（环境工程专业论文）金属离子和半胱氨酸对产氢能力的影响及调控对策研究.pdf

摘要 摘要 生物制氢技术为解决人类的能源危机和环境问题提供了一条崭新的途 径。发酵法生物制氢技术以其产氢能力高、稳定性好、可实现废物处理资源 化等优势而成为生物制氢技术的首选，其中利用有机废水为底物进行连续流 制氢，因具有能源回收和废水处理的双重功效而成为研究热点。发酵法生物 制氢技术产业化的关键是提高单位反应器或产氢发酵细菌的产氢能力。本研 究从细胞水平和群体水平上探讨金属离子和半胱氨酸对产氢能力及产氢发 酵工艺系统的调控对策，以期为进一步提高发酵法生物制氢技术的产氢能力 提供理论指导。 细胞水平研究发现，影响乙醇型产氢发酵细菌b 4 9 生长和产氢过程的 主要金属离子有铁( i i ) 离子、镁离子、锌离子、镍离子、锰离子等。半胱 氨酸是b 4 9 必要的生长因子，并影响其产氢能力。采用正交试验考察金属 离子的交互作用，以氢气产量、细胞生物量为主要指标，并参考氢气含量、 乙醇和乙酸产量以及末端p h 等因素，确定b 4 9 适宜生长和产氢的各离子浓 度为：钠离子5 0 0 m g l ，铁( i i ) 离子2 0 0 m g l ，镁离子5 0 m g l ，锌离子 o 5 m g l 。 按照正交试验结果优化- rb 4 9 的基础培养基，获得了2 7 5 0 m l h 2 ，l 培养 基的氢气产量，与原基础培养基的氢气产量( 2 2 3 5 m l h 2 l 培养基) 相比， b 4 9 的产氢能力提高了2 3 。 从群体水平上考察了金属离子对乙醇型发酵混合菌种产氢能力的影响。 研究发现，单质铁( c d ” z n “。若以氢气产量 下降1 0 为标准，维持混和细菌正常产氢发酵的三种金属离子允许浓度为： c u 2 + 0 1 m g l ，c d ” z n 2 + i f1 0 r e d u c e db i o g a sw a sam e a s u r eo ft h ee f f e c to f m e t a li o n so nh y d r o g e nf e r m e n t a t i o n ，t h r e ei o n sp e r m i t t e dc o n c e n t r a t i o nw e r e c u ” 0 1 m g l ，c d ” 1 0 m g l ，z n 2 + n i 2 。，m 9 2 + 。g r a y 掣78 指出，在缺铁的培养基上生长的肠杆菌和梭菌不 能产氢。但是，当金属离子的浓度超过一定范围时，会引起细菌中毒。镍在固 氮菌中的毒性水平是1 0 4 m g l ，镁在厌氧发酵中的抑制浓度在1 0 0 0 p p m 以上。 1 2 5 7 气相产物普遍认为，液相中的氢分压是影响产氨的一个重要因素。但近 年来研究发现，c 0 2 对产氢的抑制作用要大于h 2 的抑制1 7 川。从式1 2 可以知道 产生乙酸、丁酸、丁二醇和丙酮可以提高氢气产量，而生成琥珀酸和甲酸会降 低氢气产量。而可获得的二氧化碳决定了琥珀酸和甲酸的产量，其反应式如下： c h 3 c o c o a + c q + n a d h + + _ 2 h c o o h + 磊毛口+ n a d +( i l o ) c h 3 c o c o a + c 0 2 + 2 n a d h + 2 h + _ 2 c h 3 c o o h - i - 峨d + 2 n a d + ( i - 1 1 ) 因此，如果能够从培养基中强行去掉c 0 2 ，则琥珀酸和甲酸的产量会大大 减少。无疑这又会使可利用的n a d h 增多，从而氢气的产量也会上升。基于此， 众多研究者开展了这方面的研究工作。t a n i s h i o 等【l l 】采用氩气对产气肠杆菌 ( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) e 8 2 0 0 5 的发酵气进行吹脱，发现c 0 2 对其产氢的抑制 大于h 2 的抑制。在利用h 2 和氩气吹脱c 0 2 的试验中，该细菌的产氢能力提高 到1 5 8 m o lh 2 m o l 葡萄糖。m i z u n o 等【阿j 对以混合菌种制氢的c s t r 反应器采用 氮气吹脱，使产氢能力由吹脱前的0 8 6 m o lh 2 m o l 葡萄糖提高到吹脱后的 1 4 3 m o lh 2 m o l 葡萄糖。这些研究表明，h 2 和c 0 2 的顺利排除或者含量的减少 可以促进细菌的产氢能力，但也无疑增加了后续气体分离的难度，并且工业化 实旌起来对运行、操作都提出了较高的要求，因此，如何实施还有待于进一步 商榷。 1 3 发酵法生物制氢技术研究现状 2 0 世纪8 0 年代后，发酵法生物制氢技术以其自身的优点越来越受到研究者 的重视，在理论研究不断深入的同时，人们开始了连续流生物制氢技术的研究， 力争提高产氢效率、降低制氢成本，早日实现该技术的商品化和工业化。 