（食品科学与工程专业论文）鲢鱼肌球蛋白重链球状结构域的cdna克隆及结构解析.pdf

上海海洋大学硕士学位论文 鲢鱼肌球蛋白重链球状结构域的c d n a 克隆及结构解析 摘要 鲢鱼( h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ) ，又名白鲢，与鲤鱼( c y p r i n u sc a r p i o ) 和草 鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 一样同属于鲤科鱼类，是我国淡水鱼资源中具有代表 性的鱼种之一。与其它种类的淡水鱼相比，鲢鱼具有低值、高产的特点，因此， 也是加工利用的主要对象。青、草、鲢、鳙鱼均属于广温性的淡水鱼类，它们的 肌肉功能伴随栖息水温的变化而变化，以至于它们能够周年生活在温差极大的栖 息环境中，淡水鱼所具有的这种独特的温度适应能力与其肌肉蛋白质主要是肌球 蛋白性质的季节变化是密切相关的。在鱼类肌肉蛋白质中，6 0 以上是构成肌原 纤维的蛋白质，肌原纤维蛋白是由肌球蛋白，肌动蛋白和调节蛋白等组成，肌球 蛋白能和肌动蛋白结合形成细胞运动如胞质分裂和肌肉收缩等所需的物质，有 “分子马达”之美誉。其中肌动蛋白和调节蛋白在肌原纤维蛋白中所占的比例较 小，肌球蛋白构成了鱼肌肉肌原纤维蛋白的6 0 7 5 ，它的性质主要决定了肌原 纤维蛋白的性质，进而影响鱼肌肉蛋白质的加工适性。肌球蛋白分子由两条分子 量约2 0 0 k d a 的重链亚基和四条分子量约2 0 k d a 的轻链亚基组成，重链亚基含有 多种同工型( i s o f o r m ) ，它们分别由不同的同工型基因编码，因此，肌球蛋白具 有“多基因家族”之称。同时，重链含有多个不同的结构域，如位于氨基端具有球 状结构的重酶解肌球蛋白( h m m ) ，和位于羧基端具有a 螺旋结构的轻酶解肌球 蛋白( im m ) 。前者包括s l 和s 2 ，具有a t p 酶的活性和与肌动蛋白结合的能力， 后者具有使肌球蛋白在生理条件下形成丝状的能力，它们决定了鱼肌肉蛋白质多 种重要的功能性质。s 1 结构域自氨基端起可以被胰蛋白酶水解为2 5 、5 0 和2 0 k d a 三个片段。两个表面环l o o p l 和l o o p 2 分别位于2 5 与5 0 k d a 片段和5 0 与2 0 k d a 片段的连接区域，它们分别与a t p 和肌动蛋白的结合位点有关，决定了肌球蛋白 的“分子马达 功能。而轻链包括2 条具有不同分子量的碱轻链( a 1 和a 2 ) 和 2 条相同的d t n b 轻链，具有调节磷酸化途径等作用。 早期的研究中，我们报道了从冬季和夏季鲢鱼( h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ) 的快速肌中分离到两种肌球蛋白重链同工型基因，分别命名为低温型( s c w ) 和高 温型( s e s ) 。本文根据该两种同工型基因在37 端展现的明显差异，设计了2 个特 异性的反向引物，以鲤科鱼类肌球蛋白重链5 端的保守序列为正向引物，通过 上海海洋大学硕士学位论文 l o n g p c r 对编码鲢鱼两种肌球蛋白重链同工型的球状结构域( s u b f i - a g m e n g t 1 ， s 1 ) 的全长基因进行了克隆和测序，并推断出它们一级结构的氨基酸序列。研究 结果表明：s c w 与s c s 在s 1 的初级结构上显示8 0 5 的同源性、与已经报道的 草鱼( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) 低温型( g e l 0 ) 有9 7 2 的高同源性；s c s 则与 草鱼中间型( g c i ) 和高温型( g c 3 0 ) 显示了分别为9 8 4 和9 7 1 的高同源性。低 温型的s c w 和g c l 0 在s 1 初级结构上展现的特有变异主要发生在4 3 个氨基酸残 基位点，其中1 5 个属保守性残基。对s 1 区域中两个功能性的表面环l o o p l ( 与 a t p 结合位点有关) 和l o o p 2 ( 与肌动蛋白结合位点有关) 的结构解析发现：s c w 和g c l 0 在两个表面环的长度、残基电荷分布和氨基酸组成等方面与其它同工型 之间存在明显差异，揭示了这两个表面环的结构差异可能影响了栖息于不同环境 温度下的淡水鱼的肌球蛋白“分子马达”功能。分子系统树的分析结果进一步证明 了鱼类栖息环境温度对其肌球蛋白同工型的基因和功能歧化的影响。 