（动物学专业论文）草鱼ctenopharyngodon+idellus促性腺激素及其受体基因的克隆及表达分析.pdf

摘要 促性腺激素( g o n a d o t r o p i nh o r m o n e ，g t h ) 和促性腺激素受体 ( g o n a d o t r o p i nr e c e p t o r ，g t h r ) 对鱼类性腺发育及排卵排精起重 要调控作用。本研究克隆了草鱼( 衍鲫埘a r 朋印锄j 幽j 凶g t h 两种激素三个亚基的c d n a 全长序列和g t h r 两种受体的部分序列。采 用r t p c r 分析了不同组织中两种g t hb 亚基的表达模式，并通过实 时定量p c r 技术对不同卵巢发育时期的草鱼g t h 表达水平进行了分 析。旨在探讨草鱼g t h 和g t h r 的表达与其生殖发育的关系。获得的 主要研究结果如下： 1 获得了g t hq ，f s hb 及l hb 三个基因的全长序列，为8 4 4 b p ， 7 3 9 b p 和5 7 6 b p ，它们分别编码1 1 8 ，1 3 0 和1 4 6 个氨基酸。 2 获得了草鱼的f s h r 及l h r 的部分序列。其中f s h r 为5 0 9 b p 编 码1 6 9 个氨基酸。l h r 获得了两个片段，l h r l 为8 6 9 b p 编码2 8 9 个氨 基酸；l h r 2 为1 2 0 4 b p 编码2 5 3 个氨基酸。 3 与其它物种的g t h 氨基酸序列比对表明：鱼类中g t h 的三个亚 基相似性较高，且g t hq 较f s hb 和l hb 更为保守。构建的n j 进化 树与形态分类学的系统进化相一致。 4 r t p c r 证实，草鱼g t h 仅在脑垂体中特异性表达。 5 实时定量p c r 对草鱼卵巢不同时期的f s h 和l h 分析表明：f s h 和l h 在草鱼性腺发育早期表达量很低，而在性腺成熟期则同步高表 达，且l h 的表达量高于f s h 。 关键词：g t h ；g t h r ：草鱼 t a b s t r a c t g t h ( g o n a d o 仃o p i nh o 咖o n e ) a n dg t h r ( g o n a d o t r o p i nr e c e p t o r ) p l a y ac e n 仃a 1r 0 1 ei nr 印r o d u c t i o ni nf i s hg o n a dd e v e l o p m e n ta n d o v u l a t i o n t h et h r e eg t hs u b u n i t sa n d 觚op a r t i a lg t h rc d n aw e r e c l o n e da n dc h a r a c t e r i z e d 舶mg r a s sc a 印i m p c rw a se n l p l o y e dt o c h e c kt i s s u ed i s t r i b u t i o no ff s ha n dl h r e a l t i m ep c rs h o w e dt h e e x p r e s s i o np a t t e mo fg t hi nd i f f e r e n tp e n o do fo v a 够t h i ss t u d y s h o w e d s o m er e s u l t so fg t ha n dg t h rg e n ec l o l l i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n 1 f u l l1 e n g t hc d n ao fg t h a ，f s h pa n dl h pc d n a w a s8 4 4 b p ， 7 3 9 b pa n d5 7 6 b p ，w i t ho p e nr e a d i n g 劬m ee n c o d i n gp r o t e i n so f1 18 ，13 0 a n d14 6a m i n oa c i d s ，r e s p e c t i v e l y 2 p 疵i a lc d n ao ff s h ra n dl h rw e r ec l o n e d f h s rw a s5 0 9 b p e n c o d i n g16 9a m i n oa c i d s l h ro b t a i n e dt w op a r t i a l 仔a g m e n t s l h r l w a s8 6 9 b pe n c o d i n g2 8 9a m i n oa c i d s ，a n dl h r 2w a sl2 0 4 b pe n c o d i n g 2 5 3a r n i n oa c i d s 3 p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so ft h ep r o t e i n so fg t hs h o w e dah i g h h o m o l o g yw i t ho t h e rf i s h e s h o m o l o g ya n a l y s i sa l s oi n d i c a t e dt h a tg t h a h a st h eh i 曲e s tc o n s e r v a t i o n t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a si d e n t i c a lw i t h m o 印h o l o g i c 4 王m p c ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tg t hw e r eo n l ye x p r e s s e di nt h e p l t u l t a r y u 5 r e a l 一t i m eq u a n t i t a t i v ep c r p