免疫学实验-凝集试验.doc

实验一 凝集试验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。目的要求1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。材料与试剂1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法（一）试管凝集试验以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml 。4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml 。 表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）试 管 号1234567对 照 管最终血清稀释度1：251：501：1001：200抗 原阳性血清阴性血清1：251：250.5%石炭酸生理盐水2.30.50.50.50.5被检血清0.20.50.50.50.50.5抗原(1：20)0.50.50.50.50.50.50.5弃1.5 弃0.55. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。：100抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。：75抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。：50抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。：25抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。注意事项1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。（二）布氏杆菌病平板凝集试验1. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm2），并注明被检血清号码，以100mL微量可调加样器按下列量加被检血清于方格内，第l格80mL、第2格40mL、第3格20mL、第4格10mL。血清用前需放室温，使其温度达20左右。每一份检样需换一个tip头。大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用40mL 和20mL ；猪、山羊、绵羊、狗用80mL和40mL。2. 加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30mL，滴在血清附近，而不与血清接触。从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20左右。3. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到30左右，3-5min内记录反应结果。4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。5. 结果判定：按下列标准记录反应结果。：出现大的凝集块，液体完全透明，即100% 凝集。：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即75% 凝集。：有可见凝集块，液体不甚透明，即50% 凝集。：液体混浊，有小的颗粒状物，即25% 凝集。：液体均匀混浊，无凝集现象。6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系平 板 凝 集80mL40mL20mL10mL相当于试管凝集1:251:501:1001:2007. 判定标准：同试管凝集试验。8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。（三）虎红平板凝集试验这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30mL滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20）4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。 2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。（四）鸡白痢平板凝集试验1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30mL）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。2. 结果判定：在室温（20）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。思考题1. 凝集反应的原理是什么?2. 哪些因素影响细菌凝集试验?3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？实验二 病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。 目的要求掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。材料与试剂1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50mL定量移液器，滴头，微型振荡器。2. 生理盐水，0.5% 鸡红细胞悬液。3. 新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。实验内容及操作方法（一）血球凝集(HA)试验 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50mL生理盐水。2. 于左侧第1孔加50mL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50mL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50mL；第12孔为红细胞对照。3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50mL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。表 4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：mL）孔 号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 0.5%红细胞505050505050505050505050弃50结果观察+- 4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。(二) 血球凝集抑制(HI)试验 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50mL生理盐水。3. 第孔加被检鸡血清50mL，吹吸混合均匀，吸50mL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50mL，稀释度分别为：1:、1:4、1:8 ；第12孔加新城疫阳性血清50mL，作为血清对照。4. 自第1孔至12孔各加50mL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50mL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）孔 号123456789101112血清稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒对照血清对照生理盐水5050505050505050505050被检鸡血清50505050505050505050504单位病毒505050505050505050505050室温中静置 10 min0.5%红细胞505050505050505050505050弃去50 结果观察-+-6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（+），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。附 录1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液枸橼酸钠（5H2O） 0.80g枸橼酸（H2O） 0.055g葡萄糖 2.05g氯化钠 0.42g双蒸水 加至 100 ml 将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115灭菌10min,4保存备用。2. 0.5% 鸡红细胞制备方法先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的15)，