1 _ 3 1 工艺型式的研究 目前应用于生物制氢的反应器型式主要有连续流槽式搅拌反应器( c s t r ) 、 升流式厌氧污泥床( u a s b ) 、填充床反应器、固定床反应器膨胀床反& 器以及 流化床反应器。衡量不同类型反应器的性能应根据2 项指标：其一是反应器的 产氢能力r v ，即单位时间、单位体积反应器的氢气产量( m 3 h 2 m 3 反应器d ) ； 另一个是反应器的产物收率r y ，即单位数量底物转化为氢气的比率( m o l h 2 m o l 底物) 。一般情况下二者成反比关系，在产氢能力较高时，产物收率普遍较低。 因此，在底物数量( 或说容积负荷) 一定的前提下，提高反应器产氢能力的同 时无疑会提高产物收率。 1 3 1 1c s t r 反应器连续流搅拌槽式反应器( c s t r ) 是目前生物制氢研究中 应用最多的反应器型式。普遍认为，c s t r 反应器的搅拌形式有利于提高传质 效率和h 2 的迅速释放，从而避免积累h 2 对生物代谢造成反馈抑制作用及h s c 0 2 的同型产乙酸转化。表1 3 总结了国内外c s t r 反应器生物制氢运行操作情况 和反应器的产氢能力( 按时间先后顺序) 。由于文献中对不同生物制氢系统的产 氢速率用不同的单位来表达，为了便于比较，对于能换算成r v 值的，根据文献 中的相关数据进行了换算。 比较而言，可以说c s t r 反应器是应用的较为成熟的一种生物制氢反应器 型式。 表1 3c s t r 反应器运行操作参数及其产氢能力 t a b l e 】一3o p e r m i o n mp a f a l t l e t e r a n dh y d r o g e nw o d u c f i o no f c s t r 微生物底物篱p a 嚣删 r v 文献 混合菌种废糖蜜3 0 0 54 3 4 941 9 4 1 0 71 0 4 1 6 1 混合菌种葡萄糖 3 051 25 9 7 1 3 8 f 8 0 1 泡台菌种葡萄糖3 5 16 08 52 8 2 。1 1 5 3 。 7 9 1 混合菌种葡萄糖3 56 71 3 3 7 1 9 b 8 1 1 混合崮种蔗糖3 56 71 3 3 1 5 8 4 b 1 8 1 1 混合菌种废糖蜜3 5 14 o 4 581 5 1 5 f 8 2 l 混合菌种葡萄糖3 64 o 7 062 8 2 3 4 6 0 5 【8 3 1 混合菌种淀粉3 5 1 】4 5 3 7 1 4 3 8 【6 2 1 塑鱼堕壁蕉壁笪圭! ! ：! 圭! ：! ! ! ! ：! ! ：l ! 型 妇c o d m 3 反应器d 根据文献所给数据计算而来 。l h 2 g v s s d 哈尔滨工业人学工学博士学位论_ 丑= 1 3 1 2u a s b 反应器升流式厌氧污泥床( u a s b ) 由l e t t i n g a 等悼圳在2 0 世纪 7 0 年代开发，多用于处理高、中等浓度的有机废水，近年来开始逐步应用到生 物制氢领域。研究者认为，与c s t r 反应器相比，u a s b 反应器的生物持有量 较高，可省去搅拌和回流污泥所需的设备和能耗。基于此，一些研究者开展了 这方面的研究工作。c h a n g 等i ”在温度为3 5 1 、p h 6 7 0 2 、h r t 4 2 4 h 的 条件下以蔗糖为底物对反应器产氢研究，获得了1 2 l h 2 恒v s s d 的产氢量；y u 等f 8 7 1 以白酒废水为原料，在温度为5 5 、p h 5 5 、h r t 2 h 的条件下获得了 9 3 3 l h j g v s s - d 。从现有资料看，不同研究者获得的u a s b 反应器的产氢能力 差别较大，其操作运行参数也不尽相同，还有待于进一步研究。 1 3 1 3 填充床和固定床型反应器研究者发现，在c s t r 和u a s b 反应器运行 过程中都不同程度出现了污泥流失现象，研究者开始考虑采用载体微生物固定 化来解决这一问题，特别是产氢细菌分离工作的进展，纯菌种的运用，进一步 推动了填充床( p a c k e d b e d ) 和固定床( f i x e d - b e d ) 反应器在生物制氢方面的应 用。p a l a z z i 等【8 s 】采用多孔玻璃珠为载体的填充床反应器，以葡萄糖为底物对 e n t e m b a c 把ra e r o g e n e s 细菌的产氢情况进行了研究。反应器操作温度4 0 c 、 p h 5 5 、h r t l 0 0 h 的条件下获得了最大产物收率3 0 2 m o l h 2 m o l 葡萄糖，而在 h r t l o h 时反应器产氢能力最高5 4 6 m 3 h 2 m 3 反应器d 。c h a n g 等1 8 9 l 采用工作容 积3 0 0 m l 的固定床反应器，以蔗糖为底物，研究了h r t o 5 5 h 范围内不同填料 对生物产氢的影响。结果表明以膨胀土为填料，h r t 2 h 时最大产率为 0 4 1 5 4 6 l h 2 l 反应器h ；活性炭为填料，h r t l h 时最大产率为1 3 2l h 2 l 反应 器h 。