（生态学专业论文）氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究.pdf

氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建 及其代谢葡萄糖途径的研究 摘要 氧化硫硫杆菌是细菌冶金的一种重要细菌，是一种具有代表性的极端嗜酸性 严格自养细菌，它能氧化元素硫和还原性的硫化合物，以c 0 2 作为主要碳源而 生长，是一种严格好氧的专性白养化能无机营养细菌。 氧化硫硫杆菌缺乏e m p 、e d 途径以及t c a 循环中的关键酶磷酸果糖激 酶、6 磷酸葡萄糖酸脱水酶、特征性酶2 酮3 - 脱氧6 _ 磷酸葡萄糖酸醛缩酶以及 a - 酮戊二酸脱氢酶等不能以有机质作为能源和碳源。只能通过固定c 0 2 获得碳 源，从无机物的氧化获得能源，而无机物的氧化还原电位较高，可供这些细菌生 长利用的能量很少，所以这类细菌往往生长缓慢，代时长，细胞得率低。这些因 素直接影响了该菌的实际应用这就需要用遗传学的方法改良这些菌种，使之适 合于实际应用的要求本研究的主要内容如下： 第一部分内容为利用接合转移的方法构建能够利用葡萄糖的氧化硫硫杆菌 基因工程菌。p j r d 2 1 5 质粒载体及携带外源磷酸果糖激酶的重组质粒p s d k - 1 具 有广泛寄主范围，可以在转移性质粒的诱动下进行转移。e c o l is m l 0 菌株染色 体上整合有r p 4 质粒的缸基因，也可推动含有m o b 位点的非转移性质粒进行接 合转移。以s m i o ( p s d k - 1 ) 为供体菌，野生型氧化硫硫杆菌t t - 1 2 作为受体菌 进行了接合转移，获得了含有外源磷酸果糖激酶基因的氧化硫硫杆菌基因工程菌 t t - 1 2 ( p s d k - 1 ) 。我们对质粒的稳定性进行了测定，结果表明，在无选择压力条 件下连续传代5 0 次，重组质粒p s d k - i 在氧化硫硫杆菌t t - 1 2 中的保存率仍可达 到7 4 ，说明质粒在氧化硫硫杆菌中比较稳定对所构建的氧化硫硫杆菌基因工 程菌在含有葡萄糖的s t a r k e y - s o 液体培养基中的生长状况以及工程菌对葡萄糖的 利用情况等方面进行了研究。结果表明，对照野生型氧化硫硫杆菌菌株不能利用 培养液中的葡萄糖进行生长，而氧化硫硫杆菌基因工程菌t t - 1 2 ( p s d k - 1 ) 却可利 用葡萄糖，并随着葡萄糖浓度的增加其生长量逐渐增加 为了研究外源基因的导入对氧化硫硫杆菌的一些主要代谢途径究竟有什么 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 样的影响，我们采用1 3 cn m r 及3 1 p n m r 技术对葡萄糖在氧化硫硫杆菌基因工程 菌中的代谢途径进行深入研究。n p 删佥测结果表明，前期工作中构建的氧化 硫硫杆菌基因工程菌t t - 1 2 ( p s d k - i ) 所携带的外源磷酸果糖激酶基因得到了表 达，工程菌具有了磷酸果糖激酶活性。而没有携带外源磷酸果糖激酶基因的对照 茵t t - 1 2 ( p j r d 2 1 5 ) 不具有磷酸果糖激酶活性。n c n m r 检钡i i 结果表明，在氧化硫 硫杆菌基因工程菌t t - 1 2 ( p s d k - 1 ) 可同化葡萄糖形成部分细胞物质氧化硫硫杆 菌基因工程菌t t - 1 2 ( p s d k - 1 ) 主要通过e 蛐p 途径同化葡萄糖，并通过e m p 途径生 成p 磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸等重要中间产物，这些中间产物是 合成氨基酸的起始物。【l1 3 c 】- 葡萄糖可经丙酮酸进入弘酮戊二酸，证明了氧化硫 硫杆菌胞内存在丙酮酸脱氢酶体系，并具有柠檬酸合成酶，顺乌头酸酶以及异柠 檬酸脱氢酶的活性，具有从丙酮酸反应生成* 醌戊二酸的完整途径。 关键字：氧化硫硫杆菌接合转移核磁共振代谢途径 氯化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 c o n s t r u c t i o no fb i o e n g i n e e r i n gb a c t e r i at t 一1 2 ( p s d k 一1 ) a n dt h es t u d yo fit sglu c o s em e t a b oiis mp a t h w a y s a b s t r a c t t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n si sag r a m - n e g a t i v e , e x t r e m e l ya e i d o p h i l i eo b l i g a t e l y a u t o l r o p h i eb a c t e r i u m , w h i c hc a no b t a i ne n e r g yf r o mt h ec h e m o l i t h o l r o p h i co x i d a t i o n o fi n o r g a n i cs u l p h u ra n di t sc o