关键词：鲢鱼，肌球蛋白，s 1 重链，c d n a 克隆，氨基酸序列 i i 上海海洋大学硕士学位论文 c d n a c l o n i n ga n d s t r u c t u r a la n a l y s i so ft h eg l o b u l a rh e a d 一 l - o rm y o s l nh e a v vc h a l n f r o ms i l v qh v p o p h t h a l m i c h t h 3m o l i t r i x s i l v e rc a r ph r p o p h t l l a l m t c a t a y sm o l t t r t x ， a bs t r a c t s i l v e rc a r p ( h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ) ，c o m m o nc a r p ( c y p r i n u sc i w p i o ) a n d g r a s sc a r p ( c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l a ) b e l o n gt ot h ec y p r i n i d s s i l v e rc a r pi so n eo f t h em o s tr e p r e s e n t a t i v es p e c i e si nf r e s h w a t e rr e s o u r c e so fc h i n a c o m p a r e d 、i mo t h e r t y p e so ff r e s h w a t e rf i s h , s i l v e rc a r p i sat y p eo fl o w v a l u ea n dh i g h - y i e l d i n g f r e s h w a t e rf i s h t h e r e f o r e ，i ti sc o n s i d e r e dt ob ea v a i l a b l ef o rp r o c e s s i n g m y o s i ni s e s s e n t i a lf o ra c t i v i t i e sa sd i v e r s ea st h ec o n t r a c t i l ep r o c e s s ，c y t o l 【i n e s i s ，a n do r g a n e l l e m o t i l i t y , a n di th a sb e e ns t u d i e di n t e n s i v e l y m y o s i na m o u n t st o a b o u t6 0 7 5 o f m y o f i b r i l l a rp r o t e i n i nf i s h s k e l e t a l m u s c l e s ，a n di t sp r o p e r t i e sm a i n l yd e c i d e p r o p e r t i e so ft h em y o f i b r i l l a rp r o t e i n i ti s w e l lk n o w nt h a tc o n v e n t i o n a lm y o s i n m o l e c u l e sc o n s i s to ft w om y o s i nh e a v yc h a i ns u b u n i t s ( 2 0 0k d ae a c h ) a n df o u rl i g h t c h a i ns u b u n i t s ( 2 0k d ae a c h ) t h em y o s i nh e a v yc h a i nc o n t a i n sm u l t i p l ei s o f o r m s ， a n dt h e s ei s o f o r m sa r ee n c o d e db yd i f f e r e n ti s o f o r mg e n e s t h u s ，t h em y o s i ni sc a l l e d m u l t i g e n ef a m i l y m y o s i nh e a v yc h a i n ( m y h ) p r o v i d e sb o t h t h em o t o ra n df i l a m e n t f o r m i n g f u n c t i o n sa n dc a r lb ed i v i d e di n t ot w of u n c t i o n ad o m a i n s ：ag l o b u l a ra m i n o - t e r m i n a l h e a dd o m a i n , w h i c hc o n t a i n st h em o t o rf u n c t i o i l ，a n d a l l e l o n g a t e d a - h e l i c a l c o i l e d c o i lc a r b o x yr o dd o m a i n ，w h i c hc o n t a i n sf i l a m e n t f o r m i n gp r o p e r t i e s a t p a s e c a t a