（生物医学工程专业论文）细胞体外定量缺氧培养实验测控系统的研制.pdf

四川大学硕士学位论文( 4 ) 针对氮气进入培养箱后，浓度分布梯度大，存在气体扩散而造成氧变送器检测精度不准的问题，通过实验获得2 、5 、1 0 三种低氧浓度水平下相应的补偿延迟时间，用于软件校正。校正后，小于5 、大于5 的氧浓度设定点控制精度分别为o 8 、o 7 。( 5 ) 提出实现调节阀连续控制的优化方案。针对被控对象具有的大延迟特性，选用带s m i f l a 预估器的p i d 控制器。为测控系统的进一步改良做好理论准备。关键词：缺氧培养模型细胞体外定量缺氧培养测控系统s m i t h 预估器p i d 控制器h婴型查兰堡生兰垡堡塞t h ed e s i g no nt h ee x p e r i m e n t a ls y s t e mf o rh y p o x i ac e l lc u l t u r ei nv i t r ob i o m e d i c a le n g i n e e r i n gc a n d i d a t e ：c h e nh a ns u p e r v i s o r ：f a ny u b ol ij i n c h u a ne x p l o r i n gt h ec e l l so c o l l r r e n c e ，d e v e l o p m e n t ，c o n f i g u r a t i o na n df u n c t i o n ，m e c h a n i s mo fp a t h o l o g i c a lc h a n g e s ，c h a r a c t e r i s t i co fe o n s e n e s c e n c ea n dd e c e a s eh a sb e i n gt h ea c t i v ef i e l di nt h ed o m a i no fb i o m e d i c a lr e s e a r c h a n da st h eb a s i cf o rt h ew h o l ee x p e r i m e n t a lw o r k ，d e s i g n i n gt h em o d e lo fh y p o x i ac e l lc u l t u r ei sv e r yi m p o r t a n t h o w e v e r ，o r g a n i s mi sac o m p l e xs y s t e mw h i c ho r g a n i z e sa n da c c o m m o d a t e sb o t hb yi t s e l f , s oo w i n gt ot h es t a g g e r i n gc o m p l e x 畸o ft h ei nv i v oe n v i r o n m e n t ，e s t a b l i s h i n ga ne x p e r i m e n t a ls y s t e mf o rh y p o x i ac e l lc u l t u r ei nv i t r op r o v e dw i t ha c c e p t a b l ep r e c i s i o ni st h ei n d i s p e n s a b l ee x p e r i m e n t a lm e t h o di nt h eb i o m e d i c a lr e s e a r c h e s a ne x p e r i m e n t a ls y s t e mf o rh y p o x i ac e l lc u l t u r ei n v i t r os u p p o r t e dw a se s t a b l i s h e di nt h i sp a p e go nt h ee l e m e n t a r yd e m a n d so ft h ee x p e r i m e n tf o r 姆p o x i ac e l lc u l t u r e t h ef o l l o w i n gr e s u l t sw e r ea t t a i n e d ，f 1 ) t h et h e s i sr e v i e w e dt h ec u r r e n t1 i t e r a t u r ea n ds u m m a r i z e dt h eu p t o d a t ae x p e r i m e n t a ld e v i s ea n dm e t h o d sf o rh y p o x i ac e l lc u l t u r e d t h em e r i t sa n dd e m e r i t so fe a c hd e s i g nw e r ee s p e c i a l l ya n a l y z e d ( ad e v i s ef o rh y p o x i ac e l lc u l t u r ew a se s t a b l i s h e