（发酵工程专业论文）产聚γ谷氨酸菌株的筛选.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 聚弘谷氨酸( p o l y - y - g l u t a m i ea c i d ；产p g a ) 是微生物产生的一种胞外氨基酸聚 合物，由l 谷氨酸( l g l u ) 、d 谷氨酸( d g l u ) 通过y 酰胺键结合形成。聚弘谷 氨酸具有生物相容性、生物可降解性、可食用且对人体和环境无毒害等优点。可 作为生物絮凝剂、增稠剂、加湿剂、药物载体、药物缓释剂、生物可降解纤维、 高吸水性树脂、重金属吸收剂以及食品添加剂等广泛应用于食品工业、药物工业、 化妆品工业及污水处理中，是一种应用前景非常广阔的新型生物制品。本课题对 弘p g a 产生菌的筛选和鉴定、发酵条件的优化以及产p g a 提取纯化和表征进行了研 究。主要研究结果如下： 以表观粘度作为筛选指标，从一豆瓣酱样品中分离筛选到一株产y - p g a i 拘i 菌株 l 5 3 6 ，其发酵液的粘度可达0 4 1 帕秒。发酵产物经纸层析、氨基酸分析等鉴定， 表明由单一谷氨酸聚合而成。依据菌落形态、菌体形态、生理生化特征以及1 6 s r d n a 基因序列分析的结果，菌株l 5 3 6 初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。国内还未见有 解淀粉芽孢杆菌产产p g a 的报道。 采用单因素试验和正交试验对菌株l 5 3 6 产尹p g a 的发酵培养基和培养条件进 行了优化，确定了最佳发酵培养基组成为( g l ) ：柠檬酸钠1 8 ，谷氨酸钠4 0 ，豆 粕粉4 0 ，氯化钠1 5 ，氯化铵7 ，m g s 0 4 7 1 4 2 00 9 ，k 2 h p 0 40 5 ，m n s 0 4 h 2 00 2 ， c a c l 2 2 h 2 00 2 ；确定了较优培养条件为：初始值p h 7 0 ，培养温度3 7 ，摇瓶装 液量3 5 m l 2 5 0 m l 三角瓶，摇床转速2 0 0 f r a i n ，接种量3 ( v ) ，发酵时间4 7 l l 。 菌株l 5 3 6 在最佳培养基和较优培养条件下培养，发酵液的表观粘度达到1 6 帕秒， 与优化前相比较，粘度提高了3 倍多，产p g a 的产量从1 5 9 l 提高到2 2 5 7 9 l 。 初步研究了弘p g a 的分离纯化过程，确定了分离纯化的路线。通过离心除菌 体、两次乙醇沉淀、透析除盐、冷冻干燥得到纯化样品，经分析其纯度可达9 3 。 采用纸层析、紫外扫描和红外光谱等方法对纯化的y - p g a 样品进行了初步分 析，结果表明：产p g a 样品是由单一的谷氨酸聚合而成的。产p g a 在2 0 4 n m 处有 最大吸收峰，在2 6 0 n m 一2 8 0 n m 处没有明显的吸收峰，表明其没有典型的肽键结构。 对照南京工业大学制得的低分子量的产p g a 的红外图谱，两者的特征吸收峰基本 吻合。初步确定了纯化的样品为聚弘谷氨酸。 关键词：聚产谷氨酸，菌种筛选，解淀粉芽孢杆菌，产物鉴定 a b s l f l 队c t a b s t r a c t p o l y - 7 一g l u t a m i ca c i di sa l le x t r a c e l l u l a rm a c r o m o l e e u l a rp e p t i d et h a tc o n s i s t so fd - - a n dl - g l u t a m i ca c i d st h r o u g hy - g l u t a m y lb o n d s y - p g ai sw a t e r - s o l u b l e ，b i o d e g r a d a b l e ， e d i b l ea n dn o n - t o x i ct o w a r dh u m a na n dt h ee n v i r o n m e n t t h e r e f o r e ，p o t e n t i a l a p p l i c a t i o n so f7 - p g aa n d i t sd e r i v a t i v e sh a v e b e e no fi n t e r e s ti nt h ep a s tf e wy e a r si na b r o a dr a n g eo fi n d u s t r i a lf i e l d ss u c ha sf o o d ，c o s m e t i c s ，m e d i c i n ea n dw a t e rt r e a t m e n t y - p g aa n di t sd e r i v a t i v e so f f e raw i d er a n g eo fu n i q u ea p p l i c a t i o n si n c l u d i n gb e i n g u s e da sb i o p o