表1 4 总结了填充床反应器利用纯菌种进行生物制氢的研究情况，可见载 体和微生物的不同对反应器产氢速率的影响较大。目前该反应器型式主要用于 纯菌种的产氢研究，并且多采用细胞固定化技术。 1 3 1 4 膨胀床和流化床型反应器目前关于膨胀床( e x p e n d e db e d ) 反应器和流 化床( f l u i d i s e db e d ) 反应器专门用于制氢领域的研究报道还较少。王相晶【7 4 1 采 用载体陶粒固定高效产氢菌种b 4 9 ，以有机废水为底物进行了膨胀床反应器生 物制氢的研究，在容积负荷为8 1 _ 3 9 4 3 k g c o d m 3 - d 、膨胀率1 5 的条件下， 反应器平均产氢速率为6 4 4m 3 h 2 m 3 反应器d 。g u w y 等【9 2 1 以玻璃珠为载体的流 化床反应器处理生产面包的发酵废水时，研究了氢气含量与有机负荷的关系， 当有机负荷从4 0 k g c o d m 3 d 升至6 3 k g c o d m 3 d 时，氢气含量由2 9 升至6 4 。 可以看到，这种型式的反应器中普遍需要添加载体对微生物进行固定化处理， 这一方面降低了反应器的有效容积，另一方面也增加了运行操作的复杂程度。 第1 章绪论 表1 4 采用细胞固定化的填充床反应器连续流产氢对比研究 t a b l e1 - 4c o m p a r a t i v es t u d i e so nc o n t i n u o u sh 2p r o d u c t i o ni nap a c k e d - b e dt e a c t o ru s i n g i m m o b i l i z e dw h o l ec e l l s 1 3 2 产氢底物选择 1 3 2 1 纯基质资料表明口1 - 7 4 1 ，现有生物制氢技术研究所利用的基质大部分为 成分单一的纯基质。l o g a n 等睁3 1 采用间歇试验考察了不同底物的氢气产量和转 化率( 见表1 5 ) 。可以看到，理论上最大氢气产量与实际研究有着较大差别。 目前能够成功用于连续生物制氢的基本上都是溶解性的碳氢化合物，如葡萄糖、 袁1 5 不同底物总气体和氢气产量总结m 1 t a b l e1 - 5s u m m a r yo f t o t a lb i o g a sa n d h y d r o g e np r o d u c t i o nm e a s u r e du s i n gs u b s t r a t e s ( s ) * 底物( 分子式) g c o d ( m m 0 1 ) 总气体氢气产量最大氢气产量转化率 ( m 1 )m l m o l m o ls ( t o o l t o o ls )( ) 葡萄糖( c c , h 1 2 0 6 )1 0 ( 5 5 6 ) 2 4 41 2 50 9 24 2 3 蔗糖( c 6 h 1 2 0 6 )1 0 ( 2 9 2 ) 2 1 71 3 11 8 82 3 糖蜜 1 3 ( 一) 。 2 3 31 3 4b bb 马铃薯淀粉 ( c 6 h i 。0 6 ) n 1 o ( 5 1 7 ) 1 3 49 0 o 5 945 乳酸盐( c ；d s o s n a ) 1 0 ( 8 9 2 ) 7 22 3o 叭 20 5 11 ：堡壅! ! ! 塑! 塑盘3 1 ：! ! ! ：! 1 21 ：! ! ：! ! ：! 堕 ! ：! ! ! + 底物转化率的计算假定有机碳的末端产物均为乙酸，并以此计算最大氢气产量 b 表示不可计掉 1 9 哈尔滨工业大学工学博十学位论文 白糖和蔗糖等，其昂贵的价格限制了生物制氢产业化的推广。 1 3 2 ，2 有机废水( 物) 利用单一基质制取氢气的费用较高，从降低制氢成本的 角度出发，发展经济的制氢工艺如利用混合培养从生物可利用物质( 废水或有 机废物) 制取氢气已经被人们所研究，但多为间歇实验。已经研究的可利用物 质包括生活垃圾、城市固体废弃物、工业废水、城市污水污泥等等7 3 9 4 9 7 。详 见表1 - 6 。 表1 6 利用废水和废物制氢的实例牌1 t a b l e1 - 6e x a m p l e so f t h eu s ew a s t e w a t e ra n do r g a n i cw a s t ef o rh y d r o g e np r o d u c t i o n 废水种类细菌种类培养方式细菌 豆制晶废水 r h o d o b a e t e r s p h a e r o i d er v间歇培养固定纯处理 制糖废水 r h o d o b a c t e r s p h a e r o t d e0 u 0 0 1间歇培养 未固定化处理 酒厂废水 r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e 0 u 0 0 