db a s e d0 1 2t h eh a r d w a r ec o n t r o ld e s i g n ( 3 ) am e a s u r i n ga n dc o n t r o l l i n gs y s t e mf o rh y p o x i ac e l lc u l t u r ee s t a b l i s h e db a s e d0 1 1t h ep cc o n t r 0 1 t h em o d i f i e ds y s t e mc a r l n o to n l yp r o c e s st h es a m p l i n gd a t am o r ee f f i c i e n t l yw i t ht h ed a t ap r e t r e a t m e n ta n df i x e dv a l u ec o n t r o la r i t h m e t i c ，b u t一婴型查兰堡圭堂垡笙三a l s op r o v i d ea l li n t e r f a c ef o rm a n i p u l a t i n ga n do b s e r v i n gi nr e a lt i m e ( 4 ) m e a s u r i n gm a dc o n t r o l l i n gs y s t e me m e n d a t i o nb ye x p e r i m e n t a t i o nc o n s i d e r i n gt h es a m p l i n gd e l a yf o rt h eg a sd i f f u s i n g a n da c q u i r et h ed e l a yc o e f f i c i e n tu s e di no p t i m i z e da r i t h m e t i c a f t e re m e n d a t i o nb ye x p e r i m e n t a t i o n ，t h ep r e c i s i o nr e a c h e so 8 i nt h eo x y g e nc o n s i s t e n c ec o n t r o l l i n gr a n g ef r o m1 t o5 a n dr e a c h e s0 7 a b o v e5 ( 5 ) a i m i n ga tt h ed e f i c i e n c yo fo n o f fc o n t r o ls y s t e m ，t h i sp a p e rp r o v i d e dao p t i m i z e da r i t h m e t i c ，p i dc o n t r o lw i t ht h es m i t hp r e c o m p e n s a t i o n f r o mt h ec o n t i n u o u sc o n t r o lt h e o r y t h e o r e t i cp r e p a r a t i v ew a sm a d ef o rf u r t h e ri m p r o v e m e n t k e y w o r d s ：h y p o x i ac e l lc d t u r e ，e x p e r i m e n t a ls y s t e mf o rh y p o x i ac e l lc u l t u r ei nv i t r o ，s m i t hp r e c o m p e n s a t i o n ，p 1 dc o n t r o li v四川大学碳士学位论文1绪论1 1引言氧气是生命之源，机体需要氧来完成能量的生成和功能性的代谢过程。因此无论是在临床医学还是在基础医学领域，对缺氧状态下生物体生理机制异常的探寻都极为重要。缺氧所引发的临床病症很多，神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统都会因为缺氧而遭受不同程度的损害l i 】，而细胞作为生物体生命的基本单位，构成生命的实体，其结构、功能、生命活动的规律都同生命的基本过程如代谒f 、营养和生长息息相关，德国著名细胞病理学家v i r c h o w 就曾经指出，“一切疾病的发生都是源于细胞的损伤【”。”所以在缺氧状态下从细胞水平认识机体细胞的生理功能及化学变化对揭示疾病发生的根源和促进生物医学的发展有着举足轻重的作用。1 2 构建细胞缺氧培养实验环境的发展概况12 1 建立细胞缺氧培养实验环境的重要意义氧是正常生命活动不可缺少的物质，是机体除旧布新、启动机制的关键之一。人分解代谢过程当中必须有足够的氧，各种营养物质也必须同氧结合，a能完成生理氧化过程，产生出能量。当组织得不到充足的氧，或不能充分利用氧时，组织的代谢、机能、甚至形态结构都可能发生异常变化，这一病理过程称为缺氧( h y p o x i a ) 。