《z植物生理学试验》PPT课件.ppt

植物生理学实验,西昌学院基础生物实验中心,一、实验目的本实验是植物生理学课堂教学中的一个重要环节，不仅与课堂讲授的基本理论、基础知识相结合，而且要使学生学会植物生理学的基本实验方法，并在科学态度、实验技能技巧、独立工作能力、理论联系实际能力等方面获得基本的训练。,二、基本要求通过教学，要使学生学会植物生理学的基本实验方法、技术和设计思路，掌握植物生理学基本原理的验证方法和定量测定植物体内发生的生理生化变化，并初步具有完成综合性、设计性实验的能力。每次实验结束，学生均需写出一份实验报告。,实验1植物组织渗透势的测定,质壁分离法,【实验原理】当植物组织细胞内的汁液与其周围的某种溶液处于渗透平衡状态,细胞压力势为零时,细胞汁液的渗透势就等于该溶液的渗透势。该溶液的浓度称为等渗浓度。设计并配制一系列具浓度梯度的蔗糖溶液，通过实验找出使细胞发生初始质壁分离的浓度，代入公式计算可得植物组织的渗透势。【仪器与用品】洋葱或紫鸭趾草；显微镜载玻片盖玻片镊子刀片蔗糖移液器,【方法与步骤】配制各种浓度的蔗糖溶液剥取洋葱鳞茎（或紫鸭趾草叶片）表皮迅速投入各种浓度的蔗糖溶液中低倍显微镜观察并记录质壁分离的相对程度确定使细胞发生初始质壁分离的浓度计算渗透势【思考题】1.测定并计算不同植物组织的渗透势。2.为什么选用有色素的洋葱鳞茎外表皮实验效果较好？,冰点下降法,【实验原理】根据物理化学溶液理论拉乌尔冰点下降原理，溶液单位体积中所溶解的溶质颗粒总数相同，则引起冰点下降的数值相同。利用冰点渗透压计测定一定的冰点下降值对应的渗透浓度单位ic，代入公式计算。【仪器与用品】新鲜植物材料；冰点渗透压计、液氮罐、注射器、纱布、吸水纸、Eppendorf管,【方法与步骤】取材1-2克新鲜植物材料洗净包在锡箔纸中，放入液氮或低温冰箱中将细胞杀死取出剪碎放入注射器溶冰，用加压法将胞液挤出，存于Eppendorf管待测取20微升待测液于冰点渗透压计的测定管测定提出探头，擦拭后可继续下一个样品的测定。【思考题】冰点下降法与质壁分离法的原理有何不同？,实验2植物组织水势的测定（小液流法）,【实验原理】把等量的植物组织放入一系列具浓度梯度的蔗糖溶液中，利用小液流法寻找植物组织放入后浓度不变的蔗糖溶液，计算出此蔗糖溶液的渗透势即等于所测植物的水势。【仪器与用品】菠菜试管毛细滴管移液器剪刀镊子蔗糖甲烯蓝,【方法与步骤】配制一系列蔗糖溶液各放入等量植物组织加入次甲基蓝粉，染色毛细管移取蓝色小液滴，放入未染色同浓度的蔗糖溶液中找出液滴不动的蔗糖溶液计算蔗糖溶液的渗透势所测植物组织的水势。【思考题】用小液流法测定植物组织水势与用质壁分离法测定植物细胞渗透势都是以外界溶液的浓度算出的溶质势为根据，它们之间的区别何在？,实验3印迹法测定气孔开张度,【实验原理】有些有机溶剂涂在叶片表面，失水很快形成一层薄膜，上面就印在叶片表面的保卫细胞与气孔的轮廓。在显微镜下可观察到，结合显微测微尺可测其开张度大小。【仪器与用品】植物叶片显微镜显微测微尺载玻片盖玻片牛皮胶(或火棉胶),【方法与步骤】配制牛皮胶溶液在叶的下表皮涂胶成膜后取一小片镜检测量【思考题】测量不同生境下、不同植物叶片的气孔开张度，比较后说明原因。,实验4植物灰分元素的定性鉴定和定量分析,【实验原理】植物风干样品在高温灼烧后，剩下灰分灰分元素发生特定的化学反应后显现出颜色及结晶灰分元素在高温下吸收特定光谱的能量发生能级的跃迁，可用原子吸收分光光度计定量测定,【仪器设备及试剂】植物样品高温电炉、显微镜、原子吸收分光光度计、坩埚等，10%硝酸、5%盐酸、5%硫氰化钾等（见实验指导）各元素的标准溶液,【实验步骤】植物样品5g放在坩埚（已称重）中，在灰化炉中缓慢升温至400度，灰化1小时，冷却，称重。取出一部分进行灰分元素的定性分析。详见实验指导45页另取一部分称重，放于50ml烧杯中，10%硝酸5ml于电热板上加热熔解，定容于100ml容量瓶中。原子吸收分光光度计测定其Ca、K、Mg、Fe、Zn、Mo含量（同时要测定和元素的标准曲线）观察的现象描述及计算,【思考题】灰分元素在植物样品中的含量是怎样的？各灰分元素的化学反应原理是什么？