l y m e rf l o c c u l a n t s ，t h i c k e n e r ，h u r n e c t a n t , d r u gc a r d e r , s u s t a i n e d r e l e a s e m a t e r i a l ，h i g h l y w a t e ra b s o r b a b l eh y d r o g e l s ，h e a v ym e t a la b s o r b e r t h ep a p e r c o n c e n t r a t e so nt h es c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o nt h ep r o d u c i n gy - p g as t r a i n , t h e o p t i m i z a t i o no fc u l t u r em e d i u ma n dc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sa n dt h es e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no f7 - p g a f r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ab a c t e r i a ls t r a i nl 5 3 6w a si s o l a t e df r o mt h eb e a ns a u c ea n dt h ev i s c o s i t yo ft h e c u l t u r eb r o t ha c h i e v e d0 4 1 p a 。s t h ep r o d u c to ft h es t r a i nl 5 3 6w a sah o m o p o l y m e ro f g l u t a m i ca c i d ，w h i c hw a sd e m o n s t r a t e db yt h ep a p e rc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i sa n d a m i n oa c i dc o m p o s i t i o na n a l y s i s w i mt h e f o l l o w i n gi d e n t i f i c a t i o n so fc o l o n y m o r p h o l o g y ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr d n ag e n e s e q u e n c e ，t h e s t r a i nl 5 3 6w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n s ，n a m e d b a m y l o l i q u e f a c i e n s l 5 3 6 ，1 1 1 er e s e a r c ho n b a m y l o l i q u e f a c i e n sp r o d u c i n g p o l y g l u t a m i ca c i dh a sn o tb e e nr e p o r t e di nd o m e s t i cs of a r t i l ec u l t u r em e d i u ma n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so ft h es t r a i nl 5 3 6p r o d u c i n g y - p g aw e r eo p t i m i z e db ys i n g l e f a c t o re x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t 1 1 1 e o p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ( g d ：s o d i u mc i t r a t e18 ，s o d i u mg l u t a m a t e 4 0 ，s o y b c a nf l o u r2 0 ，n a c i15 ，n h 4 c l7 ，m g s 0 4 。7 h 2 00 9 ，k 2 h p 0 40 5 ，m n s 0 4 。