从解剖学和组织学水平已经认识到，缺氧会刺激肾脏产生红细胞生成素，使体内红细胞增多，血液粘滞度增高，外周血管阻力增高，还会使体内有氧代谢率降低，无氧酵解加强，机体代谢效率下降，体内不同脏器及系统机能均会因此产生不同程度的病理反射，例如，呼吸中枢进入抑制状态，出现心衰、心律失常、肺心病、脑血栓等心血管循环系统病症，重度缺氧更可引发神经系统的能量代谢障碍，从而导致颅内高压危及生命【3 ，4 1 。如何从根源上使这些疾病的病因病理得到解释，循着1 9 2 5 年生物学大师w i l s o n 的指引，“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找5 。各地学者纷纷开始将目光投向细胞水平的研究。进入微观世界探究缺氧状况下人体细胞的发生、发展、结构与功能、病变机制、衰老死亡的特征逐渐成为生物医学研究的一个活跃领域。近年来，关于细胞在缺氧状态下的形态研究已取得许多成果。相继有实验四川大学硕士学位论文研究表明，缺氧对心肌细胞、肺动脉内皮细胞、神经细胞等的生长状态均有影响。例如，随着细胞凋亡现象在心力衰竭、心律失常等多种心血管系统疾病中的发现，学者已经提出，细胞凋亡可能是引起心肌缺血损伤的重要因素拍j 。并目，也通过实验验证心肌细胞在缺氧一定时问后部分细胞会发生凋亡，凋亡是心肌细胞缺氧损伤的主要形式n 对于常见且难以治疗肺动脉高压病症，现已发现慢性缺氧性肺动脉高压肺血管结构改建( p u l m o n a r yv a s c u l a rs t r u c t u r a lr e m o d e l i n g ，p v s r ) 是最重要的环节之一，而p v s r 总的病理特征是肺血管壁细胞( 平滑肌及成纤维细胞) 增殖及合成细胞外基质增多f 8 j 。缺氧情况下，肺m管壁细胞由于增殖加强而凋亡相应减少，造成细胞增殖、凋亡失衡，无法维持细胞数相对稳定，这种失衡长期进行，终造成细胞累积而形成p v s r 【9j 。等等渚如此类的实验研究己慢慢为解释各种缺氧病症打开了通往微观世界的大门。在众多以细胞生物学的原理和方法研究人体细胞在缺氧环境中的结构变化和生命活动规律的文献报告中，构建缺氧培养环境作为确立细胞缺氧损伤模型实验的基础工作是极其重要的。但由于生物体本身是复杂的自组织自适应系统，在体实验往往受到体液、呼吸、循环等复杂因素的影响，很难解释某单一因素的影响作用和强度，因此建立细胞体外缺氧培养环境，是细胞生物医学研究中一顼不可缺少的实验手段。1 22 构建缺氧环境的实验方法l 培养液中的缺氧损伤模型构建因为细胞是有机体代谢与执行功能的基本单位，所以通过药物或化学药品阻断细胞中的氧代谢是构建缺氧环境最直接的手段。重庆第三军医大学第一附属医院肾科的刘宏 ”j 等人就在研究缺氧、氧损伤对肾小管上皮细胞a 3 整合素表达及粘附性的影响实验中将抗霉素a( a n t i m y c i n a ，可逆性阻断细胞氧代谢f n ，终浓度为o 1 u m o l l ) 注入无血清无底物r p m i l 6 4 0 培养液中以可逆性阻断细胞氧代谢的方式实现缺氧环境的模拟。类似的还有西安第附属医院小儿科刘小红 1 2 1 等人在进行分散神经细胞原代培养中参照k r i e g l s t e i n ( 1 9 8 8 年) 和p e r u c h e ( 1 9 9 0 年) 等人建立的鸡胚皮层细胞缺氧损害模型的方法 1 3 , 1 4 j ，在细胞培养的第7 天，向培养液中加入终浓度为i m m 0 1 l的氰化钠，作用i5 r a i n ，造成细胞急性缺氧损伤模型。四川大学硕士学位论文由于已经完全阻断了细胞的氧代谢，确切的说这是种厌氧状态下的细胞培养方式。所以采用此种方法构建缺氧环境无法实现对细胞生存环境中氧浓度的调节，只适用于某些对环境要求比较特殊的厌氧实验。2 定量缺氧模型的枸建体外培养细胞的定量缺氧实验模型由重庆第三军医大学新桥医院全军肿瘤中心和全军呼吸内科研究所f5 j 率先提出并使用。此种实验模型不以二氧化碟孵箱为载体，但有助于阐明不同缺氧程度所致的细胞病理生理反应及相关分子改变。该缺氧装置由厚8 m m 有机玻璃板粘接而成，分为底室和上盖两部分，在底室的两侧分别有控制气体进出的管道，进气道靠近底部，出气道靠近顶部。底室中央有一支撑培养皿或培养板的支架。关闭上盖并垫上一层软橡皮垫，以防漏气。拧紧固定螺丝，确保缺氧箱完全密闭。无氧的混合气体由进气道通八，同时打开出气管道，直到箱内氧气被完全排出后夹闭进出气道。缺氧箱的内容积通过人工计算获得，而后依据所需不同缺氧浓度算出氧含量，再根据空气中的氧含量( 以气体分析结果为准，以排除不同环境内氧含量之差) ，换算出所需空气的体积。用! o o m l 空针抽取不同缺氧浓度所需体积的空气，从出气道注入缺氧箱。待气体混匀后，用5 0 r a l 空针抽取箱内气体进行分析( i l l 6 2 0 血气分析仪) 。最后，据箱内氧含量调整注入空气的体积，以达到研究所需的氧浓度。细胞培养实验证明该缺氧模型的构建能灵敏地反映细胞缺氧所引起的病理反应。此种缺氧模型对于体外缺氧环境的构建具有一定的指导作用，因为其不仅经济、易行，而且理论上能通过调整空气体积准确获得各种浓度氧，误差极小，尤其是可获得1 以下的缺氧浓度，这是配制混合气的方法难以达到的。但是采用此种方法构建缺氧环境需要进行许多人工操作，这些过程都会引发人为误差，所以只能作为简易模型进行细胞缺氧实验。3 低氧舱中的缺氧环境构建低氧舱所模拟的低氧环境是国内外众多实验室进行缺氧实验最常用的手段。