m p o u n d sa n du s et h i se n e r g yt o s u p p o r ta u t o l r o p h i c g r o w t ho nc a r b o nd i o x i d e t h i o b a e i l l u st h i o o x i d a n si so f g r e a ti m p o r t a n c ei nb i o m i n g e n z y m o l o g i c a lr e s e a r c hr e v e a l e dt h a tt h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n si sd e f i c i e n ti n s o m ek e y n z y l n o so ft h ee m p , e dp a t h w a y sa n dk r e b sc y c l e , s u c ha s p l a o s p h o f r u c t o k i n a 舶,6 - p h o s p h o g h c o n a t ed e h y d r a s e , a n d a - k = o g i n t m m d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t i e s s o ，t h e s eo l g a l l i s m sc o u l dn o tr e s p i r eo r g a n i cs u b s t a n c ea n d o b t a i ne n e r g yf r o mt h e ma n d 伽o n l yo b t a i ne n e r g yf r o mt h ec h e m o l i t h o t r o p h i c o x i d a t i o no fi n o r g a n i cs u l p h u ra n di t sc o m p o u n d sa n dl l s et h i sa l 昭t os u p p o r t a u t o t r o p b i cg r o w t h0 1 1c a r b o nd i o x i d e t h c l c f o l , t h es l o wg r o w t hr a t ea n dt h el o w c e l ly i e l do ft h i so r g a n i s ma n di t ss e n s i t i v i t yt oh e a v ym e t & l sh a sl i m i t e di t sf m t h 髓 u s e u s i n ge c o l is m l 0 ( p s d k - 1 ) 鹪t h ed o n o r sa n dt t h i o o x i d a n st t - 1 2a st h e r e c i p i e n t s 。t h ep l a s m i dp s d k - ic o u l db em o b i l i z e di n t ozt h i o o x i d a n ss i r e n sw i t h t h ea i do ft r ag e n eo nt h eg e n o m i cd n ao fec o l is m i o t h es t a b i l i t yo fp l a s m i d p s d k - ii nt t - 1 2w a st e s t e d a b o u t7 4 o fzt h i o o x i d a mc e l l sc a r d e dt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i d sa f t e rb e i n gc d t u r e df o r5 0g e n e r a t i o n sw i _ i h o ms e l e c t i v e p r e s s u r e g l u c o s ec 跚】s e d as i g n i f i c a n ts t i m u l a t i o no nt h ec e l l g r o w t ho ft h e u a n s c o n j u g , 锄t s , b u th a d1 1 0e f f e c to nt h ew i l dt y p eo fzt h i o o x i d a n s s i n c et h e j 晒t i o no f c 0 2h a sah i g ha l e r 窖：yr e q u i r e m e n t , s y n t h e s i so f ap a r to f t h ec e l lm a t e r i a l f r o mg l u c o s ei n s t e a do fc 0 2s h o u l dh a v e 觚豇i 叼s p a r i n ge f f e c t , w h i c hs b 湖l e a d t o 缸i