原子吸收分光光度计的工作原理以及他可以测定多种灰分元素的技术关键是什么？,实验5植物的无土培养和缺素症状,实验原理水溶液培养缺乏某种元素会表现出特定的缺素症状仪器设备及试剂离子交换器培养罐玻璃房漂浮盘、恒温培养箱、光照培养箱、刻度移液管、通气泵等,实验操作水培液所需的化学试剂（化学纯）培育玉米苗配制营养储备液配制完全培养液和缺素培养液完全培养液及缺素培养液培养玉米苗观察记载、根据实验结果描述缺素时所表现的典型症状，并分析其原因。,思考题植物营养必须的大量元素和微量元素有哪些植物的大量元素和微量元素缺乏时的表现症状有什么不同如何做好植物的缺素实验,实验6叶绿体色素的提取、分离及理化性质的鉴定,【实验原理】叶绿素是一种双羧酸的酯，可与碱发生皂化作用，产生的盐能溶于水，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素与类胡萝卜素都有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定。叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光；叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是叶绿素与蛋白质分离后破坏更快；叶绿素中的镁可被氢离子取代而生成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐后，去镁叶绿素则成为绿色的铜代叶绿素，后者很稳定，在光下不易破坏，故用此法制作绿色植物的浸制标本。,【仪器与用品】1.仪器大试管或展层缸，台天平，研钵，量筒，烧杯，漏斗，软木塞，滤纸，毛细滴管，剪刀，分液漏斗，移液管，分光计2.试剂丙酮，甲醇，醋酸铜，盐酸，氢氧化钾，石英砂，碳酸钙，无水硫酸钠，四氯化碳，乙醚3.材料新鲜植物叶片,【方法与步骤】一、叶绿体色素的提取与分离1.色素的提取2.准备纸条（2cm20cm，将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm,宽约0.5cm的窄条。）3.点样（注意：一次点样不要太多，风干后多点几次，展层效果会更好。）4.纸层析（结果：最上端橙黄色为胡萝卜素，其次黄色为叶黄素，再下面蓝绿色为叶绿素a，最后的黄绿色为叶绿素b。）,二、叶绿体色素的理化性质1.叶绿素的荧光现象2.光对叶绿素的破坏作用3.铜代反应4.黄色素与绿色素的分离5.观察色素溶液的吸收光谱,【思考题】1.提取叶绿素时为什么要加入少量碳酸钙，加多了会出现什么问题？2.铜在叶绿素中取代镁的作用，有何实用意义？,实验7叶绿素a、b含量的测定,【实验原理】叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm，吸收曲线彼此又有重叠。根据Lambert-Beer定律，如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分别测定两个组分，可通过代数方法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响，最后分别得到两种组分的含量。,根据Lambert-Beer定律，通过代数方法，换算后得公式：Ca=12.7OD663-2.69OD645（1）Cb=22.9OD645-4.68OD663（2）CT=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645（3）（3）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/L。利用上式,既可以计算出叶绿素a和叶绿素b及总叶绿素的浓度（mg/L）。【方法与步骤】色素的提取测定光密度计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素a+叶绿素b的浓度计算每克鲜重叶片中色素的含量,【仪器与用品】1.仪器高级分光光度计，台天平，研钵，漏斗，剪刀，移液管2.试剂丙酮，碳酸钙3.材料植物叶片【思考题】1.