1间歇培养固定化处理 甘蔗汁废水 r h o d o p s e u d o m o n a ss p 间歇培养 固定化处理 乳清废水 r h o d o p s e u d o m o n a ss p 间歇培养固定化处理 淀粉 r h o d o p s e u d o m o n a ss p 间歇培养 未固定化处理 制糖废水 r h o d o s p i r i l l u m r u b r u m 间歇培养未固定化处理 糖蜜废水 e n t e r o b a c t e r a e r o g e n e se 8 2 0 0 5连续培莽未固定化处理 食品废水 c l o s t r i d i u mb u l y r i c w nn c i b 9 5 7 6 间歇培养固定化处理 r h o d o p s e u d o m o n a ss p h a e h o d e se 1 5 - 1 牛奶废水r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d e0 u 0 0 1间歇培养一 米酒废水厌氧污泥( 混合菌种)连续培养未固定化处理 淀粉加工废物c l o s t r i d i u mb u t y r t c u m 及间歇培养未固定化处理 e n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s h o 一3 9 有机废物厌氧污泥( 混合菌种) 间歇培养未周定化处理 城市垃圾厌氧污泥和c l o s t r i d i u m 间歇培养未固定化处理 城市同体垃圾r h o d o b a c t e r s p h a e r o i d er v间歇培养未固定化处理 目前利用有机废水和固体废弃物作为制取氢气底物的研究，仍然以纯菌种 为主，仅有y u 等8 7 1 在研究中利用了非固定化混合菌种的连续流培养从白酒废 水中制取氢气，但是他获得的产氢能力偏低。从文献数据显示i 1 ，利用剩余活 性污泥厌氧发酵制氢的产氢量更低，大约在0 0 8 m m o l h 2 g 干污泥。尽管发酵法 制氰的产氢速率较光合法要高，但用于商业化的规模生产仍然太低。但是，以 第1 章绪论 ! 。 ! 目! ! ! ! ! ! 日! ! ! ! ! ! ! ! 目自e ! ! e ! ! ! ! ! ，_ 目e ! ! ! ! ! ! ! 目 有机废水( 物) 为原材料( 底物) 无论从环境保护，还是能源生产的角度，都 具有无可比拟的优势，而工业化生产的关键在于反应器产氢能力或产氢比率的 提高，降低制氢成本。 1 3 3 控制对策研究 连续流生物制氢反应器控制对策研究的主要目标是提高反应器的产氢能力 和氢气产率，研究中普遍集中于控制参数如p h 、温度、o r p 、h r t 、容积负荷 等，近年来，借助制氢理论研究的深入，一些研究者从发酵类型的控制角度进 行有关控制对策的研究。从理论研究上看，关于金属离子等促进剂的影响目前 还少有人涉及。 1 3 3 1 发酵类型秦智【8 2 l 在以糖蜜废水为原料，对连续流c s t r 生物制氢反应 器的快速启动研究结果表明，启动初期的容积负荷直接影响系统发酵类型的形 成，通过对一级可控生态因子一容积负荷的控制，可以实现反应器发酵类型的 调控：启动时容积负荷为5 k g c o d m 3 d 左右，易形成丁酸型发酵；启动时容积 负荷在1 0 1 2 k g c o d m 3 d 范围内，易形成乙醇型发酵。刘敏f 6 2 j 在以淀粉为底 物的连续流生物制氢研究过程中发现，营养元素是发酵法生物弗4 氢反应器运行 过程中影响发酵类型的重要因素，投加氮磷复合肥达到1 0 m g l 就足以影响发酵 类型，高于1 0 m g l 时形成丁酸型发酵，低于 0 m g l 时形成乙醇型发酵。这说 明微生物顶级群落是形成特殊发酵类型的先决条件，而环境园子影响发酵类型 的重要因素。因此，对于环境中其它因子对发酵类型的影响需要做进一步的研 究。另外，已有的研究多重于控制，而轻于调节，特别是对于生物制氢反应器 所要避免形成的发酵类型一丙酸型发酵调控对策的研究，目前尚属空白。 1 3 3 _ 2 控制参数连续流生物制氢系统的控制参数一般包括容积负荷、进水浓 度、水力停留时间( h r t ) 、温度、p h 、碱度等。不同的反应器型式、所采用的 产氢菌种以及底物的种类决定了反应器控制参数的不同，见1 3 1 节。无论何种 型式的生物制氢反应器，温度多控制在3 0 4 0 ，p h 分酸性( 4 0 6 0 ) 和中 性( 6 8 + 0 2 ) 两种。而容积负荷、h r t 等参数则因反应器型式和底物不同而差 别较大。工程参数的确定，需要在大量试验的前提下获得，才能具有对工程实 际的指导意义。鉴于目前国内外的研究大都还处于实验室阶段，仅有任南琪等【1 8 1 ”1 的有机废水发酵法生物制氢技术已完成中试规模的研究。