l y t i ca n da c t i n - b i n d i n gs i t e sa l el o c a t e di nt h em o t o rd o m a i no fm y h c a l l e d s u b f r a m e n t i ( s1 ) t h e s et w os i t e sa ler e l a t e dt ot w os u r f a c el o o p s ，w h i c hs p a nt h e j u n c t i o n sb e t w e e nt h e2 5a n d5 0 ，a n db e t w e e n5 0 - a n d2 0 - k d at r y p t i cf r a g m e n t si nt h e s1d o m a i n , r e s p e c t i v e l y i np r e v i o u ss t u d y , w er e p o r t e dt h a tt w ot y p e so fm y o s i nh e a v yc h a i ni s o f o r mg e n e w e r ei s o l a t e df r o mf a s ts k e l e t a lm u s c l e so fs i l v e rc a r p ( h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ) a c c l i m a t i z e di nw i n t e ra n ds u m m e r , a n dn a m e dt h el o wt e m p e r a t u r e t y p e ( s c - w ) a n d 廿1 e1 1 i g ht e m p e r a t u r e - t y p e ( s c s ) ，r e s p e c t i v e l y i nt h i ss t u d y , t w og e n e s p e c i f i cr e v e r s e i i i 上海海洋入学硕士学位论文 p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h es t r i k i n gd i f f e r e n c e si nt h en u c l e o t i d e s e q u e n c e so f3 - t e r m i n a l sb e t w e e nt h et w ot y p e so fs i l v e rc a r pm y o s i nh e a v yc h a i n i s o f o r m ，a n daf o r w a r dp r i m e rw a sd e s i g n e dw i t hr e f e r e n c et oc o n s e r v e dn u c l e o t i d e s e q u e n c e si n5 - t e r m i n a lo fc y p r i n i d a e l o n g - p c rw a sp e r f o r m e dt oa m p l i f yt h e c o m p l e t ec d n a se n c o d i n gm y o s i ns u b f f a g m e n t 一1 ( s1 ) h e a v yc h a i n sf o rt h et w ot y p e s o fi s o f o r m d n as e q u e n c i n go fb o t hs t r a n d sw a sc a r r i e do u t ，a n dt h ea m i n oa c i d s e q u e n c e sf o rt h et w ot y p e so fm y o s i ns1h e a v yc h a i nw e r ed e d u c e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep r i m a r ys t r u c t u r eo f m y o s i ns1h e a v yc h a i np r o d u c e d8 0 5 i d e n t i t y b e t w e e ns c wa n ds c s w h e r e a sah i g hs e q u e n c ei d e n t i t yo f9 7 2 w a sf o u n d b e t w e e ns c - wa n dg el0 w h i c hw a sr e p o r t e dt ob ei s o l a t e df r o m10 0 c a c c l i m a t e d g r a s sc a r p i nc o n t r a s t ，t h ea m i n oa c i ds e q u e n c eo fs1h e a v yc h a i nf o rs c sr e v e a l e d m u c hh i g h e ri d e n t i t yt ot h o s eo fg e l ( 9 8 4 ) a n dg c 3 0 ( 9 7 1 ) ，w h i c hw e r ei s o l a t e d f r o m3 0 。