h 2 0 0 2 ，c a c1 2 2 h 2 00 2 ，i n i t i a lp h7 0 ，t e m p e r a t u r e3 7 ，i n o c u l a t i o na m o u n t3 ( v v ) ， r o t a t i o ns p e e do fr o c k i n gb e d2 0 0 r m i n ，b r o t h sv o l u m ei ns h a k ef l a s k3 5 m l 2 5 0 m la n d c u l t u r et i m e4 8 h u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n , t h ev i s c o s i t yo ft h ec u l t u r eb r o t h a c h i e v e d1 6 p a s ，3t i m e st h ev a l u et ot h ei n i t i a l ，a n dt h ep r o d u c t i o no fy - p g aw a sf r o m 15 9 lt o2 2 5 7 9 l y - p g aw a sp u r i f i e db ye t h a n o lp r e c i p i t a t i o n d i a l y s i sa n dd r y i n gu n d e rv a c u u m n l e c o n c e n t r a t i o no fp u r ey - p g aw a s9 3 n l ec h a r a c t e r i z a t i o no f y - p g aw a si n v e s t i g a t e db yp a p e rc h r o m a t o g r a p h y , u va n d i r p a p e rc h r o m a t o g r a p h yo ft h ep u r i f i e dy - p g as h o w e dt h a tt h e r ew a so n l yo n es t a i n ， w h i c hi n d i c a t e dt h ep o l y m e rw a sc o m p o s e do fg l u t a r n i ca c i d t h eu vs c a n n i n g t i 山东轻工业学院硕士学位论文 d e m o n s t r a t e dt h ep u r i f i e dy - p g as h o w e da l la b s o r p t i o np e a ka t2 0 4 n m t h ei r c h r o m a t o g r a p ho ft h es a m p l eb a s i c a l l yt a l l i e dw i t ht h a to f ? - p g a s t a n d a r ds a m p l e p r e p a r e db yn a n j i n gi n d u s t r yu n i v e r s i t y i ti n d i c a t e dt h ep o l y m e rw a s ? - p g a k e y w o r d s ：7 - p g a , s t r a i ns c r e e n i n g ，b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ，i d e n t i f i c a t i o no f p r o d u c t i l l 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 做作者签名：盈亟 导师签名： 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 引言 由于石油资源的储量有限以及人类生存对环保、经济可持续发展的要求，来自 生物质加工而成的生物可降解高分子材料的研究正成为当今世界各国竞相研究的 热点。生物高分子材料不依赖于石油资源，不会产生传统化学合成高分子产生的 高污染问题，是一类环境友好的新型高分子材料，在人们越来越关心自己生存环 境的今天，它越来越受到人们的关注。 近年来被广泛应用和深入研究的生物高分子材料，按其化学结构的不同，可大 体分成八大类：( 1 ) 核酸，如核糖核酸和脱氧核糖核酸；( 2 ) 聚酰胺，如蛋白质 和聚氨基酸；( 3 ) 多糖，如纤维素、淀粉、黄原胶、葡聚糖和凝胶多糖；( 4 ) 有 机聚氧酯，如聚羟基脂肪酸酯、聚苹果酸酯和角质；( 5 ) 聚硫酯；( 6 ) 无机聚酯， 如聚磷酸酯；( 7 ) 聚异戊二烯，如天然橡胶或古塔波胶；( 8 ) 聚酚，如木质素和 腐殖酸等。所有这些生物高分子物质都能够在生物体内合成，多数是生物体细胞 干重物质的主要组分，并都能够在生物体内或体外生物降解。 聚氨基酸作为生物高分子材料的一个主要组成部分，在工农业生产中具有广阔 的应用前景【1 1 ，如聚天冬氨酸( p a s p ) 可作为防腐剂、阻垢剂、清洁剂、植物生 长促进剂、矿物的分散剂、高吸水剂和药物载体【2 ，3 1 ，聚精氨酸( p a a ) 可用于农 用保湿地膜、洗涤剂、废水处理剂【4 5 1 ，聚赖氨酸( e - p l ) 是新颖营养型食品保鲜 剂等【3 6 , 7 1 。 