n c r e a s ei nc e l ly i e i d r e s u l ts h o w e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ei nt h e g r o w t hm e d i u md i dn o tc h a n g ef o rt t - 1 2 m a i nb u td e c r e a s e d g m d a a u yf o r t t - 1 2 ( p s d k - i ) i x a n s e o n j u g a n t sd u r i n gt h ec u l t i v a t i o n , h o w e v e ft h el e v e lo fg l u c o s e d e c r e a s e dv e r ys l o w l y 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 1 3 cn m ra n d3 1 p n m ri su s e dt os t u d yt h em e t a b o l i s mp a h h w a y so f g l u c o s ei n t t - 1 2 ( p s d k - i ) r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea c t i v i t yo f t h ep h o s p h o f f u c t o k i n a s e - 1w a s d e t e c t e di nt t - 1 2 ( p s d k - 1 ) f r o mn m r s p e c t r aa n db yc o m p a r i s o nw i t hp a t h w a y s d e s c r i b e df o ro t h e ro r g a n j s i n $ ，i tc a nb ec o n c l u e dt h a tt t - 1 2 ( p l s d k - i ) c a t a b o l i s m t h e 11 3 q - g l u c o s em a i n l yv i ae m pp a t h w a y p y r u v a t ea n d o t h e rip r e c u r s o r so f a m i n oa c i d so b t a i n e df r o mg l u c o s eb ye m p p a t h w a y k e yw o r d s ：t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s , c o n j u g a t i v er a n s f e r , n m r , m e t a b o l i s l l l 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写 过的研究成果，也不包含未获得莲i 堑瀣直基焦置要缱型直疆 数：奎拦互窒! 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名；丕f 刮弓 签字日期矽衫年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有 关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存，汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名；办l 斟眵 导师签字； 签字日期：加佴向阳 签字日期。妇庐多月多日翔协口 v 学位论文作者毕业后去向：秀博 工作单位：执铀蚂彳i i 发菝纯建国刁霆旒受苣j 5 良髦话；易哆；昆够z ；哆哆一肜哆 通讯地址； 邮编。洌d 秒 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 第一章前言 第一节硫杆菌研究概况 硫杆菌是一类革兰氏阴性化能无机营养菌，是分布最广，研究得最多，经济意义很 大的硫氧化细菌。这类细菌从还原性或部分还原性硫化物( 无机硫、硫化物、硫代硫 酸盐、多硫酸盐) 的氧化中获得生长所必需的能量和还原力( 其中氧化巫铁硫杆菌还 能氧化f 矿一f 苦卜) 通过卡尔文循环固定空气中的c 0 2 作为主要碳源该属中的氧化 硫硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 、氧化亚铁硫杆菌( t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n s ) 以及 喜温硫杆菌( t h i o b a c i l l u sc a l d u s ) 是极端嗜酸性的专性自养菌，最适生长p h 为2 0 - 3 0 ， 广泛分布于硫化矿床、酸性矿水及土壤中，在细菌冶金、煤的脱硫和含硫废水的处 理等方面发挥重要作用该属中的另一些种，。包括排硫硫杆菌、那不勒斯硫杆菌。 脱氮硫杆菌、新型硫杆菌。中间硫杆菌、代谢不全硫杆菌和多能硫杆菌等，多在中 性p h 条件下生长。