李建政f 1 0 0 1 给出了中 试反应器的最佳工程运行参数：温度3 5 ，p h 4 o 4 5 、氧化还原电位 e h 一2 5 0 m v ，h r t 4 6 h ，容积负荷为4 0 7 0 k g c o d m s d 。对于以碳水化合物为 晗尔滨工业人学工学博j 学位论文 主的有机废水，反应器最高持续产氢能力为5 7m 3 h 2 m 3 反应器d ，产氢比率为 5 4 m o lh j k g c o d 。这些控制参数的获得对发酵法生物制氢技术的工业化生产具 有重要的指导意义。 1 4 产氢发酵细菌对金属离子的需求 以往的废水厌氧生物处理问题上，人们多关注温度、p h 值、有毒物质等环 境因素及c 、n 、p 的比值等问题，而忽视了其它营养物质如金属离子的需要。 厌氧消化过程中各种微生物均各自有独特的营养要求，缺乏任何种营养均会 严重影响其活性，从而影响整个厌氧处理过程。传统观点认为，产甲烷菌如果 生长不好，其活性不能得到充分发挥，就会引起整个厌氧消化过程无法进行。 因此，在讨论厌氧消化过程中的金属离子等影响时，主要关心的就是产甲烷细 菌的需求。实际上，产酸发酵细菌的微生物学、生物化学、生态学及运行控制 对策等项研究，无疑对厌氧处理系统的成败起着关键的作用，这点已愈来愈 被人们所重视。而有机废水厌氧发酵法生物制氢技术，利用两相厌氧生物处理 工艺中的产酸相作为制氢单元，从有机废水中制取氢气。因此，在运行管理中 更要保证微生物最适宜的环境与营养条件，才能达到生物制氢和有机废水处理 的双重功效。 1 4 1 金属离子的生物功能 金属离子主要为微生物提供除碳、氮源以外的各种重要元素。凡是生长所 需浓度在1 0 。一1 0 4 m o l l 范围内的元素，可称为大量元素，例如p 、s 、k 、m 2 、 c a 、n a 和f e 等；凡所需浓度在1 0 石- 1 0 - s m o l l 范碾内的元素，贝h 称为微量元素， 如c u 、z n 、m n 、m o 和c o 等。f e 实际上是介于大量元素与微量元素间的，故 放在两处均可。当然，这种区分带有人为的和相对的性质，对不同的微生物来 说，往往会有很大差另日。例如，革兰氏阴性细菌所需的m g 就要比革兰氏阳性 细菌高1 0 倍。大量元素参与细胞结构物质的组成、能量转移、原生质胶体状态 的维持以及控制细胞渗透作用等。微量元素多是酶的活性基组分，或是酶的激 活剂。 1 4 1 1 促进作用在厌氧消化过程中，某些微量金属离子是厌氧微生物细胞合成 所必须的，适当的含量可以加速细胞的合成，还有些微量金属离子可以促进厌 氧生物化学反应进程而对厌氧消化起到催化作用，对厌氧消化起催化作用的促 进剂的研究，国内外学者取得了一些进展。m u r r a y 等【l o l l 发现，乙酸代谢时，如 第l 牵绪论 果有n io 0 0 5 m g l ，c oo 0 0 3 m g l ，m oo 0 0 4 8 m g l ，能提高大约4 2 0 的产气量； m c k i r m e y 等1 6 9 人发现，微量金属f e 、n i 、c o 、m o 、m n 、z n 、c u 在浓度为0 0 1 1 m g l 之间，能提高厌氧过程的代谢速率；s p e e c e 6 8 1 研究了美国3 0 个城市污 水处理厂污泥消化池的运行情况，当在污泥中补充f e 、c 0 、n i 等微量元素后， 甲烷菌的乙酸利用率提高，甲烷产量增加2 0 。k i d a 等1 1 0 2 1 报道了厌氧流化床处 理啤酒： 业麦芽汁过滤产生的高浓度有机废水时，废水中补充7 m g l n i 、 2 m g l e o 、3 0 m g lf e 后，t o c 负荷每天可达1 4 k g m 3 ，t o c 的去除率可达9 0 。 s t r e i c h e r 等f 6 9 1 报道了厌氧流化床处理乳清废水，投加f e 、c o 、n i 和干酵母后， c o d 负荷每天从6 k g m 3 提高到4 0 k g m ，。国内顾蕴璇等 t 0 3 也报道了在厌氧消化 过程中，投加以f e 盐为主体的可溶性营养盐，可有效地解除8 0 4 2 对甲烷菌的 抑制，降低沼气中h 2 s 的含量。 一些微量元素如：f e 、c o 、n i 、z n 、c u 、m n 、m o 、s e 、w 、b 对提高厌 氧生物处理效率有相当重要的作用。补充厌氧微生物生长的金属离予等无机营 养物质，将促进悬浮污泥总量、挂膜污泥总量的增长，并使厌氧微生物的优势 菌种分布向有利于厌氧消化的方向转移：有利于装置负荷的提升及装置产气率、 产气量的增大。 1 4 1 2 抑制作用重金属对厌氧细菌的毒性已得到共识，其中可溶性低浓度的铜 盐、锌盐和镍盐的毒性也相当大，但研究表明，当它们与硫化物形成难溶盐类 后，对产甲烷细菌无明显不良反应。因此，重金属对厌氧细菌的毒性取决于其 离子在废水中的真实浓度。通常处理过程中产生的阴离子如s 弘和c 0 3 2 等，它 们会与废水中的金属离子迅速地发生沉淀反应，因而会使原废水中的金属离子 浓度下降，在降低金属离子毒性的同时，也可能导致某些重要的微量金属元素 的浓度过低。