一一 聚产谷氨酸( p o l y - y - g l u t a m i ca c i d ：y - p g a ) 是微生物产生的一种胞外氨基酸聚 合物，是一种水溶性的新型生物高分子材料，具有生物可降解性，可食用且对人 体和环境无毒害。可作为生物絮凝剂、增稠剂、加湿剂、药物载体、药物缓释剂、 生物可降解纤维、高吸水性树脂、重金属吸收剂以及食品添加剂等广泛应用于食 品工业、药物工业、化妆品工业及污水处理中，是一种应用前景广阔的新型生物 制品网。微生物合成的聚产谷氨酸由于其多方面的优良性能和环保上的巨大优势， 近年来成为研究的热点。 1 2 聚产谷氨酸的结构与性质 1 2 1 聚产谷氨酸的结构 聚产谷氨酸是由l 谷氨酸( l g l u ) 、d 谷氨酸( d g l u ) 单体通过弘羧基与洳 氨基缩合形成的酰胺键聚合而成的一种多肽分子，通常是由5 0 0 - - 5 0 0 0 个左右的谷 氨酸单体组成，相对分子质量在1 0 0 - 1 0 0 0 k d 之间，结构式如图1 1 所示。 第1 章绪论 c io o h 0 ii i 州n c h 2 一c h 2 一c h 2 一c 旁 图1 1 聚) h 谷氨酸的结构式 f i g 1 1s t r u c t u r eo f y - p g a a s l l i u c h i 等【9 】对) ，p g a 的分子结构进行了研究，y - p g a 分子没有典型的肽链结 构，也不是一种环状多肽，基本骨架呈直链纤维状。杨革等【1 0 】采用圆二色谱仪( c d ) 对7 - p g a 分子的二级结构进行了分析，结果表明，a 螺旋1 8 5 ，b 折叠5 0 3 ，b 转角0 5 和无规卷曲3 0 7 。说明了) ，p g a 属于0 【螺旋和p 折叠的含量都较多的生 物大分子。从) , - p g a 的x 射线衍射谱图中分析知，) , - p g a 所形成的宏观结构为非晶 态。y - p g a 链分子排列的规则性较差，但也不是完全缺乏秩序一般取向大致与 y - p g a 轴平行，不过排列不整齐，结合较为松弛。 7 - p g a 在溶液中的构型与y p g a 的离子强度、p h 和溶液浓度有关【8 1 1 , 1 2 1 。在非 离子状态，聚y - d 谷氨酸以左手螺旋形式存在较为稳定，分子内的氢键维持 7 - d p g a 的稳定【l 引。对b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 生产的】, - p g a 的构型研究表明：在低离 子浓度下( o i m o u l ) ，为a 螺旋和p 折叠构型；在高离子浓度下( 0 5 m o l l ) ， 以p 折叠构型为主；在低y - p g a 浓度下，以a 螺旋构型为主；高) ，p g a 浓度下，分 子间的相互作用超过了分子内的相互作用，表现为p 折叠构型：在低p h 和低y - p g a 浓度下，y - p g a 带正电，呈a 螺旋构型或紧密的球状；在中性偏碱性条件下，为d 折叠；在碱性条件下，y - p g a 带负电，呈伸展状；在有c a 2 + 存在的条件下，弘p g a 在中性环境中也可呈紧密的球状【1 4 1 5 1 。 y - p g a 分子的结构可能与其来源、分子大小等有关，不同微生物及同一种微生 物的不同生长时期生产的? - p g a ，其分子大小和立体化学组成存在很大的差异，这 也使得聚谷氨酸的结构特征具有多样性。 1 2 2 聚y 谷氨酸的性质 ( 1 ) y - p g a 的理化性质 选用游离酸型y - p g a ，根据滴定量测定p k a ，p k a = 2 2 7 ，与谷氨酸的a 羧基的 p l 始大体一致，金属盐( n a 型) 的y - p g a 的比旋光度为7 0 ( c = 1 0 ，h 2 0 ) 。游 离酸型的y - p g a 能够溶于二甲亚砜、热的n ，n 二甲基酰胺和n 甲基吡咯烷酮。用 示差热量分析仪( d s c ) 及热重量分析仪( g a ) 研究了它的热性质，得出分解温 度为2 3 5 9 c 、熔点为2 2 3 5 c 、热分解物为茶褐色【1 6 1 。 ( 2 ) y - p g a 的分子量 般而言，由芽孢杆菌产生的少p g a 的平均分子量在1 0 5 - 8 x i 0 6 之间。分子量越 2 山东轻工业学院硕士学位论文 大，其流变性越难控制，也很难被化学试剂修饰，从而限制了产p g 认的应用瞵j 。目 前已采用碱水解、超声波降解、微生物降解或酶降解以及改变培养基成分等方法 来得到不同分子量的聚谷氨酸。b i t t e r 等【1 7 】通过提高培养基中n a c i 的含量，获得了 分子量相对很高的) ，- p g a 。 ( 3 ) y - p g a 的光学异构体比 采用不同菌株和不同发酵工艺生产的y - p g a 分子量是不同，其光学异构体比 ( y p g a 中d 型和l 型谷氨酸的比例) 也存在较大的差异。