，有的还是兼性自养菌，它们在自然界的硫循环中起着重要作用。 l 硫杆菌的主要应用 1 1 生物冶金 许多微生物可以通过多种途径对矿物作用，将矿物中的有价元素转化为溶液中的 离子利用微生物的这种性质，结合湿法冶金等相关工艺，形成了生物冶金技术 生物冶金是指通过细菌对矿石的作用，把矿石中不溶性的金属化合物变成可溶 性的化合物，再用一般湿法冶金方法从溶液中进行回收的过程，又称为细菌浸取或 细菌采矿。硫杆菌是在微生物冶金过程中起作用的主要浸矿菌( r a w l i n g s e ta 1 1 9 9 9 ， 乐长高2 0 0 3 ，s u z u k i 2 0 0 1 ) 目前，生物冶金的研究十分活跃，尤其是针对难处理硫化矿如：黄铁矿、黄铜矿、 砷黄铁矿等一直是全球研究的热点( 李洪枚2 0 0 0 ，訾建威等2 0 0 5 ) 世界生物湿 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 法冶金的研究工作，以南非、澳大利亚、美国、加拿大最卓著，并首先成功地应用于 铜、铀的工业开发利用。在过去十年里，南非已采用生物技术经济地从难处理金精 矿中回收贵金属，澳大利亚、加拿大和美国已有现场生物浸出的工艺试验的报导 1 2 生物脱硫 世界的主要能源在相当长时期内仍以化石燃料为主。就我国而言，在化石能源结 构中煤炭在相当长时期内占有重要地位，因此煤炭的消耗量将不断增加。然而，随着煤 炭的大量开采与使用，煤中硫的含量不断提高，造成的污染也日益加剧。煤中主要硫分 为无机的黄铁矿硫，因此研究的脱硫菌种大多为化能自养型硫杆菌，如氧化亚铁硫杆 菌( 李浩然等2 0 0 3 ，冯雅丽等2 0 0 2 ，d r o u g u ie ta 1 2 0 0 3 ) 。除此之外，氧化硫硫杆 菌还可用于燃煤烟气的脱硫( 吴根等2 0 0 1 ) 。 1 3 硫杆菌的其它应用 城市污水处理过程中产生大量剩余污泥，城市污泥的植物营养元素丰富，农业资 源化利用潜力巨大，但污泥中重金属含量常常超标，长期施用会使重金属元素在土壤 中发生累积。经过作物的吸收和富集并经食物链的传递对人类产生毒害作用( k r i s h a n e ta 1 2 0 0 1 ) 在利用微生物方法剔除污泥中的重金属中使用最为广泛的菌种主要是 氧化硫硫杆菌( 沈镭等2 0 0 5 ) 和氧化亚铁硫杆菌( t y a g i e ta 1 1 9 9 3 ) 硫化物的测定在环境监测和工业生产产品质量控制中居重要地位。利用氧化硫 硫杆菌制备的微生物传感器可用于硫化物的快速检测( 王晓辉等2 0 0 1 ) 相对于目 前常用的测定方法( 亚甲蓝比色法、碘量滴定法等) 微生物传感器法具有设备简单、 操作简便、测定快速、易实现连续自动监测的优点，具有很好的应用前景。 另外，氧化硫硫杆菌还可以用作微生物肥料，它具有降低土壤p h 值、促进难溶 性矿质养分转化、提高矿质养分有效性的作用( 来航线等1 9 9 8 ) 2 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 2 硫杆菌分子生物学研究进展 2 1 硫杆菌基因的克隆与分析 克隆硫杆菌的基因，并在遗传背景清楚的细菌中( 如大肠杆菌) 表达，是硫杆 菌分子遗传学研究的一个重要方法，这有助于阐明这类细菌的基因结构与表达的特 点，为开发利用这类特殊细菌的基因资源提供理论依据。1 9 8 8 年，r a m e s a r 等人从 氧化亚铁硫杆菌a t c c 3 3 0 2 0 的基因文库中克隆到了一个r c c a 基因，该基因在r e c a 基 因缺陷的大肠杆菌中得到了表达，表达产物在大肠杆菌中既具有重组酶的活性，又 具有蛋白酶活性。序列分析表明，该基因上游区域与大肠杆菌或铜绿假单胞菌的相 应区段有较大的差别( r a m e s a to ta 1 1 9 8 9 ) 。但基因所编码的氨基酸序列与大肠杆菌 或铜绿假单胞茵的r e c a 蛋白有比较高的同源性1 9 9 4 年，s a l a z a r 等从氧化亚铁硫杆 菌中克隆了t y r o s y l - t r n a 合成酶基因( t y r z ) ，并进行了序列测定目前已从硫杆菌中 克隆到的基因包括与氮代谢有关的基因( p m o f i u se ta 1 1 9 8 6 ) ，与c 0 2 固定有关的基 因( p u l g a re ta 1 1 9 9 1 ，刘振盈等1 9 9 6 ) ，与d n a 修复和重组有关的基因( r a m e s a r e t a 1 1 9 8 81 9 8 9 ) ，与砷、汞抗性有关的基因( b u t c h e re l ：a 1 2 0 0 0 ，s h i r a t o f io ta 1 1 9 8 9 ) ， 与物质及能量代谢有关的基因( b a r r o s 眈a 1 1 9 8 5 ，p o w l e se ta 1 1 9 9 6 ，i n o u oe ta 1 2 0 0 2 ) ，以及其它许多编码酶蛋白的基因( b c r g e re t a i 1 9 9 0 ) ， 2 2 硫秆菌的遗传学改良 如上所述，硫杆菌具有极大的应用价值。但硫杆菌生长缓慢，代时长，细胞得 率低，并且对某些重金属离子缺乏抗性，这从一定程度上限制了硫杆菌的应用范围。 因此，我们有必要以遗传学方法改良这些菌种，使之适合实际生产的需要。 