表l 一7 总结了有关文献中关于重金属毒性的研究结果1 1 叫。可以看 到，已有的研究多关注于重金属对产甲烷菌的毒性。发酵法生物制氢采用有机 废水为底物，依废水的种类和产生工艺的不同，废水中豹成分也相对复杂，既 含有微生物生长和产氢过程所必须的金属离子等物质，也可能含有某些抑制其 生长和产氢过程的金属离子，因此，有必要研究金属离子对产氢发酵细菌的影 响，以便在实际运行过程中采取适当的调控措施。 1 4 2 生物利用率 对于金属离子来说，还存在一个生物利用率的问题。通常情况下较多关心 的是金属离子的溶解度，一般n a 、m g 、z n 的溶解度不存在特别问题。但是， 。：一尘兰坚彗塑鎏鲨堡二一 表1 7 不同重金属离子对厌氧污泥的i c 5 0 值 t a b l e 1 - 7 t h e i c 5 0 o f d i f f e r e n t h e a v y i o n m e t a l e f f e c t o n a n a e r o b i c s l u d g e 重金属i c 5 0 值( m g l ) 底物接种污泥 注：i c 5 0 值为使厌氧污泥产甲烷活性下降5 0 时抑制物的浓度 接种污泥中除带者外均未经驯化 有些元素如铁，在中性p h 情况下，由于溶解度太低以致于不能容易地被生物体 所利用。除了溶解度之外，金属离子还必须能够被细胞所吸收。有两种可能途 径【1 0 副。某些金属离子如钠穿过细胞膜上的特定通道和泵。还有一些属离子，可 通过特殊的螫合配体可以使其很容易地通过细胞膜。例如f e 与肠杆菌素( 一种 铁质体s i d e r o p h o r c s ) 螯合，通过细胞膜处的一个特定受体蛋白，在a t p 驱动下 被摄取到e c o l i 细胞内。 金属元素的生物有效性是一个比微量金属元素浓度本身更为重要的概念， 它是指可以被微生物有效利用的微量金属元素的浓度。s p e e c e 等例首先测定厌 氧消化池的污泥中溶解性铁浓度为1 2 m g l ，后又向反应器中投加了f e c l 2 ，结 果第二天产气量就增加了1 倍，说明即使有高浓度的溶解性铁存在，但由于铁 的生物有效性受到限制也同样会影响产甲烷过程。但到目前为止，还不能给出 一个十分明确的衡量某种元素的生物有效性的方法，只是关于微量金属元素在 厌氧生物反应器中的生物有效性对反应器运行的重要性已经得到了普遍的认 议。 1t 4 3 金属离子对产氢发酵细菌的影响 从已有的研究结果来看，金属离子对厌氧处理过程( 微生物) 影响的研究 主要集中在产甲烷菌上，这可能主要是因为普遍认为厌氧生物处理的限速步骤 是产甲烷阶段。已有的关于金属离子对产氢发酵细菌影响的研究较少。国外 y o u n g 等 1 0 6 报道了以蔗糖为底物，f e c l 2 浓度为8 0 0 m g l 和4 0 0 0 m g l 时可以提 高混合菌种是大产氢量( 1 3 1 9 m l h 2 g ) 和最大比产氢速率( 2 4 m lh 以v s s h ) 。 王相晶【7 4 j 研究了一定浓度的铁、镁对产氢发酵细菌b 4 9 生长和产氢过程的影响。 上述研究均为间歇试验，而且有关其它金属离子对产氢发酵细菌影响的研究还 是空白。对产氢细菌而言，生物制氢反应是由氢酶催化的，而金属离子在维持 氢酶结构和功能上常常起着重要的作用。根据氢酶的结构成分和微生物营养学， 结合已知金属离子的生理功能来研究产氢发酵细菌的需求，对于产氢发酵细菌 的培养和提高产氢能力，乃至工程调控都具有指导意义。 1 5 本课题的目的、意义及主要研究内容 1 5 1 课题来源 本研究课题来源于国家杰出青年科学基金项目“发酵法生物制氢生理生态 学与 二程技术研究”，并得到国家高技术研究发展计划( 8 6 3 ) 项目“有机废水 发酵法生物制氢技术生产性示范工程”( n o 2 0 0 3 a a 5 1 5 0 3 0 ) 、国家高技术研究 发展计划( 8 6 3 ) 引导项目“发酵法生物制氢高效菌种产业化技术” ( n o 2 0 0 2 a a 0 0 1 0 3 4 ) 和国家重点基础研究发展规划( 9 7 3 ) 项目“生物质高效 制氢反应机理”( n o 0 2 0 0 0 0 2 6 4 0 2 ) 和黑龙江省重大科技攻关项目 “g a 0 l c 2 0 1 0 1 ”的联合资助。 i 5 2 课题研究的目的和意义 任南琪开创的利用厌氧活性污泥为菌种的连续流发酵法生物制氢技术历经 1 5 年的研究与开发，已取得较大的成果。首先发现了不同于酵母菌乙醇发酵的 产氢能力很强的乙醇型发酵类型，而高效产氢新菌株b 4 9 的分离，为其提出的 乙醇型发酵产氢理论提供了客观依据。同时建立起细菌产氢发酵生理生态学 邢论。基于理论研究成果，开发m 高效的生物制氢反应器，针对生物制氢反应 哈尔滨工业大学工学博十学位论立 器不同发酵类型的产氢能力和调控对策开展了一系列研究，尤其是中试研究的 成功，为该技术的工业化生产奠定了良好基础。 为进一步加快发酵法生物制氢技术的工业化进程，从细胞水平和群体水平 上探讨提高细菌产氢能力和生物制氢反应器运行稳定性是十分必要的。