虽然用于动物的在体实验，但由于技术已比较成熟，效果也较为理想，所婴删盔兰堡主兰垡丝兰一一一以其中的某些设讨思想也对细胞体外缺氧培养环境的构建有所启发a最普及的常压低氧舱系统如图1 1 所示，由首都医科大学附属北京红十字朝阳医院呼吸医疗研究中心的郭胜详1 6 j 等自行设计制作。该低压舱通过带有刻度的配气阀调节空气入口大小达到与氮气定量混合的目的。其中来自气瓶的纯氮气经过恒压恒流装置，使气体压力、流速和流量恒定，再经配气阀与空气一定量混合来实现混合气的低氧浓度要求。舱内氧气和二氧化碳浓度用血气分析仪分析。图1 1 常压低氧舱示意图1 1 6而后，又陆续有科研机构针对自己的需要对此种常压低氧舱进行完善和改良。首都医科大学基础医学院组织胚胎学教研室曾晓蓓 1 7 j 等就根据小鼠实验的需要于2 0 0 3 年对低氧舱进行了改装。具体方案是，在气瓶上装上减压器，再用个三通管连到转子流量计上，流量计出口上的小管通到低氧舱的入气孔。在低氧舱工作时，根据研究的要求调节每个气瓶的流量从而控制氧气的含量，并根据实际情况控制气体的总流量。压缩空气和压缩氮气经减压器减压并按预定的比例混合后以恒定的流量流入舱内，即可得到所需的常压低氧气体。当两种气体的流量相同时即可得到氧气体积分数为1 05 的低氧气体。根据小鼠的每分钟吸气量计算出低氧气体的每分钟流量。关于舱内氧气和二氧化碳气体的浓度监测所著论文未曾提及。2 0 0 4 年初，锦州医学院附属第一医院呼吸科的潘殿柱i 强】等人从缩短实现低氧浓度环境的时间和降低制作材料的成本出发再进一步改进了郭氏低氧舱。其中最主要的是采用了自制的配气阀，如图1 2 所示。该配气阀为双套管结构，转动外套管来改变空气入口的大小，实现氮气与空气定量混台的目的。入气口与四川大学硕十学位论文自制的配气阀相连，出气口标有刻度用以调节出气口的大小。舱内水蒸气和二氧化碳分别用无水氯化钙及钠石灰吸收。整套装置通过调节与氮气相连的单头氧气表流量、配气阀及出气口的大小，使低氧舱内氧浓度降至并维持在所需的浓度。舱内氧气和二氧化碳浓度用血气分析仪进行监测。东气 u越 a图12 双套管结构配气阀示意图 1 8 1除了利用血气分析仪对低氧舱内的氧气和二氧化碳浓度进行监测，氧气浓度测定仪也是国内如今常用的一种获取密闭仓内气体浓度信息的仪器。在中国医学科学院，中国协和医科大学，北京协和医院神经科的彭斌等人所做的慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究实验中即引入了中国医学科学院基础所病理生理室提供的低氧舱。该低氧舱利用恒速泵将棍匀的舱内气体输出至舱外的氧气浓度测定仪，持续监测舱内浓度，当氧气浓度测定仪监测到氧浓度超过设定的上限值时，人工迅速充入氮气，使舱内氧气浓度控制在设定值的要求范围内。在众多研制构建缺氧实验环境的报道中，建立在高山缺氧模型 20 】以及常压缺氧模型1 2 1 j 基础上的全自动低氧舱的出现具有创新意义。重庆第三军医大学附属新桥医院的种银保1 2 2 l 等人设计出一套采用单片微机进行测量与控制的低氧实验系统。舱体采用铝合金框架，上面、右侧面和前面均为1 0 n m a 的有机玻璃板，后面为铝合金板，其上开直径5 0 r a m 的四个气体进、出口，与洁净风管连接，接至经改装的空调和除湿机，构成一密闭的“中央空调”系统。左侧壁也为铝合金板，其上开有多个进、出气v i ，分别为氧气、氮气和二氧化碳的进出口、气体检测取样口以及二氧化碳吸收口和气体浓度校正口。连接各气体钢瓶、减网j i i 大学顿十学位论文压阀、流量计、电磁阀、氧气泵、一：氧化碳泵、吸收泵、空调、除湿机及舱内温度与湿度传感器和主机之间的电缆连接。舱内氧气浓度和二氧化碳浓度通过h b 0 3 型测氧仪测定仪和二氧化碳气体测定仪检测获得，并实现实时显示。所采集的模拟信号通过a d c 0 8 0 9 数模转换器进行模数转换，将采集数据在主机内进行处理、分析判断，而后由主机给出控制信号控制各气源相应电磁阀的通断。整套系统框图如图1 3 所示，软件程序设计采用m c s 一5 l 汇编语言完成，。临床实验结果与国内外的报道疾病一致【玎i 。图13 低氧舱整机系统框图皿低氧饲养舱将生物医学实验与测控技术和机械制造紧密结合，完成了对环境的实时监测和调控，该设计思想对本论文工作有巨大的启发作用。4c o ：培养箱中的缺氧环境构建c 0 2 培养箱由于其内部环境可随时调节达到细胞的生长要求，所以是近年来细胞培养最常采用的实验方法 2 4 1 。许多在缺氧条件下观察细胞病理生理反应及相关分子改变都是采用此种缺氧模型，细胞所需的低氧生长环境均是通过向箱体内注入人工配制的不同氧浓度混合气体获得2 5 3 。此法虽然能较好满足细胞的培养要求，但是在不同浓度要求的缺氧环境构建方面有缺憾，因为没能实现箱体内氧浓度的实时监测，并且人工操作延迟了对环境的调控动作，使得箱体内的缺氧环境在一段时间内不符合要求。鉴于目前国内还没有关于使用c o z 细胞培养箱进行全自动体外细胞缺氧环婴型查兰堡尘兰垡丝塞境构建的报道，因此，建立相应的氧浓度测量通道，以及相应的计算机调控软件，是对生物医学细胞实验研究的有力支撑。1 ，3 本论文的主要研究内容本论文研究工作的主要内容包括：( 1 ) 分析国内外相关文献资料，总结现有的构建缺氧培养环境的实验方法，针对现有研究中还没有结合p c 机开发的细胞体外缺氧环境测控系统，本论文工作以c 0 2 培养箱为对象进行了细胞体外定量缺氧培养全自动测控装置的开发研制。