c a c c l i m a t e dg r a s sc a r p c o m p a r i n gw i t ht h eo t h e rm y o s i ns1 h e a v yc h a i n i s o f o r m s ，i s o f o r m - s p e c i f i cd i f f e r e n c e sf o rs c - wa n dg cl0w e r ec l e a r l yo b s e r v e di n4 3 a m i n oa c i dr e s i d u e s f u r t h e r m o r e ，a m o n gt h e s ea m i n oa c i dm u t a t i o n s ，15m u t a t i o n s o c c u r r e da tt h ec o n s e r v e dr e s i d u es i t e s a d d i t i o n a l l y , s c - wa n dg cl0s h o w e ds t r i k i n g d i f f e r e n c e sc o m p a r e dw i t ht h eo t h e rs 1h e a v yc h a i ni s o f o r m si nt h et w os u r f a c el o o p s ， l o o p1l o c a t e dn e a rt h ea t p - b i n d i n gd o m a i na n dl o o p2 ，w h i c hi so n eo ft h ea c t i n b i n d i n gd o m a i n s ，s u g g e s t i n gt h a tt h ec h a n g e si nt h ef l e x i b i l i t yo ft w os u r f a c el o o p s c a u s e db ym o d u l a t i o n si nl e n g t h ，a m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n dc h a r g ec a np l a ya n i m p o r t a n tr o l ei na d a p t a t i o no fm o t o rf u n c t i o nt ol o we n v i r o n m e n t a lt e m p e r a t u r e p h y l o g e n e t i ca n a l y s i sf u r t h e rd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee f f e c t so fe n v i r o n m e n t a l t e m p e r a t u r eo ng e n o m i cd i v e r g e n c ea n df u n c f i o n a le v o l u t i o no ff i s hm y o s i ni s o f o r m s k e y w o r d s ：s i l v e rc a r p ，m y o s i n ，s1h e a v yc h a i n , c d n ac l o n i n g ，a m i n oa c i ds e q u e n c e i v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：圣j 南琦 日期：加p 年1 月7 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密 口 ，在年解密后适用本版权书。 不保密 _ 学位论文作者签名：杏j 召祷 日期：加f 拜f 月列日 指导教师签名： 日期：加【。年f 月日 上海海洋大学硕七学位论文 第一章引言 1 1 我国水产资源及其利用现状 我国是世界水产养殖大国，水产品养殖产量占世界的7 0 ，养殖水产品不 仅满足了国内市场供应，而且对我国水产品的国际贸易也起到了重要作用【l 】。改 革开放以来，我国水产业得到了很大发展。1 9 9 0 年水产品总产量为1 2 3 7 万吨， 跃居世界第一位。1 9 9 3 年高达1 8 2 6 万吨，比上年增长2 6 9 万吨，遥遥领先于世 界主要渔业国家。