其中， 深入探讨金属离子、还原剂、生长因子等对产氢细菌的活性的影响，将为提高 产氢能力提供理论指导。本课题基于此目的，研究金属离子和半胱氨酸对产氢 能力的影响及对产氢系统的调控。 1 5 3 课题的主要研究内容 ( 1 ) 从细胞水平上研究金属离子和还原剂( 半胱氨酸) 对乙醇发酵产氢细 菌生长和产氢过程的影响。优化其生长和产氢条件，为进一步的扩大培养和反 应器的生物强化提供理论指导和技术支持。 ( 2 ) 从群体水平上研究金属离予对混合细菌产氢能力的影响。在细胞水平 研究基础上，考察对混合菌种产氢有促进作用的金属离子，探讨其作用机理； 同时考察对混合菌种产氢有抑制作用的金属离子，并获得其不影响产氢的允许 浓度范围，为发酵法生物制氢技术的产业化实施奠定基础。 ( 3 ) 在上述研究基础上，运用生态理论指导生物制氢反应器的运行。以具 有较高产氢能力的乙醇型发酵为目标发酵类型，探讨投加金属离子提高系统的 产氢能力；投加还原剂( 半胱氨酸等) 对生物制氢反应器发酵类型转型的影响， 从而维持乙醇型发酵运行的稳定性。 第2 章试验装置与方法 2 1 试验装置及材料 2 1 1 连续流试验装置 连续流生物制氢试验装置及工艺流程如图2 1 所示，采用高效产酸发酵 反应器( c s t r ) ( 发明专利号9 8 2 4 0 8 0 1 3 ) ，内设气一液固三相分离装置，为反 应区和沉淀区的一体化结构。反应区有效容积为9 2 l ，沉淀区为5 8 l 。反 应器内设有搅拌器，通过水封保证反应区良好的厌氧条件及气体收集完全。 反应器由有机玻璃制成，采用将电热线缠绕在反应器外壁上的加热方式，试 验温度均控制在3 5 0 5 。 1 配水箱2 计量泵3 生物涮氢反应器4 搅拌机 5 加热及温控装置6 水封7 湿式气体流量计 图2 - 1 连续流试验装置及流程示意图 f i g 2 一is c h e m a t i cd i a g r a m o f h 2 一p r o d u c i n gf e r m e n t a t i o n 哈尔滨工业人学工学博上学位论文 2 1 2 静态试验装置 为探讨金属离子对混合菌种产氢能力、产氢过程的影响，研究h p f b b 4 9 的产氢特性，进行了间歇培养试验，试验装置如图2 2 所示。反应容器为 i o o m l 的磨口锥形瓶。通过恒温摇床将温度控制在3 5 1 ，并确保反应器 巾的传质效率。为保证反应系统处于无氧条件，试验前用高纯氮气吹脱。正 常运行条件模拟动态模型。试验中定对从反应瓶中取样分析发酵产物或记录 产气量。所产生的气体用气体计量管来计量。在读取产气量时，要保持水准 瓶内的液面与计量管内液面相平，使气体计量管内、外气压相同，均为常压， 此时可进彳亍产气量计数。 取样u 或 氨气吹扫 图2 - 2 静态试验装置 f i g 2 - 2e x p e r i m e n t a la p p a r a t u so fb a t c h 2 2 污泥接种及高效产氢菌种培养 如文内没有特殊说明，连续流生物制氢反应器接种的污泥均来自哈尔滨 市政污水排放沟底泥和哈尔滨中药二厂污水处理车间产酸反应器及好氧交 叉流反应器污泥。所有污泥经淘洗后以糖蜜为底物曝气培养2 周，此时污泥 颜色由以前的黑色、灰黑色或灰色变为黄褐色，污泥絮体沉降性能良好。生 物相观察可见污泥内生物种类非常丰富，球菌、链球菌、杆菌以及多种原生 动物和后生动物都很多。 问歇培养试验中，混合菌种取自处于不同运行阶段、稳态运行的连续流 生物制氢反应器。种泥取出后需在室温下静置2 h ，弃掉约l 3 上清液后接种 入反戍瓶，以尽量减少与种泥一同带入的各种发酵产物所产生的背景值。纯 第2 章试验装置与方法 菌种采用林明【3 9 】分离到的乙醇型发酵高效产氢菌株b 4 9 ，在同一血清瓶中 培养，并于对数生长期末期进行转接。 2 3 试验用底物 连续流生物制氢反应器的底物采用甜菜制糖厂的废糖蜜( 含总糖分( 转 化糖) ：4 8 5 8 ) ，人工配制成糖蜜废水作为底物连续进水，在糖蜜废水配 制过程中投加少量n 和p ，使进水c o d ：n ：p 一1 0 0 0 ：5 ：1 。 混合菌种间歇培养采用葡萄糖为底物，并根据研究目的所加入的不同金 属离子溶液或单质金属元素，不加入任何其它营养元素。 乙醇发酵细菌b 4 9 培养采用基础培养基，它是经过煮沸、充氮、灭菌 过程处理的无氧无菌培养液，其成分如下： 葡萄糖2 0g l ；蛋白胨4 9 l ；牛肉膏2 9 l ；酵母汁l g l l ；n a c l4 9 l ： k z h p 0 41 5 9 lm g c l 2o 1 9 l ；f e s 0 4 7 h 2 0o 1 9 l ；l 半胱氨酸0 5 9 l ； 维生素液1 0 m l ：微量元素液1 0 m l ；刃天青( 0 2 ) l m l ；p h 6 6 4 。 维生素液：钻铵素0 0 lg l ；抗坏血酸o 0 2 5g l ；核黄素0 0 2 5g l ； 柠檬酸o 0 2g l 吡多醛0 0 5g l 叶酸o 0 1g l ；对氨基苯甲酸0 0 1g ，l ； 肌酸0 0 2 5 l 。 