( 2 ) 基于硬件控制，研制了细胞体外定量缺氧实验装置。并从抗干扰的角度，采用迟滞电压比较电路，改进了氧浓度控制电路。避免了系统在实验过稃中电磁阀所出现的频繁开闭现象。( 3 ) 针对硬件控制的局限性，提出了以计算机控制为基础，开发细胞体外定量缺氧实验测控系统。以实现细胞体外定量缺氧培养为基本目标，选择高精度的氧变送器，配合多功能数据采集卡，完成整套系统的数据采集工作。再结合相应的数据处理算法，利用阈值比较实现对执行机构一电磁阀的通断控制。并且从测控操作的实际需要出发，构建测控软件的操作界面，不仅使仪器的调控工作更加灵活，也实现了对监控环境中氧浓度的实时观测。( 4 ) 针对氮气进入培养箱后，浓度分布梯度大，存在气体扩散而造成氧变送器检测精度不准的问题，通过实验获得2 、5 、1 0 - - 种低氧浓度水平下相应的补偿延迟时间，用于软件校正。校正后，小于5 、大于5 的氧浓度设定点控制精度分别为o 8 、o 7 。( 5 ) 提出实现调节阀连续控制的优化方案。针对被控对象具有的大延迟特性，选用带s m i t h 预估器的p i d 控制器。为测控系统的进一步改良做好理论准备。四川大学硕士学位论文2基于硬件控制的细胞体外定量缺氧实验装置设计2 1实验装置的组成结构针对细胞体外培养的需要，首先建立了基于硬件控制的细胞体外定量缺氧实验装置。如图2 1 所示。它由二氧化碳培养箱、氮气瓶、过滤器、恒温箱、电磁阀、氧传感器、氧浓度控制电路板组成。图21基于硬件控制的体外定量缺氧实验装置总体设计图系统的工作原理是，将维持细胞体外生存和生长的培养皿及其培养的细胞放入二氧化碳培养箱中，通过氧变送器的反馈电信号控制硬件电路中继电器的断开和闭合，从而控制电磁阀的开关，实现通过充入氮气控制箱体内氧气的浓度。2 2 氧浓度控制电路设计基于硬件控制的细胞体外定量缺氧实验装置，电路设计是其中的核心部分主要用于实时监测和控制二氧化碳培养箱中的氧浓度。221 电路设计原理些些奎兰堡主兰壁堡苎一一一氧浓度控制电路的设计即利用比较电路的原理，控制固态继电器的闭合断开，从而实现氮气充入通路的通断。具体电路原理图如图2 2 所示。p c 机i ，o图2 2 氧浓度控制电路设计原理图电路工作原理是，安装在二氧化碳培养箱中的氧传感器检测箱内氧含量，以4 2 0 m a 电流环形式输出，外接负载电阻r i ，取样r l 两端的电压v o 。电压v o 经r 2 连接到比较器l c 】反相端。电阻r 1 和电位器w 1 对电源v c 分压，其电压v r 被加到i c l 同相端，v r 即基准电压，调节变阻器w l 可改变v ，的大小。当v o 大于v ，时，输出0 电平；当v l 大于v 0 时，输出1 电平。输出端经上拉电阻凰接到电源v c 上，v c 由2 2 0 v 经e 0 3 0 9 变压器( 2 2 0 u 1 8 v ) 整流稳压获得。r 3 、d l 在i c j 上接成正反馈形式，构成迟滞比较器以增加系统稳定性。当r ，与1 相连，固态继电器t c 2 由比较器i c i 、三极管d 2 、电阻r 5 、控制。若l c l输出。电平，则三极管d 2 饱和导通，固态继电器i c 2 闭合，电磁阀q 通电，氮气进入培养箱；若i c l 输出l 电平，则三极管d 2 不导通截止，固态继电器i c 2断) 下，电磁阀q 断电，阻断氮气进入培养箱的通路。22 2 电路设计分析整个电路的设计过程主要考虑到两个问题：( 1 ) 氧变送器的输出信号为4 2 0 m a 的电流环形式，而基于计算机控制技术的测控系统设计采用数据采集婴型查兰堡主兰堡婆苎( d a q ) 卡，此卡的数据采集不支持电流输入形式。( 2 ) 单点比较器容易导致输出振荡，控制固态继电器将出现频繁开闭现象。所以论文工作针对这两方面做了专门的分析设计。】信号转换电路设计分析氧传感器的输出为4 - - - 2 0 m a 电流环形式，但是在墓于计算机控制技术的工作中，信号的采集使用数据采集( d a q ) 卡，而采集卡输入为高阻抗电压输入形式，因此，在设计中氧变送器输出端连接2 5 0 f 2 电阻负载，将电流信号转换为电压信号采样。2 比较器电路设计分析比较电路的设计是整块氧浓度控制电路设计的核心。论文工作中采用反向迟滞比较电路。图2 ，3 单门限电压比较器电压比较器是用来比较两个输入电压的大小，据此决定其输出是高电平还是低电平。普通单门限电压比较器【3 ”如图2 3 所示。由于比较器的开环电压增益很大，当输入信号h 小于参考电压陆f 时，即“d = ( v r e f ) 0 时，运放转入正饱和状态，为高电平h 。使电压从个电平跳变到另一个电平时相应的输入电压喙e f 即被称为门限电压( 闷值电压)。单门限电压比较器虽然电路简单、灵敏度高，但其抗干扰能力差。如果在比较器的输入巧中含有噪声或干扰电压，其输入和输出电压波形就会如图2 4四川大学硕士学位论文所示。由于在h = = f 附近可能出现干扰，故会时而为v o h ，时而为v o l ，导致比较器输出不稳定。如果用这个输出直接控制执行机构，将出现振荡现象。这种情况是不允许的。因此采用迟滞比较器提高氧浓度控制电路的抗干扰能力。