其中，金属离子对其有 明显的调控作用，例如在b 1 i c h e n i f o r m i sw b l 3 的发酵培养基中，随着m n 2 + 离子浓 度的增加，d 谷氨酸的含量不断增加，当m n 2 + 离子的浓度( m n s 0 4 h 2 0 ) 为0 1 3 9 l d 时，组成少p g a 的谷氨酸基本上为d 谷氨酸【墙】。采用g i t c ( 2 ，3 ，4 ，6 四o 乙酰基 母d 吡喃葡萄糖异硫氰酸盐) 诱导法【1 6 】测定产p ( 认光学异构体比。研究? - p g a q b l - 和d 谷氨酸的组成、变化和影响因素将有助于指导y - p g a 的合成，以满足y - p g a 的 不同应用环境。 1 3 聚产谷氨酸的应用 聚) ，谷氨酸分子中有大量的游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子之间形成 氢键，具有极高的水溶性和吸水保湿性，也为阳离子的结合提供了基团，使其对 金属离子具有良好的吸附性。活性基团羧基易发生酯化、易改性，可制备优良的 吸水树脂和理想的药物载体或者缓释剂。可食用无毒、良好的生物相容性、生物 可降解性等使聚弘谷氨酸及其衍生物在食品、化工、材料、医药等领域，具有极 大开发价值和广阔应用前景。 一 1 3 1 聚产谷氨酸在农业中的应用 ( 1 ) 土壤、植物的保水剂 聚产谷氨酸经过电子射线照射数秒钟后能够得到一种高倍吸水性树脂( s u p e r a b s o r b e n tp o l y m e r ，s a p ) ，吸水能力为自身的数百乃至数千倍，最高可达5 3 0 0 倍。 这种高吸水性树脂无毒、无味、无色透明，吸水速度快，具有高吸水性和保水性。 将这种高吸水性树脂与土壤结合，不仅可以改进团粒，还能改进土壤的保墒、保 湿、保肥性能，在改造荒山、秃岭、沙漠方面发挥积极作用f 1 9 1 。聚谷氨酸吸水饱 和后，呈凝胶状，可包裹在植物种子的表面上作为种子的理想包衣材料。原敏夫 等【2 】用r p g a 吸水树脂包裹牧草种子，撒于缺水沙地进行绿化试验，一周后种子发 芽生长得十分顺利。而在过去，植物在那里是不会发芽生长的。 ( 2 ) 农药、肥料的缓释剂 聚产谷氨酸还可作为农业化学品的缓释载体，适量的聚产谷氨酸与化肥，杀虫 剂，除草剂，抗菌剂等结合可以延长活性成分的作用时间，提高使用效果，减少 3 第1 章绪论 化肥农药的使用量。对改善农用土壤的结构，降低农药的负面影响都有十分重要 的意义1 2 引。 ( 3 ) 饲料添加剂 聚产谷氨酸在动物养殖方面也有很大的用途，作为饲料添加剂添加于家畜、家 禽、鱼、宠物的饲料中，聚弘谷氨酸及降解产物可以促进矿物质的吸收，增强蛋壳 强度和减少体内脂肪积累【2 l 】，还可增加动物对磷的消化吸收，从而降低代谢物中 磷的含量f 2 2 1 。 此外，聚) ，谷氨酸还可以作为水果蔬菜的防冻剂和果实光亮剂。 1 3 2 聚弘谷氨酸在食品中的应用 ) ，p g a 作为生物大分子物质，在体内完全降解后生成谷氨酸，对人体没有毒副 作用，具有食品安全性，可作为食品防冻剂、膳食纤维、食品增稠剂、保健食品 等应用在食品行业中。 众所周知，频繁冷冻和融化生物细胞、生物活性物质和食品等会加速其退化和 腐败，而加入防冻剂则可以避免这种状况。分子量低于2 0 0 k d 的y p g a 具有比目前 公认的具有高抗冻活性的葡萄糖更好的抗冻性能，y - f g a 的抗冻性和可食用性使 y - p g a 可被广泛的应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷冻保 藏f 2 3 】。y - p g a 比通常的低分子量防冻剂( 如糖类、无机盐和蛋白质等) 味淡，食品 中既使加入了大量的y - p g a 对口感影响也不大。 产p g a 添加于淀粉类食品( 糕点、面条) 中，可防止老化、增强质地、维持食 品外形和延长货架期。聚谷氨酸可以增加面包、蛋糕的弹性，使面包、蛋糕的颗 粒更加细致，聚谷氨酸还可以增强面条的韧性，防止面条中的固体物质溶解在沸 水中例。 y - p g a 可作为各种食品的苦味掩盖剂和除涩剂【2 5 1 ，改善食品的味道和口感。研 究发现，y p g a 可以消除或减少诸如氨基酸、多肽、奎宁、咖啡因、矿物质引起的 酸味，也是高钠调味剂的替代品，可为糖尿病患者和高血压患者所用，可作为健 康饮食的一个组分【2 6 】。另外，t a 血m o t 0 【2 1 1 等报道了产p g a 能够增加体内或体外c a 2 + 的溶解度，还能够促进c a 2 + 在肠道内的吸收。) ，- p g a 也是纳豆中水溶性维生素k 的 结合因子，对维生素k 在人体内的吸收利用起积极作用，这意味着天然存在的 ? - p g a 和添加了适量的) ，p g a 的功能食品可以作为治疗骨质疏松症的药物。 1 3 3 聚) ，谷氨酸在医药方面的应用 y - p g a 作为药物载体具备以下优点 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 , 3 1 , 3 2 】：生物可降解性，y - p g a 在体 内容易被降解成为短肽和氨基酸单体，这些是属于人体自身就具有的物质，不会 有任何毒副作用，生物相容性优良；结构易于修饰、易于和药物结合。