我国水产品产量的增长，主要靠养殖业，养殖产量由1 9 7 8 年 占总产量2 6 ，近几年提高到5 0 ，1 9 9 3 年达5 2 。目前我国出口水产养殖产品 约占出口总额的5 0 以上，名优养殖产品出口额已占我国自产水产品出口的 9 0 。2 0 0 7 年，国内自产资源中养殖水产品出口量1 2 3 9 万吨，出口额4 9 8 亿 美元，占水产品出口总量额的4 0 4 和5 1 1 t 2 1 。同时，我国又是水产品的消费 大国，2 0 0 6 年全国水产品产量达到5 2 9 0 4 万吨，人均占有量4 0 6 公斤超过 水产品世界人均占有量一倍多【3 】。水产品以其丰富的营养和鲜美的味道深受我国 广大消费者的喜爱，消费量逐年提高。水产品作为我国城乡居民摄取动物性蛋白 质的主要食品种类之一，已经占我国城乡居民动物性蛋白质总摄入量的1 6 ， 其质量安全问题关系到国计民生，备受党中央、国务院、各级政府和平民百姓 的重视我国还是世界上水产品第一大出口国，第五大进口国，进出口总量2 0 0 6 年达到6 3 3 7 万吨，进出口总额达到1 3 6 5 亿美元【3 】，我国水产品的质量安全 同时受到各国的关注。 自上世纪九十年代以来养殖淡水鱼的产量逐年递增，至2 0 0 5 年已达到2 2 6 3 万吨，连续多年居世界首位，在淡水鱼中，青、草、鲢、鳙四大家鱼占有很大的 比重，占全年淡水鱼总产量7 0 左右【3 】。我国的淡水鱼养殖水面积约有6 万亩， 淡水鱼5 0 0 多种，其中鲢鱼、鲤鱼、草鱼、鳙鱼占绝大部分，尤其是鲢鱼，由于 易饲养、成长快、成本低、营养丰富，一直受到渔农的青睐。鲢鱼又名鲢子、白 鲢、跳鲢，是四大家鱼之一，原产于我国南方一带，鲢鱼的营养成分全面，不 仅有蛋白质、脂质、钙磷、铁等，在其鱼油中还含有防止心脏病的特效成分 如e p a 、d h a 。我国传统淡水鱼基本以鲜活或冷冻方式进入市场总体a n - r - 利用 技术水平低【4 ，5 】。而且鲢鱼还具有一个致命的缺陷，土腥味、骨刺多，从而导致 市场竞争力不强，销路受到严重局限，经济效益低【6 暹】。 弹性是衡量鱼糜制品质量的重要指标，构成弹性的食感要素有硬度、强度、 上海海洋大学硕士学位论文 咀嚼感、组织感、粘性等。关于鱼肌肉蛋白质的凝胶形成能力决定其弹性的理论 已经得到了共识，鱼糜凝胶强度高，说明其新鲜度品质好，能加工出弹性好的产 品。而肌肉蛋白质的凝胶化功能主要与构成其主要成分的肌球蛋白的热稳定性和 流变学性质有关【9 】。由于淡水鱼的栖息环境如温度、光照等条件具有周年变化的 特点，以至于它们肌肉蛋白质的功能性质也发生季节性的变化，由此严重影响了 鱼糜加工制品的质量。 1 2 鱼类肌肉蛋白质的特点 1 2 1 鱼类蛋白质的组成 在鱼肌肉蛋白质的组成中，肌原纤维蛋白占了6 0 7 5 ，其性质主要影响 了鱼肌肉的加工适性。肌原纤维蛋白是由肌球蛋白、肌动蛋白和调节蛋白组成的， 其中肌动蛋白和调节蛋白在肌原纤维蛋白中所占比例较小，并且它们在基因进化 上属于较保守的蛋白，因此发生基因变异的几率很小。而肌球蛋白占肌原纤维蛋 白的5 0 以上，其基因在生物进化过程中的变异性很大【1 。因此，如果认为淡 水鱼肌肉肌原纤维蛋白质性质的变化主要源于肌球蛋白的变化，并非言过，甚至 可以认为淡水鱼肌肉的加工适应主要是由肌球蛋白所决定的。 1 2 2 淡水鱼类栖息环境的特点及其对肌肉蛋白质功能性质的影响 包括四大家鱼( 青、草、鲢、鳙) 在内的大部分淡水鱼属广温性的鱼类，它 们的肌肉功能伴随环境温度的变化而发生变化，以至于他们能够周年生活在温差 极大的栖息环境中【1 1 1 。淡水鱼所具有的这种独特的温度适应能力与他们肌肉蛋 白质性质的季节性变化是密切相关的【12 1 。前人的研究发现，鱼类肌肉蛋白一般 比其他动物如鸟类、哺乳动物的肌肉蛋白质更容易变性，且蛋白变性难易程度与 鱼的种类密切相关【l 孓1 5 j 。h a s t i n g s 等认为这种不同是由于鱼类属于冷血动物而鸟 类和哺乳动物属于温血动物而导致的【1 6 】。9 0 年代初，o o l d s p i n k 等人提出了鱼肌 肉肌原纤维蛋白质性质的变化源于肌原纤维蛋白质系统的重建【l 7 1 ，如图卜l 所 示，他们认为一些鲤科鱼类是通过改变肌肉肌原纤维系统来适应季节环境温度的 变化。鱼类肌肉蛋白质在冻藏中的不稳定性与其热稳定性密切相关，而鱼类肌肉 蛋白质的热稳定性又与其栖息水温密切相关，冷水鱼种肌肉蛋白的热稳定性要低 于暖水鱼种【l8 1 。一般说来，耐冻性强的鱼有：海鳗、鲷鱼、鲨鱼等；耐冻性差 的鱼有：狭鳕、鲆鲽、黄花鱼、鲐鱼、鳄鱼、鲢鱼、鳙鱼等 19 1 。 2 上海海洋大学硕士学位论文 袋 尹 石石磊磊蒿面忑两 _ - _ _ - _ - _ _ 。_ - _ _ _ - 。_ _ _ 。_ _ - _ _ _ 。_ - 。_ - _ 。- _ 余 簿 图1 - 1 季节温度变化引起的代谢活动系统重建机理 f i g 1 1 r e c o v e r ym e c h a n i s mo f m e t a b o l i ca c t i v i t ya s s o c i a t e dw i t hs e a s o n a la c c l i m a t i z a t i o n 1 2 3 肌球蛋白概述 肌球蛋白是一种马达蛋( 3 ( m o t o r p r o t e i n ) ，由k u e h n e 于1 8 6 4 年在研究骨骼肌 收缩时发现并命名2 0 1 。