改良菌种的一个重要方法是将外源基因引入硫杆菌，构建基因工程菌株，使外 源基因在硫杆菌中表达，从而使硫杆菌获得符合我们需要的优良性状将外源基因 弓j 入受体细胞有三种方式：转导，转化和接合。由于在硫杆菌中尚未发现噬菌体， 因此转导无法实施。研究表明，质粒在硫杆菌中普遍存在( m a oe l ：a 1 1 9 8 0 , m a r t i ne t a 1 1 9 8 3 ，r a w l i n g s2 0 0 5 ) ，因此，科学家们曾经尝试采用转化的方式将外源基因导入 硫杆菌。但未获得成功d a v i d s o n 等( d a v i d s o ne ta 1 1 9 8 3 ) 对非嗜酸性的硫杆菌进行了 3 氧化硫硫秆茁基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 接合转移的研究，发现i n c l a 类群的r p 4 质粒可以通过接合转移从大肠杆菌转移到新 型硫杆菌中，并可从后者再转移到中间代谢硫杆菌和代谢不全硫杆菌中，后两者又 可作为供体把质粒反向转移到大肠杆菌中这说明接合转移可以在大肠杆菌和非嗜 酸性硫杆菌之间进行1 9 9 3 年，金松谟等设计出种大肠杆菌和极端嗜酸性的氧化 硫硫杆菌都能生长的接合培养基，完成了大肠杆菌与嗜酸性硫杆菌之间的接合转移。 接合转移系统的成功建立使得外源基因在嗜酸性硫杆菌中的表达成为可能。 目前，对硫杆菌的遗传学改良主要集中于对细菌抗重金属能力的遗传改造。金 矿中常含有砷杂质，而硫杆菌对砷的抗性较弱。因而，对硫杆菌抗砷能力的改良具 有重要意义。1 9 9 4 年，彭基斌( p e n g c ta 1 1 9 9 4 ) 首次利用接合转移系统将外源抗砷 质粒转入氧化亚铁硫杆菌，并获得表达。赵清等( 赵清等2 0 0 5 ) 将质粒载体p u m 3 上的抗砷基因片段亚克隆到含有强启动子( t a c 启动子) 并具有广泛寄主范围特性的 i n c q 族质粒p 舳2 4 上，成功构建了含有强启动子的抗砷质粒p s d r a 3 ，以及删除 调节基因片段的组成型表达的抗砷质粒p s d 融。通过接合转移的方式将其导入专 性自养极端嗜酸性的喜温硫杆菌中，构建了冶金工程菌zc a l d u s ( p s d r a 3 ) 和z c a l d u so s d r a 4 ) ，与野生菌相比，重组菌抗砷性能明显提高。 2 3 硫杆菌基因组学及蛋白质组学研究进展 随着19 9 0 年人类基因组计划的实施和取得巨大成就，以及模式生物基因组计划 的进行，在先后完成了几个物种的d n a 序列分析后，现代生物学研究重心从揭示 生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究。第一个标志是功能基因 组学( g e n o m i c s ) 的产生，第二个标志是蛋白质组学( p r o t e m i c s ) 的兴起基因组 学与蛋白质组学技术的飞速发展为硫杆菌分子生物学研究注入了新的活力。 2 3 1 硫杆菌基因组学研究 氧化亚铁硫杆菌是第一个完成全基因组序列测定的浸矿细菌( s e l k o ve ta 1 2 0 0 0 ) 尽管对其全部基因的注释还没有完成，但全基因组序列所包含的信息已给 氧化亚铁硫杆菌的相关研究提供了极大帮助( a a r r e t oe ta l2 0 0 3 ，v a l d e s 眈a 1 2 0 0 3 ， b a 鹏t oe ta 1 2 0 0 5 。a c o s t ae ta 1 2 0 0 5 ) 4 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 2 3 2 硫杆菌蛋白质组学研究 蛋白质组学提供了组织或细胞内基因表达的动态信息。蛋白质组学研究的一个 重要方面式差异表达分析，即分析不同细菌蛋白的差异表达，以及同种细菌暴露在不 同环境中是蛋白质表达的差异。目前，我们应用蛋白质双向电泳技术结合质谱技术 来进行细菌蛋白质组学研究。 蛋白质双向电泳技术已被应用于研究氧化亚铁硫杆菌在不同生长条件下蛋白质 表达的差异。其中包括热处理( v a r e l aa n dj e r e z1 9 9 2 ) 、酸碱度( a m a r o e ta 1 1 9 9 1 ) 、 或金属离子叫o v oe ta 1 2 0 0 3 ) 对蛋白表达的影响 3 硫杆菌代谢研究概况 专性自养硫杆菌是从无机物的氧化中获得能量，通过卡尔文循环固定c 0 2 获得细 胞碳最初，人们认为这类细菌不但不能利用外源有机物质，而且有机质对其生长 还具有抑制作用随着研究的不断深入，科学家们发现关于专性自养硫杆菌与有机 质的关系是比较复杂的。对硫杆菌等化能无机营养菌和有机质关系的研究对于阐明 自养与异养的关系、生化机理和代谢调节均有重要意义现将此方面的研究综述如 下 3 1 有机物质对专性自养硫杆菌的影响 总的说来专性自养硫杆菌在没有特定能源可以利用的情况下，有机质抑制其生 长即使在特殊能源存在的条件下，某些有机质对于细菌仍具有不同程度的抑制作 用对这类细菌有抑制作用的有机物主要包括有机酸和氨基酸。 3 l 1 有机酸对专性自养硫杆菌的抑制作用 某些有机酸对于专性自养硫杆菌具有不同程度的抑制作用1 9 7 0 年，r a o 等人 研究了丙酮酸对氧化硫硫杆菌的抑制作用。