主链上的 4 山东轻工业学院硕士学位论文 大量羧基，易于修饰，便于与药物结合；y - p g a 及其衍生物具有很好的缓释和控 释性能；y - p g a 本身即具备一定的靶向性，与其他靶向剂( 如单克隆抗体) 结合 后，其靶向性更佳；可以增加药物的水溶性和稳定性。y - p g a 这些特性使得它可 以作为一种非常理想的药物载体，将p g a 作为水溶性差、体内不稳定、易分解代 谢或毒副作用大的药物的载体，可明显提高药物的生物利用度，降低毒副作用， 延长作用时间，提高血药浓度。对于需要靶向给药的抗癌药物，y - p g a 与靶点的 结合更是为抗癌药物提供了一种理想的靶向给药途径【3 3 ，3 4 , 3 5 】。 总的来说，y - p g a 作为药物载体的研究，主要集中在抗癌药物的载体。) , - p g a 在医药领域的主要应用包括： ( 1 ) 延长、改善、控制药物释放 3 6 , 3 7 改善植物提取的抗癌活性成分的抗癌疗效 2 8 , 3 8 1 ，并具有延长、限制激素释放【3 3 ， ”，3 9 】的功能。 顺二氯二氨铂( c i s d i c h l o r d i a m m i n e p l a t i n u m ，c d d p ) 为重金属络合物，c d d p 作为药物在肿瘤细胞内的作用和目的是c d d p 与d n a 交联连接形成相当稳定的复 合物锁住d n a ，造成d n a 的损伤，破坏d n a 的复制、转录，是目前临床广范使 用的化疗药物。但是c d d p 微溶于水，在水中不稳定，因而疗效低，使用不方便， 细胞毒性较高，大大降低了药用价值。采用7 - p g a ( 4 0 k d a ) 作为药物的载体，通 过y - p g a 分子中侧链羧基上的氢取代c d d p 分子中的氯原子的化学键合法，形成 有药学活性、相对稳定的c d d p p g a 复合物，有较高的动力学稳定性和对正常细 胞的较低的毒性作用，有利于对p t + 对配体的亲和，是所有c d d p 复合物中最为 有效的载体【3 0 ，3 1 1 。紫杉醇( p a c l i t a x e l ) 类药物是治疗生殖系统癌症的最为有效的 药物之一，但是其临床使用中也面临与c d d p 相同的缺点。如果将? - p g a 与紫杉 醇结合形成复合物，水溶性大大增加，其抗癌活性提高7 倍【2 8 】。同样，喜树碱 ( c a m p t o t h e c i n s ，c p t ) 难溶于水，而且它的内酯形式不稳定，导致使用受限制， 疗效低。但l o 羟c p t 或9 氨基c p t 与p g a 偶联形成c p t - p g a 复合物后，水溶 性大为增加。复合物对同源的和异源的肿瘤都保持较高的抗肿瘤活性。 ( 2 ) 靶向给药i 删 由于目前化疗药物大多存在毒性大，缺乏靶向性，对正常组织同样具有损害作 用，使化疗病人十分痛苦，因此靶向给药成为目前抗癌药物研究的重要课题之一。 尤其是近年来发展起来的单克隆抗体技术，以及人类基因组框图的完成，使抗癌 药物的靶向给药达到了更高的水平。由单抗、y - p g a 载体和药物三部分组成的药 物新剂型是一种很好的靶向给药方法。 一些癌细胞中含有很多纤维蛋白酶活化原，可产生较多的纤维蛋白酶。利用这 一特性，可设计药物利用短肽中间体与) , - p g a 链相连，同样达到在循环时不会释 放而到癌细胞内，肽键即被酶切断释放药物的目的，这可以很好的降低药物的毒 5 第1 章绪论 副作用，发挥更大的疗效。 ( 3 ) 在医药领域的其它应用 y - p g a 不仅可作为抗癌药物载体，还可以作为肝细胞以及外用药物的载体【4 。 另外，? - p g a 与明胶有较好的兼容性，适合用作外科及手术用的胶黏剂、止血剂、 密封剂 4 2 1 ，可作为可生物降解的速效生物胶1 4 3 ，4 4 , 蜘及作为新型外科用胶的组成部 分 4 6 ，4 r l 。 1 3 4 聚弘谷氨酸在材料领域的应用 随着高分子材料的快速发展，在其重要性日益突现的同时，人们发现了它的不 足之处，即大部分的人工合成的高分子材料在自然界难以降解，同时产生的某些 单体对人体有害，如聚丙烯酰胺及其衍生物降解生成的丙烯酰胺或其衍生物单体， 对人体有神经毒性和致癌性【4 9 】。同时燃烧含有这些塑料的废物会产生具有导致内 分泌紊乱的化合物，比如二嗯英等。在人们越来越关心自己生存环境的今天，寻 找安全、可生物降解的塑料和水凝胶，已成为当前研究的热点。? - p g a 分子中有大 量的游离的亲水性羧基，可在分子内部或分子之间形成氢键，具有良好的水溶性， 而且可生物完全降解。因此，? - p g a 作为一种新型的高分子材料，具有重要的潜在 应用价值。 p g a 通过不同强度的辐射聚合，可制备各种可降解的高分子材料。以产谷氨酸 甲酯为基础，生产新型聚合物i i t c 。此类聚合物可以用来制造皮革、纤维、食品 包装膜等，具有合适的强度、透明度和较好弹性 4 9 1 。在显微镜下，聚谷氨酸y - 甲 酯高浓度溶液有周期性斑状的重析现象，具有螺旋状模型，显示出液晶的特征， 可以应用在新型显示设备上【l 】。