大蕉脱水蛋白MpDhn12的分子生物学研究-博士论文

中山大学博士学位论文中山大学博士学位论文 大蕉脱水蛋白大蕉脱水蛋白 MpDhn12 的分子生物学研究的分子生物学研究 Molecular biological studies of MpDhn12 from Musa paradisiaca 专专 业：遗传学业：遗传学 博士生：母培强博士生：母培强 导导 师：王金发教授师：王金发教授 答辩委员会答辩委员会 主主 席：姚席：姚 楠楠 教教 授授 委委 员：梅曼彤员：梅曼彤 教教 授授 刘耀光刘耀光 研究员研究员 刘良式刘良式 教教 授授 金立培金立培 教教 授授 广州广州 中山大学中山大学 生命科学学院生命科学学院 二二 0 一一年五月二十日一一年五月二十日 原创性声明原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：学位论文作者签名： 日期：日期： 年年 月月 日日 学位论文使用授权声明学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和 纸质版，有权将学位 论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库 进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法贮存学位论文。 学位论文作者签名：学位论文作者签名： 导师签名：导师签名： 教教 授授 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 I 大蕉脱水蛋白大蕉脱水蛋白 MpDhn12 的分子生物学研究的分子生物学研究 专专 业：遗传学业：遗传学 博士生：母培强博士生：母培强 指导教师：王金发教授指导教师：王金发教授 中文摘要中文摘要 铜离子是植物生长所必须的微量元素之一，但铜离子过量时，游离的铜离子可催 化产生大量活性氧，从而给细胞带来很大的毒性。因此，铜离子稳态的调节对植物的 正常生长发育是必不可少的。过量铜离子的结合主要由一些小分子蛋白质、有机酸和 氨基酸等完成。近年来研究发现脱水蛋白家族的部分成员具有较高的铜离子结合能 力，但其铜离子结合对脱水蛋白结构的影响及其相关生理功能仍不清楚。 在本研究中， 我们通过 RACE 克隆的方法从大蕉 （Musa paradisiaca L.， ABB 群） 中克隆到了一个编码 KnS 型脱水蛋白的基因 MpDhn12。该基因是首个从大蕉中克隆 的脱水蛋白基因，其 cDNA 全长为 639bp，ORF 全长为 321bp，编码 106 个氨基酸。 生物信息学分析发现 MpDhn12 的氨基酸具有较大偏爱性，主要以带正电荷的氨基酸 和极性氨基酸组成，含有 His-Xn-His（n=0-12）铜离子结合结构基序，具有无序蛋白 结构特征。因此，我们在本论文中主要研究了 MpDhn12 的铜离子结合特性及铜离子 结合后对 MpDhn12 结构的影响，同时我们还通过过表达烟草、酵母互补和亚细胞定 位等探讨了 MpDhn12 可能的生理功能。取得如下主要结果： 1、 MpDhn12 具有 Cu2+结合特性：IMAC 和斯卡查德曲线分析表明每摩尔 MpDhn12 蛋白在体外能结合 9.4 摩尔 Cu2+，其解离常数为 5.08。组氨酸修饰削弱了 MpDhn12 在体外的 Cu2+结合能力。此外，在 Cu2+处理下，MpDhn12 过表达烟草叶 II 片中的 MpDhn12 也处于 Cu2+结合状态。 2、 MpDhn12 是一个无序蛋白：热稳定性实验和圆二色谱（CD）分析表明 MpDhn12 在生理缓冲液中呈无序状态，无固定的三维结构。其无序状态较稳定，在 高温煮沸的情况下仍不聚集变性。 3、 MpDhn12 在 Cu2+作用下发生从无序状态向聚集状态的可逆转变：蛋白酶解、 CD 和沉淀分析表明 MpDhn12 在 Cu2+作用下，从无序状态转变为聚集状态。当蛋白 溶液中 Cu2+浓度降低或 Cu2+去除后，又会发生从聚集状态向无序状态的可逆转变。 此外，MpDhn12 过表达烟草的离体叶盘在受到 Cu2+胁迫处理时也发生聚集沉淀，形 成非溶解形式的蛋白。 4、 MpDhn12 能互补酵母的铜离子敏感突变体：酵母互补分析表明 MpDhn12 在 酵母中表达能较好的恢复酵母铜离子敏感突变体 sod1 的铜离子耐受能力，且其恢 复能力与拟南芥金属硫蛋白 AtMT1a，AtMT1b，AtMT3 相当。 5、 MpDhn12 具有体外抗冻保护活性：LDH 活性的体外抗冻保护分析表明 MpDhn12 蛋白在体外有较好的抗冻保护能力， 其保护能力和 BSA 及拟南芥脱水蛋白 ERD14 相当， 但 MpDhn12 过表达烟草却未表现出无明显的低温胁迫耐受能力。 我们 推测这可能与脱水蛋白的基因冗余有关。 6、 MpDhn12 主要定位于细胞质和细胞核：采用水稻原生质体瞬时表达体系研 究了 MpDhn12-GFP 融合蛋白在水稻叶片原生质体中的定位情况，结果表明 MpDhn12-GFP 融合蛋白主要定位于细胞质和细胞核。我们推测其细胞质定位可能与 其参与铜离子稳态调节有关，其细胞核定位预示其可能还参与植物的其它生理过程。 关键词：关键词：大蕉（Musa paradisiaca L.，ABB 群）；脱水胁迫；聚集；铜离子结合； 铜离子稳态。 