v r2 0t图2 ，4 单门限电压比较器在出现干扰信号情况下的输入输出波形迟滞比较器是一个具有迟滞回环特性的比较器口6 1 。论文工作中采用的是反相输入迟滞比较电路，原理图如图2 5 所示。即在反相输入单门限电压比较器的基础上引入正反馈网络。图25 反相输入迟滞比较器迟滞比较器与普通单门限比较电路的差别在于由于正反馈的引入，可以根据输出电压v o 的不同值( v o h 或l ) ，得到上门限电压h + 和下门限电压n 。i l吣d四川大学硕士学位论文从而形成一个门限宽度或回差电压。具体传输特性是，当h 向正方向增加到接近上门限电压= p h 前，一直保持r e = v o h 不变，当h 增加到略大于v t , h q - ，则v o 由i o h 下跳到v o l ，同时下跳到下门限电压v t h = v t _ 。k 再增加保持v o = v o l 不变。若向负方向减小，只要k = v t ，则始终保持v o = v o l不变，只有当h v t h = u t 时，由v o l 跳到v o h 。如图2 6 所示。从传输特性分析可以看出，迟滞比较器的门限电压随输出电压的变化而改变，增加延迟环节使抗干扰能力得到很大提高。ol图2 6 迟滞比较器输出特性2 3 局限性分析通过实验发现，单纯的硬件控制确实存在一定的局限性。( 1 ) 虽然通过氧变送器的检测反馈能够实现对二氧化碳培养箱内氧浓度的实时控制，但用户无法观测到具体的变化情况，也就无法进行有针对性地改良工作。( 2 ) 虽然在氧浓度控制电路的设计中引入了迟滞比较器，以提高整个系统的抗干扰能力。但由于没有对采样信号进行必要的处理，所以仍有可能出现振荡现象。( 3 )由于氮气进入培养箱后，浓度分布梯度大，所以造成氧含量传感器检测精度不准，不易实现校正工作。婴型查兰堡主兰堡堕兰一一一一针对以上在实验中发现的问题，论文的进一步工作即基于计算机控制技术改良了整套细胞体外定量缺氧实验装置。2 ，4 本章小结从硬件控制的设计思路出发，构建了简易细胞体外定量缺氧培养的实时监测反馈实验平台。在氧浓度控制电路板的设计过程中，虽然从抗干扰的角度出发，使用反向迟滞比较器避免了单门限电压比较器控制执行机构所出现的频繁开闭现象，但硬件控制的局限性在具体实验中仍然显露无疑，本章最后做了相应总结，为构建计算机控制实验测控系统提出了依据。四川太学硕士学位论文3基于计算机控制的细胞体外定量缺氧测控系统开发针对硬件控制的局限性，本章基于计算机控制技术构建了以数据采集处理系统为核心的细胞体外定量缺氧测控平台。以二氧化碳培养箱为实验载体，通过氧变送器和多功能数据采集卡实现对箱体内缺氧环境的实时监测，继而卜传p c 机对采样数据进行处理和运算，并产生控制信号驱动执行机构，完成整个系统的反馈控制。3 1 实验测控装置组成结构及工作原理基于计算机控制技术的细胞体外定量缺氧实验测控装置总体设计如图3j所示。其中包括二氧化碳培养箱、氮气瓶、减压阀、过滤器、恒温箱、氧变送器、多功能数据采集卡、电磁阀、p c 上位机【3 7 】。r 一i 一一 j图3 1基于计算机控制的细胞体外定量缺氧实验测控系统总体设计图该细胞体外定量缺氧培养实验装罱的载体为二氧化碳培养箱，箱体为薄钢t 4堕型查兰堡圭堂些笙奎板制造立式结构。整机上方有温度及二氧化碳浓度控制器，下部为工作室。细胞培养工作室高6 0 0 m m ，宽4 0 0 m r n ，纵深4 5 0 m m 。输气管路置于箱体背侧，距顶部约1 0 0 m m ，并排三条管道，分别为控制二氧化碳浓度的进气、出气管道以及本论文工作中控制氧浓度的氮气进气管道。工作室由一扇玻璃门进行密封，外面还有具装有磁性门条的大门，防止了工作温度与环境温度差造成的密封门的凝露。氧变送器在距培养箱顶部约2 5 0 r m n 处按照法兰安装方式安装。探头伸入箱体约4 0 r a m 。箱体内部氧浓度由氧变送器检测以4 2 0 m a 电流环形式输出，通过外接2 5 0 q 负载电阻转换为电压信号接至多功能数据采集卡，采样数据实时显示，并由p c 上位机进行处理、分析判断，而后给出控制信号控制氮气输入通路电磁阀的通断。3 2 氧浓度信号检测3 2 1 氧变送器的选择实现细胞的体外定量缺氧培养实验，需要对细胞生长环境，即二氧化碳培养箱内的氧浓度进行实时检测。根据细胞培养的具体要求，论文工作选择了集小型化、集成化、标准化为一体的b y - 8 4 j 3 0 系歹l j 氧变送器，外观如图3 2 所示。该氧变送器将氧传感器与电路模块组合在一起，直接输出标准信号。翻3 2b y 一8 4 j 3 0 氧变送器外观图b y - 8 4 j 3 0 系列氧变送器的技术参数指标如下供电电源：测量范围：输出信号：负载能力：准确度：1 2 ( 1 士1 0 ) v d c( 1 3 0 ) 0 2( 4 2 0 ) m a1 2 5 0 q士2 f s重复性：稳定性：响应时间稳定时间功耗：o 5 f s1 f s 6 0 s 6 0 r a i n 4 w四川大学硕士学位论文环境压力：( 8 6 1 0 6 ) k p a使用温度：0 5 0 。