 的寡糖和不饱和二糖。在分析生物样品中的c s d s 4 5 舶，4 7 1 、k s t 4 8 1 、h s 4 9 l 中均有 应用。m i c h a e lm o r m a n n 等人【5 0 1 采用钠升电喷雾飞行时间傅立叶变换离子回旋共 振质谱分析了牛动脉d s 中的过硫酸化寡糖片断。t o s h i h i r oo g u m a 等人【5 。l 建立了 l c - m s m s 分析测定人血清和血浆中硫酸角质素、硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素二 糖的方法。三种g a g 的二糖分别采用角质素酶、肝素酶和硫酸软骨素b 酶进行酶 解。在负离子源下通过多离子反应监测模式扫描，色谱柱为h y p e r c a r b ，以乙腈 和0 0 1 m ( p i l l 0 ) 碳酸氢铵为流动相进行梯度洗脱。所建立的方法表现出较高的 灵敏度和较好的重现性。 1 1 5 3 其他结构分析方法 对d s 中的官能团分析和糖环构型的分析可采用红外光谱法。红外光谱上每 一个吸收峰都对应于分子中原子或官能团的振动情况，利用红外光谱可以帮助我 们对d s 进行定性分析，检验分子中的一些官能团和氢键的存在。红外光谱不破 坏样品，这对于极难获得的糖纯品来说很重要。 核磁共振法( n m r ) 可以解决d s 结构中糖苷键的构型和糖基组成等问题。 n a d i n eb a r r o c a 等【4 】以1 hn m r 研究了d s - - 糖及其甲基化产物的8 连接情况。 m a s a h i r os u d o 等f 5 2 】以核磁共振的手段分析测定了硫酸皮肤素、肝素和硫酸乙酰 肝素中的葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸，被化学修饰过的d s 、h p 和h s 的糖残基采用 6 0 0 m h z1 hn m r 扫描分析，该方法可用于不同来源糖胺聚糖的糖残基组成分 析。p a u l o a s m o u r f i o 等人酬以1 hn m r 和快原子轰击质谱两种手段分析了从一 种海鞘类( a s c i d i an i g r a ) 中提取得到的d s - 糖构型，分析出其二糖重复单位为 【一4 ) - a l - i d o a ( 2 s 0 4 ) - ( 1 _ 3 ) 一b d - g a l n a c ( 6 s 0 4 ) - ( 1 一】，其硫酸基的取代位置 与哺乳动物的d s 是有差别的。 蛋白聚糖中的糖胺聚糖有3 种类型的肽键连接在多肽链的骨架上，一种是 d 木糖与丝氨酸的羟基间形成的d 糖肽键，一种是n 乙酰氨基半乳糖与丝氨酸 和苏氨酸的羟基之间所构成的o - 糖肽键，还有一种是n 一乙酰氨基葡萄糖与天冬 8 浙江工商大学硕士学位论文 氨酸的酰胺基团之间所构成的n 糖肽键。对d s 与核心蛋白连接区域的研究也属 于糖链结构研究的范畴。l u m a 等人【蚓采用荧光发射光谱法研究- j l j 艮角膜基质 中d s 蛋白聚糖的构象及动力学，发现d s 蛋白聚糖中具有两条色氨酸荧光谱带 并对此现象进行了解释和推测。 1 1 6 硫酸皮肤素的活性研究 硫酸皮肤素不仅是人体组织的基本结构成分，同时也具有许多种重要的生理 功能，如生长因子信号传导，神经轴生长与再生，中暑神经系统的神经元细胞增 长、形态发生与细胞分裂等1 6 1 。含皮肤素及d s 的蛋白聚糖参与心血管疾病、炎症、 肿瘤发生、感染、伤e 1 修复及纤维化等多种病理、生理过程【s 5 】。越来越多的证据 表明d s 是作用于细胞行为多样化的一个重要辅助因子【引。 1 1 6 1 抗凝及抗血栓作用 d s 具有重要的抗凝血和抗血栓活性，这些活性的机制非常复杂，包括作用 于血浆蛋白质、血管壁内皮细胞、内皮下平滑肌细胞、血小板和纤维蛋白等途径 【5 6 s 7 5 8 1 。k a z i m i e zk r u p i n s k i 等人【5 9 】以实验证明t d s 对激光诱导体内产生的血 栓具有消散作用。h a i y a nd u 等人【6 0 1 研究了不同d s 的抗血栓活性，结果显示抗 血栓活性多硫酸皮肤素( p s d s ) 低分子量的多硫酸皮肤素( l p s d s ) 硫酸皮 肤素( d s ) 。d s 和p s d s 都具有诱导血小板聚集的作用。d s 寡糖( d s o s s ) 和 p s d s 寡糖( p s d s o s s ) 均可显著地诱导p 选择素在血小板表面的表达。d s o s s 和 p s d s o s s 均可显著地增强肝辅酶因子i i 的活性。d s 在血管壁的糖胺聚糖中是起 主要抗血栓作用的物质，它对肝辅酶因子i i 具有生物作用f 6 l 】6 1 。肝辅酶因子u 只通 过抑制凝血酶而起到抗凝作用，而抗凝血酶却抑制了其他凝血因子的活性，包括 x a 和i x a ，硫酸皮肤素通过激活肝辅酶因子h 而起作用，但对抗凝血酶没有作用 6 2 1 o 硫酸皮肤素可显著地影响p 选择素在血小板表面的表达，但是这种影响与 d s 的分子量和硫酸基均没有相关性。而对活性蛋白c ( a p c ) 活性的影响却与分子 量、硫酸化程度和组成的不均一性有关 6 3 】。 1 1 6 2 抗炎作用 人和脊椎动物血清与组织液中存在一组具有酶活性的糖蛋白，称为补体系 统。在补体系统的激活过程中生成一些相对分子质量不等的补体片段，如c 3 a 、 c 4 a 和c 5 a ，又称过敏毒素，它们作为配体与细胞表面相应受体结合，激发细胞 9 浙江工商大学硕士学位论文 脱颗粒，释放组胺之类的血管活性介质，从而增强血管通透性并刺激内脏平滑肌 收缩，导致急性炎症反应。多硫酸化d s 具有较强的抑制补体活性作用，并通