p g a 改性后，得到高抗碱性的纤维树脂，是一种比 一般天然纤维和化学纤维更优的材料。如外科手术的缝合线，就是以氨基酸和羧 酸为基础，由易水解纤维状和薄膜状的聚合物制得的。而渗透了杀菌剂、防腐剂、 抗生素的聚合氨基酸对伤口和皮肤病还有防治作用。以谷氨酸和烷基谷氨酸酯的 共聚物为基础，研制出来的聚合物是药品很好的包裹材料，可作胶囊或糖衣片【5 0 1 。 1 3 5 聚) ，谷氨酸在环保领域的应用 ( 1 ) ? - p g a 作为生物絮凝剂【5 l 】 传统的有机合成的絮凝剂由于经济性和高效性被广泛应用于饮用水、废水处理 中。由于很难被生物降解，而且有些物质的单体( 如：丙烯酰胺) 和降解产物有 神经毒性甚至是强烈的人体致癌物，其广泛应用必然带来一些环境和健康问题【引。 由微生物合成的高分子絮凝剂由于生物降解性能好，且降解产物对环境和人类不 产生任何危害，应用前景看好。近来研究发现丑l i c h e n i f o r m i sc c r c1 2 8 2 6 ，b s u b t i l i s p y2 9 0 和b s u b t i l i si f o3 3 3 5 产生的7 - p g a 都有很高的絮凝活性。因此，少p g a 不仅 6 山东轻工业学院硕士学位论文 可以应用于废水处理、饮用水的纯化，而且也可以用于食品和发酵工业的下游工 艺操作中。 ( 2 ) y - p g a 作为重金属和放射性核素的吸附剂 由于环境中积累的重金属和放射性核素威胁着人们的健康，因此能吸附重金属 和放射性核素的物质越来越引起人们的关注。y - p g a 是种阴离子物质，它的分子链 上有大量的游离羧基提供了阳离子结合的基团，使其对金属离子具有良好的吸附 性。经研究发现其结合的金属包括：n i 2 + 、c u 2 + 、m n 2 + 和c ，等。以硅为基质的p g a 膜的金属吸附能力已经接近以纤维素为基质的膜，并且还有优异的酸溶稳定性【5 2 1 。 y - p g a 作为功能性物质在回收金属和减少环境污染方面的应用价值非常明显。 1 3 6 聚产谷氨酸在其它方面的应用 ， y - p g a 具有良好的保湿效果，可作为皮肤润滑剂、头发定型剂、保湿因子等应 用于化妆品中。在生化方面，p g a 还可作为多种环境下的适应剂对生物体起到很 好的保护作用。例如在碱性环境下细胞表面附近的p h 中和作用，以及在极端高盐 环境下能防止嗜盐菌的剧烈脱水。另外，y - p g a 还可用作分散剂，如分散水介质中 的矿物、分散化妆品中的色素、分散清洁剂中的固体颗粒和用于造纸工艺中5 3 1 。 近年来，关于y - p g a 的应用开发的研究已引起人们的兴趣和重视，国内不少院 校科研单位正在开展这方面的研究工作。南京工业大学通过化学交联获得了吸水 倍数达1 6 0 0 倍的高吸水性树脂踟。随着y - p g a 研究的深入，其应用领域正在扩大， 其新的应用领域将不断被开发出来。 1 4 聚y - 谷氨酸的生产方法 一 目前，? - p g a 的生产方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。 1 4 1 化学合成法 ( 1 ) 传统的肽合成法 传统的肽合成法是将氨基酸逐个连接形成多肽，这个过程一般包括基团保护、 反应物活化、偶联和脱保护等。合成路线长、副产物多、收率低，合成过程中需 要光气等有毒性气体，使得该法的应用受到很大的限制。 ( 2 ) 二聚体缩聚法【5 5 】 由l - g l u ，d - g l u 及消旋体( d ，l - g l u ) 反应生成甲基谷氨酸，后者凝聚成谷 氨酸二聚体后，再与浓缩剂l ，3 一二甲氨丙基3 乙基碳i t - - 胺盐酸盐及1 羟苯基三 吡咯水合物在n ，n 二甲基甲酰胺中发生凝聚，得到聚谷氨酸甲基酯，再经碱性水 解变成y - p g a 。 化学合成法生产聚) ，谷氨酸过程复杂、难度很大，收率低，环境污染严重，工 7 第1 章绪论 业应用价值不大。但对于了解) ，p g a 的结构与功能的关系、分析】，p g a 合成酶的反 应机制以及发展y - p g a 实际应用的修饰技术等具有一定的理论和应用价值。 1 4 2 酶转化法 酶转化法生产y - p g a 是采用一步酶促反应，以谷氨酸为单体实现生物聚合， 避免了全合成途径中复杂的反馈调节作用，可以使y - p g a 积累到相当高的浓度。 酶转化中关键的酶为谷氨酰转肽酶( g t p ) 1 5 6 】，催化谷氨酰基转移到受体上，当 供体和受体为同一物质时则会发生自动转肽。通过微生物酶转化法，利用酶的高 效性和专一性，得到高浓度产物，并且基质组成简单，有利产品的分离纯化。但 通常情况下，谷氨酰转肽酶在微生物菌体中含量和活力都比较低，且提取纯化工 艺比较复杂，制约了酶转化法的广泛应用。 1 4 3 微生物发酵法 早期，生产y - p g a 大多是从纳豆( 日本的一种传统发酵豆制品) 中分离提取。 由于纳豆中所含的y - p g a 浓度甚微，且有波动，提取工艺十分复杂，生产成本很 高，难以大规模生产【5 7 1 。