他们发现，：盔p h 2 5 以下，1 0 r 3 m 的丙 酮酸可完全抑制氧化硫硫杆菌硫的氧化和c 0 2 的固定除丙酮酸外，对专性化能 无机营养菌的生长有抑制作用的有机酸还包括洳酮戊二酸、苹果酸、柠檬酸、异 摹 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 柠檬酸等( m a t i n1 9 7 8 ) 。 3 1 2 氨基酸对专性自养硫秆菌的抑制作用 一些氨基酸对专性自养硫杆菌具有咀显的抑制作用但值得注意的是专性自养 硫杆菌对各种不同氨基酸的抑制作用的敏感性与异养菌相比，并未见明显升高，甚 至更低。在不同氨基酸发挥抑制作用的浓度范围内，在专性自养硫杆菌并不比异养 菌更敏感。例如，缬氨酸抑制e c o l i k l 2 生长的浓度是4 1 0 - s m ( l e a v i t t e t a l l 9 6 1 ) ： 而对氧化硫硫杆菌的作用浓度为l o m ( l ue ta 1 1 9 7 1 ) 同样，i o 一讧苯丙氨酸和 2 5 x1 0 4 m 酪氨酸同时存在可1 0 0 抑制大肠杆菌d h a p 合成酶的活性，而对那不 勒斯硫杆菌，则只能抑制8 0 的酶活性( s m i t he ta l ，1 9 6 2 ) 。 3 1 3 有机物对专性自养硫杆菌的抑制作用的特点 ( 1 ) 不同细菌对有机物的敏感性存在差异，一种有机化合物对这种细菌具有抑制作 用，却- 7 j l j 激另一种菌的生长。 ( 2 ) 不同有机物对不同的细菌发生抑制作用的浓度范围不同。事实上，特定的有机 底物对生长的抑制作用在异养菌中也是很常见的。所不同的是化能自养菌独特的自 养生活方式使其对某些有机物质的抑制作用更为敏感。 ( 3 ) 培养条件可以影响专性自养硫杆菌对有机物的敏感性例如，批量培养中，嗜 酸硫杆菌不能在含丙酮酸的培养基上生长，但在底物限制的恒化器培养条件下，却 可利用该底物生长。显然，有机酸的毒性作用可以通过将底物浓度维持在一个较低 水平的方法而消除( p r o n ke ta 1 1 9 9 0 ) 3 2 硫杆菌的有机代谢 3 2 1 硫杆菌对有机物的利用 长期以来人们认为专性化能自养细菌不能利用有机物质但放射性同位素示踪 实验已经证实，这类细菌在其特殊能源存在的情况下，能不同程度地吸收和同化部 分有机物质作为细胞碳，一些有机酸不但不抑制菌体生长，反而会掺入菌体组成细 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 胞物质( m a t i n ，1 9 7 8 ) 。初立恩等( 初立恩等，1 9 8 1 ) 研究了t c a 循环中的几种有机 酸尤其是丙酮酸和弘酮戊二酸对氧化硫硫杆菌生长及硫氧化能力的影响，发现它们 可使细菌延迟期延长，但不能阻止细菌的生长。细菌经过延迟期调整并进入指数生 长期后，随细胞浓度的增加，丙酮酸和a 一酮戊二酸的浓度迅速降低，说明细胞能 够利用这些有机酸合成部分细胞碳而加速生长。p r o n k 等( p r o n k g ta i 1 9 9 1 ) 研究了 氧化亚铁硫杆菌等各种嗜酸菌对甲酸的氧化，发现在甲酸限量的恒化培养条件下， 氧化亚铁硫杆菌可以利用甲酸作为能源而生长，其细胞密度高于以亚铁或硫化合物 作为能源生长时的细胞密度。当甲酸含量高于1 0 0 1 j m 时则可完全抑制其生长 3 2 2 有机物代谢方式 自养菌不能像异养菌一样利用有机物作为碳源和能源，因此在自养菌体内可能 存在某种代谢途径的特殊性，人们研究发现发现自养菌缺乏有机物代谢途径中的一 些关键酶 绝大多数异养菌都能利用糖类，尤其是葡萄糖作为它们的能源和碳源来进行生 长它们分解葡萄糖的途径很多，其中最主要的有双磷酸己糖途径 ( e m b d e n - m e y e r h o f - p a r n a sp a t h w a y , e m p 途径) ，单磷酸己糖途径( h e x o s e m o n o p h o s p h a t ep a t h w a y , h m p 途径) 和2 酮- 3 脱氧舌磷酸葡萄糖酸裂解途径 ( e n m e t - d o u d o r o f fp a t h w a y , e d 途径) 在氧化硫硫杆菌和排硫硫杆菌中缺乏e m p 途径的关键酶磷酸果糖激酶( j o h n s o n a b r a h a m , 1 9 6 9 , w i l l i a m se ta 1 1 9 6 8 ) 在 氧化硫硫杆菌，排硫硫杆菌和那不勒斯硫杆菌中缺乏e d 途径关键酶鲥舜酸葡萄糖 酸脱水酶和特征性酶2 - 酮- 3 脱氧一6 - 磷酸葡萄糖酸醛缩酶0 m l a t t n , & r i t t e n b e r g , 1 9 7 1 ) ，使葡萄糖不能通过e m p 和e d 途径分解为磷酸丙糖而进入三羧酸循环代 谢途径的缺陷是专性自养硫杆菌无法利用葡萄糖的最主要原因 在异养菌中，三羧酸循环是沟通糖、脂类和蛋白质代谢的桥梁，通过三羧酸循 环可产生大量能量以供生命活动的需要，同时其中间产物可为生物合成提供碳架。 而在专性化能无机营养菌中，其t c a 循环是不完整的。将放射性1 4 c 标记的有机酸 加入到专性自养菌培养基中研究有机酸的吸收及其在细胞内的代谢方式。