试比较阴生植物与阳生植物的叶绿素a与叶绿素b的比值有何不同？2.分光光度法和比色法有何不同？3.叶绿素a与叶绿素b在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素a与叶绿素b的定量分析，为什么？,实验8植物呼吸强度的测定,【实验原理】利用Ba(OH)2溶液吸收呼吸释入的二氧化碳,实验结束后,用草酸滴定残余的Ba(OH)2，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程释放的二氧化碳的量。【仪器与用品】广口瓶温度计酸式滴定管干燥管尼龙网制小篮Ba(OH)2麝香草酚酞5%乙醇草酸(重结晶)小麦种子,【实验步骤】安排实验装置放入萌发种子（同时用煮死的种子作对照）于小篮内滴定计算【思考题】比较不同类型种子的呼吸强度。,实验9可溶性总糖类的测定,实验原理本实验采用葸酮比色法测定可溶性糖的含量。糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与葸酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。在625nm波长下的OD值与糖含量成正比。由于葸酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。该实验方法简便，但没有专一性，绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮试剂反应，产生颜色。,仪器与用品1、实验仪器分光光度计，恒温水浴，分析天平，烘箱，刻度试管，漏斗，活性炭，酒精（20%）2、实验试剂酒精（20%），葡萄糖标准液，葸酮试剂3、实验材料各种植物叶片、种子、果实,方法与步骤1、可溶性糖的提取干材料50mg10ml刻度离心管（4ml80%酒精）水浴40min离心上清液+10mg活性炭脱色（80）30min定容至10ml过滤滤液2、显色及比色滤液1ml+5ml葸酮沸水浴10min冷却OD值（625nm）3、绘制标准曲线,思考题1、应用葸酮法测得的糖包括那些类型？2、你知道还有哪些方法可以测定糖类？,实验10吲哚乙酸氧化酶活性的测定,实验原理吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧化酶活力的大小，对调节体吲哚乙酸的水平，起着重要作用，而影响植物的生长。酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法测定。,仪器与用品1、实验仪器72型分光光度计，离心机，恒温水浴锅，天平，研钵，试管，移液管，烧杯2、实验试剂磷酸缓冲液，2，4-二氯酚，氯化锰，吲哚乙酸，吲哚乙酸试剂。3、实验材料豆类种子,方法与步骤1、豆类种子30温箱萌发3-4天，选取生长一致的幼苗，留下胚轴作材料。2、20株胚轴称重加磷酸缓冲液5ml+石英砂研磨加提取液离心20min粗酶液。3、试管1+氯化锰+二氯酚+IAA+酶液+磷酸缓冲液30水浴30min试管2+氯化锰+二氯酚+IAA+磷酸缓冲液,4、反应液2ml+4ml吲哚乙酸试剂30暗处保温30min显色5、将反应液于530nm处测定光密度值6、根据读数查出相应的吲哚乙酸残留量7、配制从0-35g/ml的IAA浓度，分别测定OD值，绘制标准曲线。8、计算酶活力U=(C2C1)10/1/VVt/60简化成：U=(C2C1)200,思考题1、试比较幼苗的胚轴和胚根中吲哚乙酸氧化酶活性大小。2、试比较幼根的根尖和延伸区中吲哚乙酸氧化酶活性大小。,实验11植物组织中总氮、蛋白质氮含量的测定（微量凯氏法）,【实验原理】植物组织中的有机氮化物包括蛋白氮和非蛋白氮。非蛋白氮主要是氨基酸和酰胺，以及少量无机氮化物，是可溶于三氯乙酸溶液的小分子。将植物材料与浓硫酸共热，硫酸分解为二氧化硫、水和原子态氧，并将有机物氧化分解成二氧化碳和水；而其中的氮转变成氨，并进一步生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解，在消化时通常加入多种催化剂，如硫酸铜、硫酸钾和硒粉等。