c环境湿度： _ 8 0 r h重量： e x p e c t a t i o n c + o 3 ) ，正中( e x p e c t a t i o nc c e x p e c t a t i o n c + 0 3 ) ，零四川大学硕士学位论文( e x p e c r a t i o n ) ，负中( e x p e c t a t i o nc 一0 3 c e x p e c t a t i o n _ c ) ，负小( c e x p e c t a t i o n _ c + 0 2 ) ，j f 中( e x p e c t a t i o nc c _ e x p e c t a t i o n) ，零() ，负_c+02e x p e c t a t i o n( e x p e c t a t i o nc 0 2 c e x p e c t a t i o nc ) ，负小( c 一) 三个等_e x p e c t a t i o nc0 2级。当氧浓度检测值隶属于正大时，打开电磁阀充入氮气：当氧浓度检测值隶属于负小时，关闭电磁阀，截断氨气充入通路。图3 9 为细胞体外定量缺氧培养测控系统的控制界面。具体功能操作如下：图30 数据采集与控制程序界面数据采集：通过界面右边的“i n p u tc h a n n e l ”单选框选择a d 的输入通道，“i n p u tr a n g e ”单选框选择a d 的电压输入范围。数据处理：在“e x p e c t a t i o n ”文本框中输入氧浓度设定值，按下“s t a r t ”键，检测箱体内的氧浓度为何等级，如是“正大”等级则通过d o 通道输出高电平，打开电磁阀充入氮气。当检测到氧浓度在“正中”范围内后，系统自动停止初始调控，此时按下“a d j u s t ”键，系统则进入自动控制状态，实现实时监控。a d 波形及数据显示：波形显示区域设置为三线显示。灰色线条代表氧浓度的零点值，黑色线条代表氧浓度的设定值，红色线条代表氧浓度的检测值。通过这三条线，可以很直观地观测到氧浓度的变化趋势，以及出现的异常情况，四川人学硕士学位论文例如，当代表氧浓度检测值的红色线条出现在代表氧浓度的零点值的灰色线条之下则表明氧变送器或者数据采集卡出现问题，实验人员应立即进行检修。此外，a d 输出的具体数值也以浮点数形式实时显示在控制界面下方的文本框中。图3 9 中黑色线条显示氧浓度的设定值为2 ，红色线条则为初始调控阶段将二氧化碳培养箱中的氧浓度从常态值降至设定值所采集到一组数据曲线。d a 输出：对于系统的进一步优化工作，控制界面也作了相应准备。“o u t p u t ”单选框用于选择d a 的电压输出范围。在调试过程中，如果需要手动对进行调节阀进行控制，在界面的“d a ”文本框中直接输入相应的电压值即可。3 6 本章小结根据细胞体外定量缺氧培养的基本要求，设计了硬件装霞和相应的软件测控系统。不仅实现了对数据的实时采集和处理，控制界面的构建也使得整个系统更加灵活和透明。用户可以对数据采集的某些关键参数进行选择，箱体内氧浓度的变化趋势也能通过波形得到实时观 9 1 1 5 。整套系统从数据采集到指导调控体现了计算机控制的优势，基本完成了对实验箱体内部氧浓度环境实行实时监控的任务。四川大学硕士学位论文4 实验校正整套细胞体外定量缺氧培养系统是依据稀释的原理降低氧浓度的，即利t l j高纯度氮气的充入实现对箱体内氧浓度的调节。但由于氮气进入培养箱后，浓度分布梯度大，存在气体扩散问题，造成氧变送器检测精度不准。对于气体扩散的梯度问题，多数研究性气体培养箱都是采用叶轮风机完成气体的混合，但是由于本实验系统的培养环境借用的是p c 0 2 9 0 z 型二氧化碳培养箱的工作室，而培养箱自带的鼓风系统跟随二氧化碳控制器一起工作，不能为本论文工作所用。所以，采用理论结合实验的方法得到气体扩散的大致延迟时间对控制算法进行必要校正及补偿处理，以提高控制精度。4 1气体运动基本理论为了得到容器内气体达到平衡的时间，引入气体扩散速度的概念。将气体混合物的分子视作性质相同的弹性小球，分子热运动使这些小球相互间无规则碰撞，此外不再考虑其他的作用力，在此简化条件下，经分子运动论的理论推导与实验修正，得到如下计算气体扩散系数的半经验公式0 5 0 】：1 5 1 7 t ”1 f 一1 + 上1肚面赫糌睁，p 阮) o “”阮o4 + o4 f、7其中，d 为气体的扩散系数( c m 2 s ) ，t 为绝对温度( k ) ，巩、慨为组分a 、b 的相对分子质量，j p 为总压( k p a ) ，咒a 、b 为组分a 、b 的临界温度( k ) ，a 、b 为组分a 、b 的临界容积( c m 3 t 0 0 1 ) 。由此可以进一步得到扩散系数与温度、压强的关系为f 5 l 】：d - d 0 件z )其中，d o 为t 0 、p o 状态下的扩散系数。由公式( 4 2 ) 可以看出，温度越高，分子动能越大；压强越低，分子间距加大，两者均会使扩散系数增加。理论上由式( 4 - 2 ) 即可获得某气体a 在某气体b 中的扩散速度。但是，实验发现，大量氮气的冲入使得二氧化碳培养箱中的气压值呈非线堕型苎兰堡主兰垡丝兰一一一性趋势增加，且对箱体内温度的影响规律也难以确定，所以，用半经验公式( 4 2 )来精确确定扩散速度不现实，出入较大，论文工作没有采用。继而，论文工作利用范德华方程，即式( 43 ) ，计算气体密度，以期获取二氧化碳培养箱内的实际氧浓度值对测量值进行拟合。