III Molecular biological studies of MpDhn12 from Musa paradisiaca Major: Genetics Ph.D candidate: Mu Peiqiang Supervisor: Prof. Wang Jinfa Abstract Copper is one of the essential nutrients for plants, but free copper can catalyze the production of ROS when it is in excess, which bring numerous toxic to plant cells. Thus, the copper concentration control of plant cells is crucial for pants growth and development. The protection against high levels of copper can occur with the binding and precipitation of metal inside the cells with low molecular weight proteins, polypeptides, organic acids and amino acids. Recently, some members of dehydrin family proteins were found to have a high affinity to copper ions. However, the impact of copper binding to the structure of dehydrins and the physiological role of which were still unknown. In this study, we cloned a KnS type dehydrin gene form plantain (Musa paradisiacal L., ABB group) by RACE amplification and designed it as MpDhn12, which is the first dehydrin isolated from plantain. The full cDNA length of MpDn12 is 631 bp with an ORF of 232 bp. Bioinformatic analysis showed that the deduced protein of MpDhn12 is preferential to the charged and polar amino acids and is rich in His-Xn-His (n-0-12) copper binding motifs. The structure prediction showed that MpDhn12 is intrinsically disordered. Consequently, we mainly focused on the study of the copper binding activity of MpDhn12 IV and its structure change after copper binding. We also investigated its physiological function by transgenic tobacco, yeast rescue and subcellular location analysis. The main results we obtained are list as follows. 1. MpDhn12 posses Cu2+ binding property. Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) and Scatchrad plots showed that MpDhn12 could bind 9.4 atoms Cu2+ per molecule of MpDhn12 protein with a dissociation constant of 5.08 and His modification by DEPC impaired its Cu2+ binding acidity. Further, MpDhn12 proteins in its overexprerssion tobacco were bound to copper when the leaves were treated by copper. 2. MpDhn12 is intrinsically disordered in vitro. The thermal stable analysi and circular dichroism (CD) spectra showed that MpDhn12 is intrinsically disordered in physiological buffer without fixed three dimension structure. The disordered structure is stable, which did not collapse under water boiling. 3. Copper could trigger reversible aggregation of MpDhn12. Through trypsin digestion, CD spectra and precipitation analysis, we found that MpDhn12 was prone to form aggregates under excess copper treatment. Interestingly, the aggregates could be resolubilized by diluting or chelating the cooper in its reaction solution. Further, the MpDhn12 proteins in detached leaves of its overexpression tobacco also aggregated to form insoluble proteins under excess copper treatment. 4. MpDhn12 could rescue the phenotype of yeast copper sensitive mutant. The yeast functional complementation analysis demonstrated that MpDhn12 could restore the copper tolerance ability of the sensitive mutant sod1 to that of wide type level and the capacity of MpDhn12 to rescue the phenotype of sod1 is comparable to that of Arabidopis metallothioneins, AtMT1a，AtMT1b，AtMT3. 