消化完成后，加入过量NaOH，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3导入过量的硼酸溶液中，再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算，可得出含氮量。蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量，（约在1418，平均约含氮16）所以，可用蛋白氮的量乘以6.25（100166.25），算出蛋白质的含量。,【材料、仪器设备及试剂】材料：各种干燥、过筛（6080目）的植物样品仪器设备：1.消化管；2.微量凯氏定氮蒸馏装置一套（图17）；3.三角烧瓶；4.微量滴定管；5.量筒；6.容量瓶；7.烧杯；8.移液管等。,【实验步骤】样品提取分离：样品的消化：蒸馏及滴定：结果计算：样品中总氮量（）0.010(V3V0)10014/(W100010)100氮的回收率样品中蛋白氮含量（）0.0100(V1V2V0)10014/(W51000)100氮的回收率回收率（）0.0100(VV0)14/(2.00.6100)100,【思考题】植物的蛋白氮和非蛋白氮的分离原理是什么？系数6.25是如何得出的？开氏定氮器的原理是很么，如何操作？,实验12种子活力的快速测定,氯化三苯基四氮唑法(TTC法)实验原理凡有生命活力的种子胚问呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生命活力的种胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶上的氢还原时，便由无色TTC变为红色的三苯基甲（TT）仪器与用品、实验仪器恒温箱，烧杯，培养皿，镊子，刀片、天平、实验试剂0.5%TTC溶液、实验材料种子,方法与步骤1、浸种将待测种子于30-35温水中浸种，以增强种胚的呼吸强度，使显色迅速。2、显色取吸胀种子200粒，纵切为两半，将其中一半置于2只培养皿中（每皿100粒），另一半沸水煮5min杀死胚，加入适量的TTC，30保温0.5-1h。3、观察结果，计算活种子的百分率。,溴麝香草酚蓝法（BTB法）实验原理凡活细胞必有呼吸作用，吸收空气中O2，放出CO2。CO2溶于水成为H2CO2，解离成H+和HCO-，使得种胚周围环境的酸度增加，可用溴麝香草酚蓝法来测定酸度的改变。BTB的变色范围为pH6.0-7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色。色泽差异显著，易于观察。,仪器与用品1、实验仪器恒温箱，天平，培养皿，烧杯，镊子，漏斗，滤纸，琼脂2、实验试剂0.1%BTB溶液，1%BTB琼脂凝胶3、实验材料种子,方法与步骤1、浸种同TTC法2、显色取吸胀种子200粒，埋于备好的琼脂凝胶培养皿中（间隔至少1cm）。置于30-35下培养2-4h，观察种胚周围的颜色。用沸水杀死的种子作对照。3、算活种子的百分率。,红墨水染色法实验原理凡生活细胞的原生质膜具有选择性吸收物质的能力，而死的种胚细胞原生质膜丧失这种能力，于是染料便能进入死细胞而染色。仪器与用品1、实验仪器恒温箱，烧杯，培养皿，漏斗，镊子2、实验试剂5%红墨水3、实验材料种子,方法与步骤1、浸种同上述TTC法2、染色吸胀种子200粒纵切为二一半加5%红墨水，染色10-15min倒去红墨水用水冲洗检查种子死活。用沸水杀死的种子作对照。3、计算活种子的百分率。,思考题1、试验结果与实际情况是否相符？为什么？2、就你所知还有哪些快速方法可以测定种子的生活力？3、试比较TTC法、BTB法、红墨水，测定的结果是否相同，为什么？,实验13高温和低温对植物的伤害,【实验原理】植物在遭遇不良环境（如高温、低温等）时，原生质的结构常受到影响，原生质膜的选择透性丧失，对物质的透性发生变化，盐类或有机物从细胞中渗出，进入周围环境中。通过电导度的测量和糖的显色反应，可以测知物质的外渗，表明植物的受害情况。【仪器与用品】1.仪器电导仪，电冰箱，温箱台，水浴锅，烧杯，量筒，移液管，试管，镊子2.试剂蒽酮试剂3.材料玉米或小麦幼苗,【方法与步骤】1.