肌球蛋白参与了包括肌肉收缩、趋化性、胞质分裂、胞 饮作用、靶向小包运输及信号传导等内在的多种细胞活动，是生物体内很重要的 一大类蛋白【2 1 1 。 1 2 3 1 肌球蛋白的种类 肌球蛋白是一种超级大家族的蛋白质，目前发现的肌球蛋白已经有2 4 判2 2 】， 每一类肌球蛋白都以罗马数字表示，它们的结构和功能各有不同：如肌球蛋白i 在生物体内的作用是细胞运动，胞饮作用和泡液收缩【2 3 ，2 4 】，骨骼肌肌球蛋白i i 的 作用是使骨骼肌肌肉收缩，肌球蛋白v 主要功能是靶向小包运输和信使r n a 的 靶向运输【2 3 。2 6 1 。而依据来源不同可以分为传统的肌球蛋e t ( c o n v e n t i o n a lm y o s i n ) 和非传统的肌球蛋( u n c o n v e n t i o n a lm y o s i n ) 口7 】。传统的肌球蛋白是指构成肌肉 的肌球蛋白，即肌球蛋白i i ，但是非肌肉细胞也存在肌球蛋白i i ，称为非肌肉肌 球蛋白i i ；非传统的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白，如肌球蛋白i 、i i i 、 、v ，只存在于非肌肉细胞之中；肌球蛋白v i i i ，x i 和x1 1 1 只存在于植物当 中【2 6 1 。目前研究比较多的是肌球蛋白i i 、肌球蛋白v 和肌球蛋白v i ，其中以肌 球蛋白i i 为最多。肌球蛋白i i 最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中【2 。 本文主要对肌球蛋白i i ( 全文简称肌球蛋白) 进行了综述。 上海海洋大学硕士学位论文 1 2 3 2 肌球蛋白的分子结构 在鱼类肌肉蛋白质中，肌球蛋白占肌原纤维蛋白质的5 0 以上，并且其基因 在生物进化过程中的变异性很大1 2 7 1 。肌球蛋白是长形不对称分子，形状如“y 字， 长约1 6 0 n t o ，分子量约4 7 0 0 0 0 道尔咧2 8 j 。电子显微镜下观察到它含有两条完全 一样的长肽链和两对短肽链，组成两个球状头部、颈部和一个长杆状尾部。肌球 蛋白分子量约4 6 0 k d ，长肽链的分子量约2 4 0 k d ，称重链；短链称轻链。将肌肉 肌球蛋白用5 ，5 二硫双( 0 【硝基苯甲酸，d t n b ) 处理后放出的一对轻链，称为 d t n b 链，分子量约1 8 k d ；另两条轻链只有在碱性( p h l l 4 ) 条件下才能分离出 来，称碱性轻链，分子量分别为2 5 k d 和1 6 k d 。非肌细胞如粘菌的肌球蛋白的 形状和结构与肌细胞的肌球蛋白非常相似，但它不存在d t n b 链，两对不同的 轻链称必需轻链和调节轻链，分子量分别为1 6 k d 和1 8 k d 。两条重链的氨基末 端分别与两对轻链结合，形成两个球状的头部和颈部调节结构域，称为 s u b f r a g m e n t - 1 ( s 1 ) ，余下重链部分组成肌球蛋白长杆状的尾部( 图卜2 ) 。在一定 条件下，胰凝乳蛋白酶能把肌球蛋白切为两部分，带有两个头部的部分称为重酶 解肌球蛋白( h e a v ym e r o m y o s i n ，h m m ) ，另一部分叫轻酶解肌球蛋白( 1 i g h t m e r o m y o s i n ，l m m ) 。重酶解肌球蛋白的尾部称为s u b f r a g m e n t 2 ( s 2 ) 。 1 2 3 3 肌球蛋白的功能 图1 2 肌球蛋白的分子结构 f i g 1 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo f m y o s i n 肌球蛋白分子的特性与特定的部位有关；a t p 使用位点及肌动蛋白结合点在 分子头部；溶解特性及纤维形成能力决定于分子尾部；a s g h a re ta l ( 1 9 8 5 ) 研究表 明，s 1 形成凝胶的能力弱，所以肌球蛋白的凝胶形成能力决定于分子尾部1 。 4 上海海洋火学硕士学位论文 肌球蛋白由k u e h n e 于1 8 5 9 年在研究骨骼肌收缩时发现并命名，它是一种普通的真 核细胞运动性蛋白，能和肌动蛋白结合形成细胞运动如胞质分裂和肌肉收缩等所 需的物质【3 0 1 ，有“分子马达之美誉【3 1 】。肌球蛋白n 末端的头部s 1 为马达功能区， 在离体条件下，单独的s 1 就能依赖其a t p 酶活性产生力，从而驱使肌动蛋白丝 运动，只是滑动速度比全长的肌球蛋白慢，可见肌球蛋白表现最佳马达活性需要 s 2 。肌球蛋白的尾部是超螺旋结构，其氨基酸序列由典型的卷曲的卷曲型旷螺旋 ( c o i l e d c o i l e da h e l i x ) 组成。