5. MpDhn12 has a cryoprotective activity in vitro. The cryoprotective activity of MpDhn12 to lactate dehydrogenase (LDH) was also tested in this study. It demonstrated that MpDhn12 is effective to protect LDH activity under freezing cycles treatment and this activity is comparable to Arabidopsis dehydrin, ERD14 and BSA. However, the MpDhn12 overexpression tobacco showed no obvious increased tolerance to low temperature. We suspect that it may be caused by the gene redundancy. 6. MpDhn12-GFP was localized in nucleus and cytosolic. Through the rice protoplast V transient expression system, MpDhn12-GFP was localized in nucleus and cytosolic of rice protoplast cells. The cytosolic location of MpDhn12 may be correlated with the function of copper homeostasis and the nucleus location may indicate that MpDhn12 also take part in some other physiological processes. Key Words: plantain（Musa paradisiaca L.，ABB Group）, dehydrin, aggregation, Cu2+ binding, copper homeostasis VI 目目 录录 中文摘要中文摘要 . I Abstract . III 目目 录录 . VI 第第 1 章章 文献综述文献综述 . 1 1.1 脱水蛋白的研究进展 . 1 1.1.2 脱水蛋白的结构 . 3 1.1.3 脱水蛋白的功能 . 3 1.2 铜离子稳态的研究进展 . 9 1.2.1 铜离子的作用和危害 . 9 1.2.2 铜离子稳态的调控 . 10 1.3 本课题的研究目的、意义及技术路线 . 13 第第 2 章章 MpDhn12 的克隆和生物信息学分析的克隆和生物信息学分析 . 15 2.1 材料、试剂与仪器 . 15 2.1.1 实验材料 . 15 2.1.2 菌株和载体 . 15 2.1.3 主要试剂及主要溶液的配制 . 15 2.1.4 实验仪器 . 16 2.2 实验方法 . 16 2.2.1 大蕉脱水蛋白的克隆 . 16 2.2.2 大蕉脱水蛋白 MpDhn12 的生物信息学分析 . 18 2.3 结果与分析 . 18 2.3.1 大蕉 MpDhn12 的 cDNA 全长克隆 . 18 2.3.2 大蕉 MpDhn12 基因组全长序列的克隆 . 22 2.3.3 大蕉 MpDhn12 的生物信息学分析 . 23 2.4 讨论 . 25 2.5 小结 . 25 第第 3 章章 MpDhn12 的原核表达与多克隆抗体的制备的原核表达与多克隆抗体的制备 . 27 VII 3.1 材料、试剂与仪器 . 27 3.1.1 实验材料 . 27 3.1.2 主要试剂及主要溶液的配制 . 27 3.1.3 实验仪器 . 29 3.2 实验方法 . 29 3.2.1 MpDhn12 原核表达载体的构建 . 29 3.2.2 MpDhn12 蛋白的诱导表达和纯化 . 29 3.2.3 MpDhn12 多克隆抗体的制备 . 31 3.3 结果与分析 . 33 3.3.1 MpDhn12 与 ERD14 原核表达载体的构建 . 33 3.3.2 MpDhn12 原核表达体系的优化 . 35 3.3.3 MpDhn12 与 ERD14 原核表达蛋白的纯化 . 42 3.3.4 MpDhn12 多克隆抗体的制备 . 44 3.4 讨论 . 45 3.5 小结 . 46 第第 4 章章 MpDhn12 的的 Cu2+结合特性及其在结合特性及其在 Cu2+作用下结构特性分析作用下结构特性分析 . 48 4.1 材料、试剂与仪器 . 48 4.1.1 实验材料 . 48 4.1.2 实验试剂及主要溶液的配制 . 48 4.1.3 实验仪器 . 49 4.2 实验方法 . 49 4.2.1 MpDhn12 铜离子结合能力的斯卡查德曲线分析 . 49 4.2.2 金属离子螯合层析 . 49 4.2.3 IMAC 分析植物体内的 MpDhn12 与 Cu2+的结合 . 50 4.2.4 热稳定性分析 . 51 4.2.5 蛋白酶解 . 51 4.2.6 圆二色谱 . 51 4.2.7 沉淀分析 . 52 4.3 结果与分析 . 52 4.3.1 MpDhn12 与 Cu2+结合的体外 IMAC 分析 . 52 VIII 4.3.2 MpDhn12 与与 Cu2+结合的斯卡查德曲线分析 . 53 4.3.3 MpDhn12 的无序结构特征分析 . 55 4.3.4 Cu2+作用下 MpDhn12 结构的蛋白酶解分析 . 56 4.3.5 Cu2+作用下 MpDhn12 结构的 CD 分析 . 57 4.3.6 Cu2+作用下 MpDhn12 聚集的沉淀分析 . 