培养玉米或小麦幼苗2.当幼苗长2-3cm时，取出幼苗，尽量不要伤害根系，用镊子除去幼苗上残留的胚乳，用蒸馏水漂洗数次，以除去伤口上的物质。然后以10株为一组，共3组，分别放在盛有20mL蒸馏水的小烧杯中，务必将根系浸入水中，将一杯放在45温箱中，一杯放在0-2冰箱中，另一杯放在室温20-25条件下。3.经过1h、2h、3h后，分别测定每一处理中溶液的电导度。另外吸取溶液0.5mL于试管中，加入蒽酮试剂2mL，于沸水浴中加热15min,如果溶液变绿，即表明糖类的存在。另以蒸馏水做同样测定进行比较。4.制表记录实验结果。,【思考题】1.利用测量电导度和糖的显色反应，试比较水稻和小麦幼苗在低温和高温中受害的程度。2.说明这种测量方法的实践意义。,实验14干旱、低温对植物（水稻）体ABA含量的影响,实验原理ABA是一种重要的激素，在植物的生长发育和抗逆境胁迫中起着重要的作用。尤其，在多种逆境条件下体内含量增多，诱导多种抗逆蛋白质的产生，从而提高植物的抗逆性。本实验分析ABA含量的方法为酶联免疫法（ELISA）,该方法是被分析物先与相应的抗原或抗体反应，然后检测抗原或抗体上酶标记物的活性并进行定性定量测定。常用的酶为辣根过氧化酶和碱性磷酸酶。酶可直接标记激素分子，也可标记第二抗体，称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型酶联免疫法。本实验使用前者。,将抗脱落酸(ABA)甲酯的单克隆抗体与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体结合，加入脱落酸甲酯标准品或待测样品，使其与固相华的单克隆抗体结合，再加入辣根过氧化物酶标记脱落酸。提高测定酶标脱落酸的被结合量，换算出样品中位置的脱落酸含量。,仪器与用品仪器：酶联免疫测定仪，冷冻离心机，恒温箱，真空泵，漩涡仪，研钵，带盖磁盘。试剂：磷酸缓冲液（称8gNaCl.0.2gKH2PO4,29.6gNa2HPO4,1000ml,pH7.4）,样品稀释液（100ml磷酸缓冲液加0.1mlTween-20）,洗涤缓冲液（1000ml蒸馏水中溶解20gNaCl,再加1mlTween-20），ABA标准溶液（用ABA甲酯母液配成参比系列溶液，浓度单位为ng/L），邻苯二胺基质液（称5g邻苯二胺,溶于12.5ml0.01mol/LpH5.0磷酸缓冲液，使用前加入12.5ul30%H2O2）。辣根过氧化物酶稀释缓冲液（在100ml磷酸缓冲液中加入0.1mlTween-20,0.1g白明胶及4g聚乙二醇6000）。材料：15日龄的水稻幼苗分别在室温、4冰箱、不浇灌培养一周苗的叶子。,方法与步骤脱落酸的提取1、处理好的水稻材料的新鲜叶子，各称取100-500mg（若取样后材料部马上测定，用液氮速冻后保存在-20的低温冰箱中），用2ml80%甲醇研磨至匀浆，转入试管中，再用2ml甲醇将研钵冲洗干净。5000g离心10min,残渣加o.5ml甲醇液，再离心1次，合并上清液，记录体积，残渣弃去。脱落酸纯化2、取300ul上清液转入5ml塑料离心管中，用氮气吹干，用200ul0.1mol/lNa2HPO4（pH9.2）溶解，加等体积的乙酸乙酯，蜗旋，萃取3次，合并乙酸乙酯相，用氮气吹干。,脱落酸的甲酯化3、上述氮气吹干得样品用200ul甲醇溶液，加入过量的重氮甲烷至样品呈黄色，10min后加入半滴0.2mol/L乙酸甲醇破坏过量的重氮甲烷（黄色消失），氮气吹干，加入300uL0.01mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）溶解样品。脱落酸的测定4、取一次性酶标板，在每小孔中加入100ul兔抗鼠Ig抗体溶液用于包被聚苯乙烯反应板的微孔，然后将酶标板放入内铺有湿纱布的带盖磁盘内，4下过夜或37下放置2h。弃去孔内溶液，用磷酸缓冲液洗涤酶标板3次，甩干。5、各孔中加入100ul抗ABA甲酯的单克隆抗体的，37下放置60min,洗板，甩干。,6、各孔内依次加入标准ABA容液或待测样品，每个样品重复3次，于20放置20min，洗板，甩干。7、各孔加入100ul辣根过氧化物酶稀释缓冲液，湿盒在37放置60min，洗板，甩干。