结果发现， 专性化能自养菌并不能广泛吸收和同化这些有机酸，而仅仅利用这些物质合成有限 7 氧化硫硫杆菌基n - f 程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 的部分细胞成分。其中带有c 标记的丙酮酸、乙酸和谷氨酸，仅仅进入到谷氨酸 族的四种氨基酸一脯氨酸、谷氮酸、甘氨酸和精氨酸中。而这些氨基酸全部来自 乙酸或静酮戊= 酸标记的1 4 c 不进入到门冬氨酸族的氨基酸天门冬氨酸、异亮 氨酸、苏氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸。说明这些细菌缺乏由三羧酸循环中间体c 6 或 c 5 产生c 4 的机制，其t c a 循环是不完全的酶学分析表明这些有机体缺乏t c a 循环的特征性酶a 酮戊二酸脱氢酶( p e e t e r se ta 1 1 9 7 0 , t a y l o r & h o a r e ，1 9 7 1 ) ，使 得t c a 循环被分成了二个分离的途径：( 1 ) 丙酮酸、乙酸一乙酰c o a 一柠檬酸一 异柠檬酸一伽酮戊二酸，提供了谷氨酸族氨基酸的前体；( 2 ) 磷酸烯醇式丙酮酸 ( p e p ) 一草酰乙酸一苹果酸一延胡索酸一琥珀酸，提供了门冬氨酸族氨基酸和卟 啉的前体。而另外一些酶，如苹果酸脱氢酶和琥珀酸脱氢酶与兼性自养菌相比活性 也较低。另外，乙酸的掺入模式表明这类有机体也缺乏有功能的乙醛酸循环。由于 t c a 循环和乙醛酸循环的缺陷使得这些有机体不能通过t c a 循环获得大量能量 ( w i l l i a m se ta 1 1 9 6 8 ) ，在专性化能自养菌体内t c a 循环仅仅起一个纯粹的生物合 成作用，参与c 0 2 的固定和谷氨酸的生物合成，提供了合成细胞物质的碳架。因此 这些有机体必须从氧化无机物中获得能量。 s 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 第二节磁共振技术在微生物代谢研究中的应用 微生物代谢是细胞内所有生物化学过程的总称，包括物质代谢和能量代谢两个 方面。对微生物代谢途径的研究具体来讲是指对细胞内代谢反应中的反应物、中间 物或产物的研究。微生物细胞内的代谢途径非常复杂。例如，微生物对葡萄糖的分 解代谢途径( 主要包括糖酵解途径、三羧酸循环以及磷酸戊糖途径和糖醛酸途径) 涉及到多种酶、辅酶，几十种代谢中间产物，并伴随着能量的产生和释放。 核磁共振技术是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的 分析技术2 0 世纪6 0 4 玳，核磁共振技术开始应用于代谢研究。最初，这类研究主 要集中在医学领域。直到2 0 世纪7 0 年代，核磁共振技术才开始应用于微生物代谢研 究利用高分辨率n m r 技术对细胞内许多微量代谢组分进行检测。可得到相应的生 物体代谢物信息，研究这些组分的n m r 图谱，综合分析这些信息所反映的生物学意义。 可以了解生物体代谢的规律。与其他分析技术相比，核磁共振技术具有以下优点：( 1 ) 无损伤性，不破坏样品的结构和性质，无辐射损伤；( 2 ) 不需提取分离或只需简单预处 理即可同时测定多种成分；( 3 ) 实验方法灵活多样。 1 核磁共振的种类 在生命科学领域申常用的是氢谱( 1 h n m r ) 、碳谱( ”c n m r ) 及磷谱( 3 1 p f r ) 三种以下对这三种技术作一简短介绍。 1 1 碳谱( ”cn m r ) 1 ，c 是一种自旋量子数为1 陀的稳定性同位素。”c 的自然丰度为1 1 相对于自 然丰度为1 0 0 的3 1 p 和1 h 来说比较难检测然而，1 3 c 这种极低的天然丰度也可以 被看作是优点。这使应用3 c 标记的底物进行稳定性同位素示踪实验成为可能。同位 素示踪法是研究物质代谢途径最有效和最常用的方法。相对于传统的放射性同位素 示踪法，1 3 c 等稳定性同位素无放射性，对实验操作者无害，同时也不会对环境造成污 染，代谢反应中被标记的中间产物或产物可以利用核磁共振技术被直接检出。不需要 9 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 再进行纯化及其他繁琐的实验操作。 1 9 7 2 年，e a k i n 等人首次报道了应用1 3 cn m r 研究微生物代谢。他们在产朊假 丝酵母( c a n d i d au t i l i s ) 的细胞悬液中添加1 3 c 标记的葡萄糖，应用1 a t 核磁共振仪动 态监测了酵母菌在代谢葡萄糖过程中所产生的各种代谢中间产物浓度的变化。 e a k i n 等人的实验为我们提供了利用核磁共振技术研究微生物代谢的重要思路： 在微生物培养体系中添加”c 标记的代谢底物，然后利用核磁共振仪检测”c 标记 在各种代谢产物中的分布，从而推测出这一代谢底物在细胞中的代谢途径。h c 标 记示踪与核磁共振技术的结合提供了一种深入研究微生物有机物代谢途径的全新方 法。到且前为止，1 3 cn m r 已经应用细菌( t o r t e se ta 1 1 9 9 7 ) 、酵母( m a a h e i m oe ta 1 2 0 0 1 ) 、丝状真菌( w e m e r e ta 1 1 9 9 7 ) 、支原体( m a t s u d a 1 9 9 7 ) 等多种微生物的代谢研 究。 