范德华气体状态方程 5 2 , 5 3 】理论是由荷兰科学家范德华( v a nd e rw a a l s ) 针对描述理想气体的c l a p e y r o n 状态方程【5 4 1 提出的实际气体状态方程。，、fp + 等l ( v - n b ) = l r l r t( 4 1 3 )l”其中，a 用于校f 压力，其值随沸点升高而增大，b 用于修正体积，大致等于气体在液态时的摩尔体积，称为v o j t d e rw a a t s 常数。利用式( 4 - 3 ) 计算出经由减压阀流出氮气的密度，n 2 的v a n d e r w a a l s 常数”副为：a = 0 1 4 0 8 m 6 p a t o o l ，b = 3 9 1 3 x 1 0 4 i d _ 3 - t o o l 。由减压阀副表读出，在气压p = 0 0 2 m p a ，温度3 0 0 k 条件下，p 1 2 2 ，4 5 6 9 m 3 。通过l z b 一1 0 玻璃转子流量计，测得氮气经由减压阀后，流速为o 6 8 m 3 h ，则氮气的流速也可表示为1 5 2 7 9 h ，即v = 0 0 0 4 2 9 s 。箱体体积由计算得v = 0 6 0 x 0 4 0 0 4 5 = 0 10 8 m 3 。箱体内部常压下( 1 0 1 3 2 5 p a ，3 0 0 k ) ，空气的密度也可由式( 4 - 3 ) 计算得到( 因为空气和氮气的摩尔质量相近，所以用氮气的v a i ld e rw a a l s 常数代替空气的v a nd e rw a a l s 常数) ，p 气= 4 0 6 5 0 9 m 3 ，则初始状态下二氧化碳培养箱中空气的质量m = 4 3 9 9 。通过实验测得箱体内的初始氧浓度为2 3 5 7 ，则ma 2 m , x 2 3 5 7 2 1 0 3 9故理论上，o z 的浓度表达式应为1n 1c = 二兰二( 4 4 )43 9 + 0 0 0 4 2 t代入变量值t 对氧浓度进行计算。得到的理论曲线如图4 1 所示。从图上可以看出，实测值的三条曲线重合性很好，说明实验具有可重复性，实验数据可靠。而理论值曲线在大约5 0 0 秒后，其下降趋势明显平缓，即，以5 0 0 秒为界，之前理论值的计算符合预想要求，之后，理论值的计算不能作为拟些业查堂堡主兰堡堡苎合标准。善。爿oo5 0 01 0 d 01 5 0 02 0 0 0f ( s )图41 理论值与实测值的比较曲线所以第二种校正理论仍不能完全描述氮气充入后，二氧化碳培养箱内氧气浓度的变化规律，论文工作决定采用实验法直接得到气体扩散大致所需的延迟时间。4 2 实验工作由于2 、5 、1 0 是细胞缺氧培养的三个定量典型。所以论文工作集中在这三个氧浓度水平分别进行大量实验，以获取所需的延迟时间。4 2 12 氧浓度水平实验将二氧化碳培养箱内的氧浓度从正常氧浓度水平降至2 低氧浓度水平，采用外部触发方式采样，以获取最佳变化趋势曲线。采样1 0 0 个点，采样间隔时间t = 2 0 s 。屏幕实时显示变化曲线如图4 2 所示，表4 1 列出前9 个采样值。实验数据表明，氮气充入二氧化碳培养箱后，大约用了6 0 秒的时间氧变送器检测到氧浓度开始有规律地下降，即f 。= 6 0 ( s ) 。继续进行实验。1 0 0 个点采样完成后，二氧化碳培养箱内的氧浓度经氧变送器检测降至2 0 3 ，关闭电磁阀，箱体内由于通气孔或其他一些非密封部位的拍加协oo四川大学硕士学位论文图42 正常氧浓度水平降至2 氧浓度水平变化曲线图4 32 氧浓度水平在无调控措施下采样1 0 0 个点的变化曲线表4 1正常氧浓度水平降至2 低氧浓度水平前9 个采样值时间02 04 06 08 01 0 01 2 01 4 01 6 0氧浓度摹表422 低氧浓度水平在无调控措施下的前9 个采样值3 2四川大学硕上学位论文漏气而与外界相通致使氧浓度无法维持在2 的低氧浓度水平，出现升高趋势。采样1 0 0 个点，采样间隔时间t = 6 0 s ，没有使用控制程序维持箱体内浓度的稳定，屏幕实时显示变化曲线如图4 3 所示，表4 2 列出前9 个采样值。实验数据表明，停止充入氮气后，大约用了1 2 0 s - 1 8 0 s 的时间，氧变送器检测到周围氧浓度不再继续下降。可用加权平均大致计算出这个延迟时间。从表4 2 看出1分钟内氧气的浓度变化大致为o 1 ，所以对照时间和氧浓度变化值，算出对于氧浓度不再继续下降的时间，1 2 0 秒的影响权值大约为o 5 6 ，1 8 0 秒的影晌权值大约为0 4 4 ，计算出延迟时间f 。= 0 5 6 x 1 2 0 + o 4 4 1 8 0 = 1 4 6 4 ( j )由于无法获取氮气冲入过程中某个点的实际变化情况( 因为氧变送器传达的仍然是没有进行延迟补偿的氧浓度值) ，所以只有将获取的箱体内撮小气压下的延迟时间6 0 s 和最大气压下的延迟时间1 4 6 4 s 作简单的算术平均，以此得到在2 低氧浓度水平在实验初始阶段的信号采集延迟时间。f o = ( f ，+ r 。) 2 = ( 6 0 + 1 4 6 4 ) 2 = 1 0 3 2 ( s )而进入实验的调控阶段，从图4 3 可以看到，箱体内气体浓度的变化非常缓慢，由此可以推断气压的变化也非常小，所以延迟时间可以近似采用停止冲入氮气后，气体的扩散时间，即优化算法中预估器的延迟为r = 1 4 6