1 9 4 2 年b o v a m i c k 等人5 8 1 研究发现芽孢杆菌属细菌能在 培养基中积累y - p g a ，由此揭开了微生物发酵法生产y - p g a 的研究历史。同化学 合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产y - p g a 具有生产过程容易控制、发酵 产量稳定、提取率高、目标产物产量较高以及产物分子量适宜、环境友好等优点， 已逐步成为研究和生产聚谷氨酸的主要方法和途径。几十年，利用微生物发酵法 生产y - p g a 的研究一直是人们关注的热点，相关研究十分活跃。 1 5 发酵法生产聚卜谷氨酸研究历史及现状 1 5 1 聚弘谷氨酸的产生菌 聚) ，一谷氨酸是迄今发现的少数几个可以利用生物聚合得到的聚氨基酸之一。 1 9 3 7 年i v i n o v i c s 等【”】人首先从炭疽芽孢杆菌( b a n t h r a c i s ) 的荚膜中发现了 7 - p g a 。随后，s a w a m u r a 从纳豆中分离出了枯草芽孢杆菌( n a t t o ) ，1 9 4 2 年b o v a m i c k 等人研究发现b s u b l i t i s 也能在发酵培养基中积累y - p g a 。目前，发现的产y - p g a 的菌主要是芽孢杆菌属菌株。包括各种( 纳豆) 枯草芽孢杆菌【5 8 , 6 0 , 6 1 , 6 2 , 6 3 1 、地衣 芽孢杆菌( b 1 w h e n i f o r m i s ) 【的6 5 】、炭疽芽孢杆菌【5 9 1 。近年来研究发现，短小芽孢 杆菌( b b r e v i s ) 和耐热芽孢杆菌( b t h e r m o t o l e r a n t ) 6 6 , 6 7 等也能产y - p g a 。此外， 有少部分微生物，如嗜碱耐盐芽孢杆菌( b h a 肠d u r a n s ) 啷】、古细菌隐藏嗜盐碱球 菌( n a t r o n o c o c c u so c c u l t u s ) 陬彻、极端嗜盐古细菌( n a t r i a l b 口a e y p t i a c a ) 7 q ， 还有线虫类水螅( h y d r a ) 7 2 】也能产生y - p g a 。 目前有关y - p g a 产生菌的发酵、代谢、生理及其分子生物学方面的研究报道主 8 山东轻工业学院硕士学位论文 要集中于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。根据菌株生长是否需要l 谷氨酸，可以 把菌株分为两大类：一类是培养时需要l 谷氨酸才能积累，p g a 的菌株，称全程合 成y - p g a 菌株。如b a n t h r a c 括、b s u b t i l i sm r - 1 4 1 t 6 、b 1 i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 、 b 1 i c h e n i f o r m i sa t c c9 9 4 5 a 1 “1 、b s u b t i l i si f o3 3 3 5 1 6 0 1 和b s u b t i l i sf - 2 0 1 t 6 2 】等。另一 类为用少量l 谷氨酸加到培养基中以刺激菌株产生大量7 - p g a ，称分段合成7 - p g a 菌株。如b s u b t i l i s5 e 、b s u b t i l i sv a r p o l y g l u t a m i c u m 、b 1 f c h e n i f o r m i sa 3 5 t 6 5 1 、b s u b t i l i s t a m 4 【6 3 】等。在培养液中加入的谷氨酸只起到调控从柠檬酸合成7 - p g a ，而谷氨酸 并不参与到) ，p g a d p j 。表1 1 列出了几种主要的聚谷氨酸产生菌的特性。 表1 1 几种主要的聚产谷氨酸产生菌的特性 t a b l e1 1c h a r a c t e r so f t - p g ap r o d u c i n gs t r a i n s 备株培养基成分培养方法 相对：子质 氨酸组成比 产p g 眺l i 产物中的谷 柠檬酸、谷氨酸、 b 1 i c h e n i f o r m i s 2 0 万 a t c c9 9 4 5 删 甘油、氯化铵、其 3 7 9 6 h 8 0 。j 亿i o l 兀- r 机j l 盐 ( 4 5 8 5 ) 5 2 0 5 ( 5 5 1 5 ) 盈s 柏舶 果糖、氯化铵、碳 2 0 ( 随培 t a m 4 6 3 1 酸钙、其他无机盐 3 0 9 6 h养时间变7 8 2 2 l 肛1 4 化) b s u b t i l i si f 0 3 3 3 5 t 6 0 b 1 i c h e n i f o r m i s a 3 5 t 6 5 】 b s u b t i l i s f 2 0 1 1 6 2 1 b s u b t i l i s m r 1 4 1 1 6 z l 谷氨酸、葡萄糖 ( 柠檬酸) 、硫酸 3