58 4.3.7 Cu2+作用下 MpDhn12 聚集与其 Cu2+结合活性的关系分析 . 60 4.4 讨论 . 62 4.5 小结 . 63 第第 5 章章 MpDhn12 的生理功能分析的生理功能分析 . 65 5.1 材料、试剂与仪器 . 65 5.1.1 实验材料 . 65 5.1.2 实验试剂及主要溶液的配制 . 67 5.1.3 实验仪器 . 67 5.2 实验方法 . 68 5.2.1 过表达烟草载体的构建 . 68 5.2.2 烟草转化 . 68 5.2.3 植物体内 MpDhn12 的聚集特性分析 . 69 5.2.4 酵母表达载体的构建 . 70 5.2.5 酵母转化 . 70 5.2.6 酵母互补分析 . 70 5.2.7 MpDhn12 亚细胞定位载体的构建 . 70 5.2.8 水稻原生质体的制备与转化 . 70 5.3 结果与分析 . 71 5.3.1 MpDhn12 过表达烟草的获得 . 71 5.3.2 转基因烟草中 MpDhn12 与 Cu2+结合的 IMAC 分析 . 74 5.3.3 转基因烟草中 Cu2+作用下 MpDhn12 的聚集分析 . 75 5.3.4 MpDhn12 过表达烟草对铜离子胁迫耐受能力的分析 . 76 5.3.5 MpDhn12 的酵母互补分析 . 78 5.3.6 MpDhn12 过表达烟草的冷胁迫耐受能力分析 . 81 5.3.7 MpDhn12 在水稻原生质体中的亚细胞定位 . 84 IX 5.4 讨论 . 85 5.5 小结 . 86 结果与展望结果与展望 . 88 本文的主要研究结果如下 . 88 后续研究及展望 . 89 参考文献参考文献 . 91 附录附录 . 99 附录附录 1 缩略词表缩略词表 . 99 附录附录 2 在读期间发表学术论文及参加学术会议情况在读期间发表学术论文及参加学术会议情况 . 103 致谢致谢 . 104 1 第第 1 章章 文献综述文献综述 1.1 脱水蛋白的研究进展脱水蛋白的研究进展 脱水蛋白(Dehydrins)是一个具有独特免疫学特征的蛋白质家族，也称 LEA D11 或 LEA II 蛋白。脱水蛋白最早在棉花的胚发育晚期发现并被定义为脱水诱导表达的 蛋白(Timothy, 1996)。目前，脱水蛋白被认为是含有一个至几个非严格保守的结构域 （K 片段，EKKGIMDKIKEKLPG）的所有蛋白的总称(Rorat, 2006)。除了高等植物之 外，脱水蛋白还存在于低等植物和蓝细菌中(Timothy, 1997; Rorat, 2006)。 脱水蛋白家族成员最典型的结构特征是含有一个或几个保守的 K 片段。除了具 有共有的 K 片段之外， 有些脱水蛋白还存在串联的丝氨酸链(S 片段)或 N 末端含保守 序列 T/VDEYGNP 的酪氨酸区(Y 片段)以及保守性较差的 区 （富含甘氨酸和极性氨 基酸的区域） 。脱水蛋白的一级结构示意图如图 1.1。不同的脱水蛋白之间，K 片段、 Y 片段和 S 片段的数目以及排列顺序存在着差异： K 片段可有 1-n 个， Y 片段可有 0-n 个，S 片段可有 0-l 个，S 片段可在 K 片段之前，也可在 K 片段之后，Y 片段则一般 排列在 N 末端。根据 K，S，Y 的数目和排列顺序的不同，目前将脱水蛋白分为 5 亚 类，分别是：YnSKn, YnKn, SKn, Kn and KnS (Timothy, 1997; Rorat, 2006)。 图图 1.1 典型的脱水蛋白一级结构典型的脱水蛋白一级结构 箭头表示位置可互换，其中 K 片段是脱水蛋白一级结构的必需基序，Y 片段通常有 0-n 个，S 片 段有 0-1 个， 区富含甘氨酸和极性氨基酸。 Fig. 1.1. The typical structure of dehydrins Arrows indicates the S segment can be located at the two sites. K segment is essential for dehydrins. Y segment can be ranged form 0 to n numbers. Numbers of S segment can be 0 or 1. segment is rich in Gly and polar amino acids. 2 1.1.1 脱水蛋白的分布和定位脱水蛋白的分布和定位. 脱水蛋白广泛分布于植物的各种组织。在早期，脱水蛋白主要发现分布于成熟的 种子中。如，拟南芥（Araidopsis thiniana）RAB18 和玉米（Zea mays）RAB17 主要 定位于成熟种子的胚乳(Lang and Palva, 1992; Goday et al., 1994a)；豌豆（Pisum sativum）DHN-COG 主要分布于胚胎发生中期和晚期的子叶和受胁迫后的叶片中 (Robertson et al., 1994)；胡萝卜 ECP40 主要分布于成熟种子的胚乳和接合子中 (Kiyosue et al., 1993)；大豆（Glycine max）的 MAT1 和 MAT9 也分布于植物的种子 中(Momma et al., 1997)。除了种子外，脱水蛋白近年来也被发现分布于植物的营养组 织和开花器官中。如，拟南芥的 ERD10 和 ERD14 被发现广泛分布于根尖、根的维管 束、痉、叶和花(Nylander et al., 2001)；桃树的 PCA40 被发现分布于表皮、韧皮部、 皮质部和木质部(Wisniewski et al., 1999)； 小麦的 WCOR410 被发现分布于根的维管过 渡区、叶和花冠(Danyluk et al., 1998)；柑桔（Citrus clementina Hort. Ex Tanaka Citrus reticulata Blanco）的 Crcor15 主要分布于果实的外皮(Sanchez-Ballesta et al., 2004)；芸 苔 ERD10 分布于叶片中(Deng et al., 2005)； 水稻 OsDhn1 分布于幼苗的根以及水稻外 稃和内稃的表皮。茄子 DHN24 被发现分布于叶和茎等(Rorat et al., 2006b)；柑桔 COR15 主要分布于叶中(Gim