所有肌球蛋白在轻链结合下方都有一个脯氨酸残基， 根据其保守性和结构特性，此脯氨酸残基被定义为头部和尾部连接点( h e a d t a i l j u n c t i o n ) t 9 1 。肌球蛋白以聚合形式参与细胞生理过程，单个的肌球蛋白分子没有 功能。 肌球蛋白也广泛存在于非肌细胞中，它是细胞骨架的组成成分，为细胞质 流动、细胞器运动、物质运输、有丝分裂、胞质分裂和细胞的顶端生长等提供所 需的力，参与细胞的吞噬、运动、受精和吸收等生理过程，充当非肌细胞生命活 动的不同层次的调节者，从简单的细胞间的信号传递到指导向化性迁移和细胞 形状的改变等较高级的调节。研究表明，肌球蛋白为盘基网柄菌在振荡培养下正 常生长和分裂、表面蛋白受体成帽( s u r f a c er e c e pt o rc a p p i n g ) 、多细胞发育成子 实体( f r u i t i n gb o d y ) 、细胞与器壁的脱粘附( a d h e r e n c e ) 等生命活动所必需f 3 2 】。 就鱼类而言，轻链包括2 条碱轻链( a 1 和a 2 ) 和2 条d t n b 轻链，具有调节磷 酸化途径等作用；而重链含有多个不同的结构域，如位于氨基端具有球状结构的 重酶解肌球蛋白( h m m ) ，和位于羧基端具有q 螺旋结构的轻酶解肌球蛋白 ( l m m ) 。前者包括s 1 和s 2 ，具有a t p 酶的活性和与肌动蛋白结合的能力，后者 具有使肌球蛋白在生理条件下形成丝状的能力，它们决定了鱼肌肉蛋白质多种重 要的功能性质【3 3 】。表- n 举了部分肌球蛋白的功能【3 4 1 。 袭t粉舰球鬣臼的潜在功能 锄1 蛩毙啪l 如口躺da 口斑叠跚燃 满农功能羹球覆臼 豉球美白的拳捌 满在功缆鼠球蓬白鼠球燕白蛇煳 烁缸, s a ：n a h 细螂池鳃稚啦a l 缸断螂 a 3 螂 细憩鹃生长和发商 分泌泡的话定 细兜j 主动 烈 运输 细憨器糖杞的运动 咖地蜊碣诅丑cl豹畦作用a 盘，伍神州锄融暑 i 、b 囊洳劫：筇l1 妞彗3 p 5 p i 幽蛾珊ai 期趔m 姒 i y e a s t 蜘每v光受律艴褰螭合性西口哗霸抽r i m a c 口删啪碍n a ，bi运辘姗蟾7 a 堍蕈脚 v光传导口冽or i t c c k c i 【k 旺w z av 瓢肉牧缩f l m m 卿自l a - i i m a t , x 盘l 口k v 是晰小体的整合狮础疽篮c 班 麓挺脚辛 v 稳定或带定作用妯憎o ! s v a l t 墨 w 西q g 疵o e s fl l碰珂苞的组成强瞄粗 4 7 a 珏 茺多蟹的迂位聚勰脚每v 毛发细匏舶迂堕性 酃 i 翼包录的运车禽m 孙譬矗t t t ev 真杉细穆的舒化珏呦孓固缸 蔽递贮定f 性y e a s th d 卸v 倍予传导 l 瑚衄m 晒 i x 匏备作用腑4 磕码吐1 b ，c dlr 采域 r 5 i x 些迦望叠 ! 上海海洋人学硕+ 学位论文 1 2 3 4 肌球蛋白的理化性质 肌球蛋白具有三个重要性质：( 1 ) 生理性离子强度下合成粗丝；( 2 ) 具水解a t p 酶活性；( 3 ) 与构成细丝的肌动蛋白结合形成肌动球蛋白。 p h 值升高到大于6 时溶解度就会升高，只要保持高的离子强度和合适的p h 值，肌球蛋白呈可溶，离子强度低于0 3 m o l l 时，肌球蛋白会凝聚成两极的纤 丝【3 5 】。肌球蛋白a t p a s e 被c a 2 + 和k 2 + 所赋活。c a 2 + 存在下的活性称为c a 2 + _ a t p a s e 活性；k 2 + 存在下的活性，又称为e d t a a t p a s e 活性( 此时混合存在的c d + 和m 9 2 + 被添加的e d t a 除去) ；在生理条件的低离子强度下，肌球蛋白形成丝，其a t p a s e 活性被m 9 2 + 所阻碍，但肌动蛋白在生理盐浓度下重合形成的f 一肌动蛋白可显 著激活m 矿存在下的肌球蛋白a t p a s e 活性【3 6 1 。肌球蛋白的凝聚状态对肉制品的 功能性质，如肉制品的质构、脂肪和水的结合能力等有很大影响。 1 3 鱼类肌球蛋白国内外研究进展 1 3 1 淡水鱼肌球蛋白热稳定性的变化与环境温度之间的关系 关于鱼类蛋白质与环境温度变化之间的关系是由英国的j o h n s t o n 在上世纪7 0 年代的n a t u r e 杂志上首次提出的，他发现栖息于不同环境温度下的海水鱼类，其 肌原纤维蛋白质的热稳定性是不同的，越是生长在低温的鱼类，其肌球蛋白的凝 集速度越快，其热稳定性也越低u5 1 。c h a e n 等在1 9 9 6 年报道说f 一肌动蛋白在肌球 蛋白上滑动所需的活动能，1 0 0 c 驯化的鲤鱼( 6 3k j m 0 1 ) 要比3 0 0 c 驯化的鲤鱼( 1 1 1 k j m 0 1 ) 少的多，可能的原因就是低热稳定性的肌球蛋白结构造成了生理生化运动 所需的低活动能【37 1 。 9 0 年代中期以来，日本在研究环境温度对鱼肌肉蛋白质性质的影响以及淡水 鱼肌肉蛋白质性质变化的分子机理上取得了突破性的进展，他们提出了肌球蛋白 重链( m h c ) - - 级结构的变异是导致肌肉肌原纤维蛋白质性质发生变化的主要原 因，而m h c 一级结构的变异归咎于不同环境温度下特定m h c 同功型基因的表达， 且由不同的同功型基因所表达的肌球蛋白往往展现了截然不同的生化性质，如酶 学性质和稳定性【3 8 1 。