8、暗中，各孔加入100ul邻苯二胺基质液，湿盒在37显色15min，加入50ul硫酸中止反应。9、用酶联免疫仪，测定490nm处各孔的OD，以加入ABA母液的孔调0（标准曲线最高浓度孔），以加入不含ABA甲酯的磷酸缓冲液孔的OD值为B0,以加入ABA甲酯各标准溶液孔的OD值为Bi。求出每份样品孔的平均值。,10、以标准的ABA甲酯摩尔浓度的产果年糕对数logABA为横坐标（X），对应的InBi/(Bo-Bi)为纵坐标（Y）,得到一条Y=a+bX的直线。11、将样品孔得OD值代入公式，换算出ABA甲酯摩尔数，乘以稀释倍数，除以样品重量，得每克样品的ABA量。思考题干旱和低温条件下，植株体内的ABA含量与对照比是否有显著的增高？解释乙酸乙酯萃取脱落酸的原理。,实验15植物组织培养1-培养基的配制,实验原理植物组织培养（planttissueculture）是指在无菌条件下，在人工制备的培养基上培养植物的离体器官、组织、细胞的技术。其理论依据为细胞的全能性。培养基为离体培养物提供了细胞分裂、生长及分化所需要的营养物质，培养基成分包括大量元素（如N,P,K,Ca,Mg）、微量元素（如B,Mn,Cu,Zn,Fe）、有机物、碳源和植物激素等。,仪器与用品高压消毒器、电炉（800-1000w）、电子天平（精确度0.01;0.001各一台）、pH计、50；100ml三角瓶、90cm培养皿、1000ml和500ml烧杯、量筒（50ml;100ml;5ml）、漏斗（6-8cm）、封口膜、封瓶膜、牛皮筋、细口瓶(500ml;1000ml)。蔗糖、硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、硼酸；萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、6-呋喃甲基腺嘌呤、赤霉素等。,实验步骤1、分别配制MS培养基的大量元素20倍、微量元素200倍、有机物200倍母液、植物激素：萘乙酸、6-苄基腺嘌呤、6-呋喃甲基腺嘌呤、赤霉素等的1mg/L的母液并分装。2、按以下方案设计附加激素的培养基配方及配制培养基（激素浓度mg/L）,（1）取母液大量元素微量元素铁盐有机物（2）称量蔗糖(30g/L)(3)称琼脂粉(7g/L)加蒸馏水600ml/L,混合-定容-调pH值-分装封瓶口-高压灭菌-冷却-凝固,注意事项1、不要将培养基倒在瓶口上。2、高压灭菌不能超过20min.思考题1、试述培养基中蔗糖的作用。2、高压灭菌的时间是多长？为何不宜过长和过短？,实验16植物组织培养2-材料的消毒、接种与培养（愈伤组织的诱导与器官的分化）,实验原理用于离体培养的植物器官或组织片段叫外植体（explant）,外植体切口可经脱分化诱导产生愈伤组织，愈伤组织经分化可形成根、芽等器官。植物激素在愈伤组织分化过程中起重要作用；当生长素与细胞分裂素比值高时，有利于根的分化，当二者比值低时有利于芽的分化，当二者比值相等时有利于愈伤组织的生长。,仪器与用品1、仪器：超静工作台；恒温培养箱、光照培养箱；或光、暗恒温培养室；喷雾器；手术剪刀；枪头镊子；解刨刀；卫生纸;紫外灯；酒精灯等。2、材料：菊花花蕾、嫩茎、嫩叶。,实验步骤1、接种室和超静工作台的通风和消毒；1）、接种室先开紫外灯20分钟，关灯后20-30分钟人在进入；2）、超净工作台表面用70%乙醇擦拭一遍，后开启紫外灯并通风20分钟。2、操作者的消毒更换干净的工作服，戴工作帽和口罩；用肥皂水清洗双手，擦干，再用酒精棉球擦拭一遍。,3、外植体的消毒1）如果材料表面有灰尘，现用自来水冲洗3-5分钟。用吸水纸擦干表面水分。2)以后在工作台中进行，将菊花嫩茎切成4-5厘米的小段、花蕾的花瓣分开、嫩叶片一分为二，且放置在消过毒的三角瓶中，倒入70%乙醇并浸泡30秒钟，用无菌水冲洗一次后，再用0.1%的升汞溶液浸泡8分钟。期间需要动山脚平数次；最后用无菌水冲洗5-6次，无菌纸吸干备用,4、切割材料和接种剪刀、镊子等金属器具，在酒精灯火焰上灼烧灭菌，等冷却后，将材料分割成小段或小块接种。茎段和花瓣分成0.5-0.8厘米，叶片切成0.50.5cm2