1 2 核磁共振鼢 j d l r s m r ) 3 l p 的天然丰度为1 0 0 从理论上讲，3 1 p 适合应用于核磁共振检测。含磷化合 物在细胞内含量较高，而且与细胞的能量代谢密切相关，如a t p 储存和消耗，所以 3 l pn m r 在微生物能量代谢研究方面应用广泛。由于微生物代谢过程中许多重要的 中间反应都涉及到磷酸基团的转移，因而3 1 p n m r 可以用于研究含磷代谢中间产物 浓度的变化以及研究催化这些反应的酶的代谢动力学与1 3 cn m r 相比，3 l p 的化 学位移较窄，细胞内许多有机磷酸在核磁共振磷谱上表现出相似的化学位移，因此对 有些复杂磷谱很难进行准确解析，从一定程度上限制了3 1 p n m r 在微生物代谢研究 中的应用。 3 1 p 核磁共振技术主要用于研究细胞内酶的动力学性质，比如可以检测底物浓 度、可能存在的抑制剂、p h 值、离子的组成及酶和底物间的隔离作用等因素对酶动 力学性质的影响，这对了解酶在微生物细胞内代谢过程中所起的作用具有重要意义。 1 9 7 7 年b r o w n 等首次利用3 1 p n m r 测定了a t p 酶在活体中的动力学性质他们 在有氧条件下测定了大肠杆菌中a t p 与p i 之间交换的动力学性质，发现= 环己碳二 亚胺可以抑制a t p 酶的活性。从而导致a 1 p 与p l y _ 间交换变慢。除此之外，1 p n m r 在微生物代谢研究的其它领域也有应用r a g e r 0 9 9 9 ) 锎j f f l 3 1 pn 1 t 研究了巴斯德 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 杆菌m 批所砌o c 脚中葡萄糖的代谢途径，他们通过对含有磷酸基团的代谢产 物的监测分析发现，在败血性巴氏杆菌中，6 磷酸果糖不仅可以在磷酸果糖激酶的作 用下变为1 ，6 二磷酸果糖，还可以在磷酸果糖还原酶的作用下生成l - 磷酸甘油醇。此 外，3 1 p n m r 还可以用于研究外界环境因素对细胞生理状态的影响( l o h m e i e r e t a l 2 0 0 4 ) 。 1 3 核磁共振氢谱( i hn m r ) 1 h 。天然丰度1 0 0 ，是所有常用核中最灵敏的一种1 h n m r 的谱峰与样品中 各化合物的氢原子是对应的，所测样品中的每一个氢在图谱中都有其相关的谱 峰，图谱中信号的相对强弱反映了样品中各组分的相对含量。由于1 h n m r 的化学 位移范围较窄，因而以前很少应用于代谢研究，近年来才开始广泛应用于对细胞提 取液及发酵液中代谢产物的分析研究m a n u e l a d as i l 等人( 2 0 0 4 ) 利用1 hn l 沮嘶究 了丝状真菌对联苯等芳香族化合物的代谢过程。a b e l 等0 9 9 9 ) 利用1 h n m r 研究了链 霉菌s t r e p t o m y c c sc i t r i c o l o r 培养物中的代谢产物，如海藻糖、琥珀酸盐、尿苷等。1 h 。 n m r 波谱中积分曲线高度与引起该峰氢核数成正比，这使l h n m r 不仅能用予结构 分析，同样也可用于定量分析1 h n m r 可以很方便的与h p l c 以及m s 技术联用， 这是其优于”c 、瓤p l q m r 的一个特点 2 核磁共振技术在研究微生物代谢研究中的应用 0 2 1 在代谢工程中的应用 对微生物细胞代谢网络的分析不仅在基础研究中意义重大，也是利用基因工程 手段改良生产菌株的前提。 精确的研究某一基因缺失后微生物代谢的变化对研究微生物代谢调控意义重 大在大肠杆菌中，糖酵解途径、磷酸戊糖途径和t c a 循环是整个代谢网络的中 心，为其它代谢途径提供底物、能量、还原力。如果敲除掉中心代谢某种酶的编码 基因，那么细胞会利用代谢补偿机制来弥补这一缺陷。l i f e n gp e n g 等a ( 2 0 0 4 ) 利用 ”c 示踪法结合二维核磁共振技术以及气质联用技术研究了p e p 羧化酶基因缺失的 l l 氧化硫硫杆菌基因工程菌的构建及其葡萄糖代谢途径的研究 大肠杆菌突变株( 简称p p c 突变株) 的中心代谢途径的变化，发现p p c 基因的缺失 使1 8 9 的碳源通过乙醛酸支路进行代谢，同时磷酸戊糖途径的代谢流量明显降 低。z h a oj i a o 等( 2 0 0 3 ) 同样应用核磁共振技术研究了敲除g n d 基因( 6 - 磷酸葡萄糖 酸盐脱氢酶基因) 后大肠杆菌代谢情况的变化6 磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶基因是磷 酸戊糖途径的关键酶，它的缺失使e d 途径代谢流量增加。另外，丙酮酸激酶基因 的敲除对大肠杆菌代谢所产生的影响也已有报道( e m m e r l m g e t a l 2 0 0 2 ) 目前，利用生物技术生产精细化工用品和日用品，如燃料、溶剂、聚合物等， 有逐步替代传统化学工业技术的趋势，而这主要是通过对生物体特定基因的改造来 实现的在分析细胞代谢网络的基础上，理性化设计细胞代谢途径，并通过d n a 重组技术实现遗传修饰，从而定性改变细胞代谢流走向，调整原有代谢网络，进而 提高特定代谢物的产量。 2 2 在环境与生态学研究中的应用 核磁共振技术可以解析微生物降