n a k a y a 等利用差示扫描热量仪( d s c ) 研究t 3 春季鱼 秋季鱼 冬季鱼。在 3 5 、4 0 、4 5 和5 0 的热变性温度下，测定了两种鱼的肌球蛋c a 2 + a t p a s e 变性速率常数( k d ) ，证明了草鱼和鲢鱼肌球蛋白的热稳定性为夏季鱼 春季鱼 秋季鱼 冬季鱼 4 4 , 4 5 】。后又测定不同季节这两种淡水鱼肌球蛋i 兰t c a 2 + - a t p a s e 的 热力学活化参数，在化学反应的热力学理论上证明了淡水鱼肌球蛋白的热稳定性 伴随季节温度变化的关系，即肌球蛋白的热稳定性春夏季鱼明显优于秋冬季鱼。 草鱼和白鲢肌球蛋白c a 2 + a t p a s e 的热力学参数活化能、活化焓和活化熵均伴随 栖息环境温度的上升而增大，另一方面，活化焓和活化熵之间显示了良好的线性 相关，证明了淡水鱼能够通过其肌肉蛋白质反应的活化焓与活化熵之间的互补效 应，以应对自然界季节环境温度的变化，这些结果为淡水鱼加工中工艺参数的确 定提供了可供参考的基础理论数据。 1 3 2 肌球蛋白在鱼糜凝胶过程中的作用 鱼糜的凝胶强度很大程度上取决于相邻的肌球蛋白分子问的相互作用。凝胶 开始时，在温度小于4 0 时，h m m 或其亚基纤丝之间相互交联，使溶液具有凝 胶性。4 0 - 5 0 时，h m m 或其亚基的变性使强度增加，接着纤丝之间相互作用 不可逆增强；5 0 - 6 0 时，l m m 的变性导致纤丝之间流动形成强度不大的粘性 的胶；5 6 - 6 0 时，凝胶转换形成由变性肌球蛋白形成的胶，可以看出更加不可 逆的相互作用强度增加；5 2 - 6 3 时，变性通过最后阶段，凝胶形成。肌球蛋白 的热诱导凝胶形成包含两个过程，一个是肌球蛋白头部分子的凝聚，这在相对低 温时出现，如4 0 c 。另一个是尾部经缠绕的螺旋卷曲转换，这在相对高的温度 时出现，而且起关键作用【4 6 】。 影响鱼类肌肉蛋白质凝胶形成能的因素包括以下几个方面：原料新鲜度、捕 获季节、个体大小和鱼种等，其中鱼种间的差异被认为是首要的因素【4 7 】。鱼种 间在蛋白质凝胶化功能上的差异被归咎于m h c 分子之间在形成网状结构上的差 异，而这种差异是由不同鱼种间在组成其m h c 一级结构的氨基酸残基和序列上 的差异所决定的。因为肌球蛋白杆状s 2 区和l m m 的性质主要决定了鱼肌肉蛋白 质的凝胶形成能力，所以对其展开分子基因水平上的研究将有助于阐明不同鱼种 之间在肌肉蛋白质凝胶化功能方面展现差异的机理。 7 上海海洋大学硕士学位论文 1 3 3 淡水鱼肌球蛋白多基因家族的研究 前人的研究已经证明了编码脊椎动物肌球蛋白的基因是由众多的同功型基 因所组成，以至于肌球蛋白有多基因家族之称【4 引。g e r l a c h 等人在1 9 9 0 年发现了 鲤鱼肌球蛋白重链基因的多样性【4 9 】，硒1 ( u c l l i 等人在1 9 9 9 年更进一步的证明了这 点，他们分离到2 9 种鲤鱼肌球蛋白重链基因的部分编码序列并测出编码l o o p 2 区域的核苷酸序列，这些不同的核苷酸序列编码9 种氨基酸序列。这些分离到的 基因序列跟高等脊椎动物的骨骼肌和心脏肌相比较，有非常高的相似性，而与平 滑肌和普通肌相比较则不然【5 。 i m a i 等人在鲤鱼骨骼肌中获得了三种与它们所驯化温度相关的三种肌球蛋 白重链同工型基因，并分别命名为：1 0 型，中间型，3 0 型，这表明鲤鱼在温 度驯化模式上至少表达了3 种肌球蛋白重链同功型 5 。在实验中n o r t h e r n 印迹 分析证明3 0 型和1 0 型基因主要在各自温度驯化鲤鱼中表达，而中间型则都 有表达；另外还发现这三种同功型基因的m r n a 水平在这种温度驯化模式中有 所变化( 中间型更趋向于1 0 型) ，而当这三种同功型的l m m 部分氨基酸序列 与一些恒温动物相比较时，3 0 型的比l o 型的相似性更高些。 h i r a y a m a 等在1 9 9 7 年发现这三种鲤鱼肌球蛋白同功型序列中最大的不同在 于s 1 的两个区域：l o o p l 和l o o p 2 。l o o p l 位于a t p 结合位点附近，而l o o p 2 是一个肌动蛋白结合位点，它们也因温度驯化不同而表达不同【52 1 。随后2 0 0 0 年 他们利用1 0 和3 0 鲤鱼肌球蛋白s 1 处的l o o p l 和l o o p 2 不同序列与盘基网 杆菌( d i e t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 的肌球蛋白基因构建并表达了嵌合蛋白，揭示了 l o o p 2 序列的多样性影响着肌动蛋白激活的m 9 2 + a t p 酶活力的v m a x 【5 引。 之后，s h u g ow a t a b e 等利用基因组文库测出鲤鱼骨骼肌肌球蛋白重链的全 部d n a 序列，并跟先前报导的e d