微量元素液：m n s 0 4 7 h 2 0 o 0 1 g lz n s 0 4 7 h 2 0o 0 5 l ；h 3 8 0 3 o 叭g l ；n ( c h 2 c o o h h4 5 l ；c a c l 2 2 h 2 0 0 0 1e d l ；n a 2 m 0 0 40 0 1 g l ：c o c l 2 6 h 2 0 0 2g l ；a 1 k ( s 0 4 ) 20 0 1 g l 。 纯菌种h p f bb 4 9 间歇实验底物根据研究目的不同，在基础培养基各成 分上作相应调整，详细内容见论文第5 章各节的实验方法。 2 4 分析方法 2 4 1 主要分析项目 试验中的主要分析项目与方法列于表2 i 中，具体方法见参考文献 聊1 。 2 4 2 其它测定项目 2 4 2 1 葡萄糖采用葡萄糖含量测定试剂盒进行测定。 2 4 2 2 有机酸组成及含量采用气相色谱仪( g c 1 2 2 型) 分析，气相色谱 哈尔滨工业大学工学博卜学位论文 分析条件：色谱配置2 m 巾5 m m 不锈钢螺旋柱，内装2 h 3 p 0 4 处理过的 g d x 1 0 3 担体( 6 0 8 0 目) ，载气( 氮气) 流量5 0 m l m i n ，燃气( 氢气) 流量5 0 m l m i n ，助燃气( 空气) 流量5 0 0m l m i n ，柱温1 9 0 。c ，汽化室温 度2 2 0 。c ，检测温度2 2 0 。 表2 1 分析项目及分析方法 t a b l e 2 - 1i t e m sa n dm e t h o d so f a n a l y s i s 铡定前样品预处理：水样经离心或用普通定性滤纸过滤后，取5 m l ，同 时加入6 m o l l h c l 或h 2 s 0 4 1 - 2 滴进行酯化处理。图2 3 为标样分析和反应 器液相末端产物图谱，表2 - 2 为标样与液样的测定结果。 表2 2 标样与水样色谱数据比较 ! ! g ：! ：! 兰! 竺2 坚! ! ! ! ! ! 璺! 坚! 竺! ! ! 巴! ! ! ! ! ! ! 璺苎! 墅! 里! 篓! 标准样水样 挥发酸组分保留时间浓度 保留时间浓度 ( m i n ) ( m g l ) ( r a i n ) ( m g l ) 乙醇o ，6 33 7 0 8 70 6 3 4 2 9 3l 乙酸1 1 15 1 2 9 01 1 2 6 5 7 7 8 丙酸2 ，1 05 0 0 7 2 2 1 28 6 0 0 j 酸4 ，1 64 8 3 8 2 4 1 72 3 1 9 2 戊酸8 7 94 8 8 1 7 8 85 8 7 3 0 ( a ) 色谱标样图谱( b ) 水样图谱 圈2 - 3 色谱标样与水样分析图谱 f i g 2 3t h ec h r o m a t o g r a mo f f e r m e n t a t i o np r o d u c t i o na n dm a r k s 2 4 2 3 氧化还原电位氧化还原电位简写为鼢，单位伏( v ) 或毫伏( m v ) ， 通常是用一个铂丝电极与一个标准参考电极同时插入待测体系中测得。电极 显示的电位差在一个敏感的伏特计上读出。采用p h s 2 5 型酸度计测定时， 单位为m v ，正极接饱和甘汞电极，负极接铂电极，所测结果为负值。测定 中采用如图2 4 所示装黄，待通水一段时间，装置内气泡被排净，显示值稳 定后测定。 图2 4 氧化还原电位测定装宣 f i g 2 4m e a s u r i n ge q u i p m e n to f r e d o xp o t e n t i a l 哈尔滨工业大学工学博士学位论文 水样的氧化还原电位( e ) 按下式计算： e h = e 曲一e 。f t 2 - 1 ) 式中b 6 。由铂电极一饱和甘汞电极测得的氧化还原电位值( m v ) ； e k 广一饱和甘汞电极电位值( m v ) 。 2 4 2 4 金属离子定性分析采用美国p e 公司生产的全谱直读电感耦合等离 子发射光谱仪p l a s m a 3 0 0 0 测定。波长范围1 6 5 r i m 7 8 0 n m ，采用端视观测法， 分辨率 0 1 2 n m ，样品提升量l m l m i n 。 定量分析采用p l a s m a 3 0 0 0 或上述公司生产的单道扫描型光谱仪 p l a s m a l 0 0 0 测定。分析条件：波长范围1 6 5 r i m 一7 7 0 r i m ，采用侧视观测法， 分辨率0 1 2 n m 。r f ( 射频) 功率1 0 0 0 w ，p l a s m a 气流量1 5 l r a i n ，辅助气 体流量1 l r a i n ，雾化气流量1 l m i n ，样品提升量l m l m i n ，观察窗口0 0 5 r i m ， 蜂窗口0 0 4 n m ，