r o t o c o l sw e r ee m p l o y e dt om e a s u r e f s h pa n dl h p m r n a s d u r i n go v a r i a nd e v e l o p m e n t t h ef s h pa n dl h l 3 m r n al e v e lw a sv e 巧1 0 wi nt h ep i t u i t a r i e so fe a r l y p u b e r t a lf i s ha n d s i g n i 6 c a n t l yi n c r e a s e dd 嘶n go v u l a t i o np e o d t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d t h a ti ng r a s sc a 印t h eg o n a d o 仃o p i n ss y n t h e s i z e ds y n c h r o n o u s l yi no r d e r f o ra s y n c h r o n o u so o g e n e s i st ot a k ep l a c e k e yw o r d s ：g t h ；g t h r ；g r a s sc a 印 l i l 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其它个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 摊论文储摊：问设 彳年多月垆日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密叼。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 作者签名：l 司毅日期：如哆年 么月日 剥醛各叩致嗍：1 引月丫日 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 第一章引言弟一早i 苗 1 1 草鱼生殖生理的研究 草鱼( c f e 门o p ，7 a 伽g o d o ，7 耐e 7 m s ) 属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科 草鱼属。3 6 年性成熟，成熟个体长约3 0 一10 0 c m 。体长筒形，腹 部无腹棱。头中等大，口前位。体被大的圆鳞，侧线平直。广泛 分布于全国各大水系。 草鱼是著名的人工养殖鱼种，早在19 5 8 年刘筠院士就对草鱼 人工繁殖进行了系统的研究。通过注射鲤鱼脑垂体匀浆液( p g ) 成功促使草鱼排卵。但进一步的研究表明草鱼与鲢鱼、鳙鱼不同， 不能通过注射人促绒毛膜激素( h c g ) 人工催产成功，h c g 对雌 性草鱼的人工催产没有成熟、排卵反应n 1 。 草鱼的性成熟年龄随着地域的不同而有所不同。在长江流域 的草鱼，性成熟年龄为4 5 龄，黑龙江流域需要6 7 年，但在珠江 流域只要3 4 年。而雄性草鱼则比雌性草鱼早熟一年。 1 1 1 草鱼性腺发育分期 根据性腺的组织学形态不同，可将草鱼的性腺发育分为6 个 时期1 2 4 】： i 期，卵巢紧贴于鳔的腹面，成透明的线状，卵原细胞成卵 索，卵原细胞细胞核明显活跃，可以观察到各种分裂相。精巢也 分布于鳔两侧，细线状，组织切片可观察到精原细胞分散于结缔 组织之间。 硕士学位论文 i i 期，卵巢为透明的肉红色扁平状。卵母细胞的细胞质中出 了卵黄核，膜外出现了滤泡细胞。精巢呈半透明的细线状，精原 细胞呈束状分布，即出现了精细小管的雏形。 i i i 期，卵巢呈青灰色，血管密布，并有较大的血管分布。卵 粒肉眼可见。卵母细胞内开始出现卵黄粒，滤泡细胞发展为两层。 精巢呈弱红色或淡黄色的圆柱状，血管密布。精细小管出现管腔。 期，卵巢呈青灰色稍带棕黄色，卵粒明显。血管分支达到 高峰。卵母细胞充满卵黄颗粒。精巢灰白色，表面有明显的血管 分布。精细小管内出现初级、次级精母细胞和精子细胞。但在同 一个精细小管的横截面中相同细胞类型是成堆排列的。 v 期，卵母细胞完全成熟，呈松软青灰色。卵粒可从泄殖腔 自动流出。精巢呈乳白色，表面血管更加明显。精细小管和壶腹 中出现充满成熟的精子。 期，卵巢表明血管萎缩，颜色为紫红色。卵巢的体积缩小， 卵巢膜松弛变厚。精巢淡黄色，体积比v 期显著缩小。排精后精 细小管中只剩下精原细胞、少数初级精母细胞和稀少的衰老精子。 1 1 2 草鱼的性周期 鱼类从受精卵生长到个体性成熟，为第一次性周期”。第一次 性周期与生长周期是同步进行的。以长江流域为例，草鱼的性成 熟周期为4 5 年。卜2 龄的草鱼卵巢处于i 期。2 龄鱼的卵原细胞 脱离卵索，细胞核成静止状态。3 5 龄的草鱼，卵巢处于i i 期，该 时期是草鱼卵巢在第一次性周期中停留时间最长的一个时期。雌 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 性草鱼在成熟期的前一个冬季进入i 期。在卵粒完全成熟前为 期。到成熟期的夏季进入v 期排卵。排卵后进入期。精巢的发 育和卵巢相似，卜2 龄的雄性草鱼精巢处于i 期。2 龄的草鱼精巢 进入i i 期。进入3 4 龄的草鱼精巢发育到i 期。成熟期的前一个 冬季进入期。性成熟排精时为v 期，之后进入期。 完成生殖之后的草鱼性腺进入期后自然衰退，进而新的卵 母细胞和精母细胞开始发育【5 1 ，在冬季进入i i i 期。第二年与前一年 的周期一致。 1 2 鱼类g t h 的研究进展 ：1 2 1 鱼类垂体的结构 ： 鱼类垂体位于间脑腹面，与下丘脑紧密相连。它的是一个双 起源的结构：是由原始口腔顶壁外胚层细胞和间脑底壁分化出来 的。整个垂体呈圆形小体，可分为神经垂体和腺垂体两个部分。 神经垂体起源于外胚层，与下丘脑相连，呈纤维状的轴突伸 向整个垂体。这种结构把脑和垂体联系起来，使脑和垂体的信息 能够交流。 腺垂体起源于胚胎口凹的外胚层表皮，主要分泌生长素、促 甲状腺激素，促肾上腺皮质激素、催乳素、促性腺激素和促黑色 素激素。它们分别由六种不同的分泌细胞所分泌。 硕士学位论文 促性腺激素分泌细胞是脑垂体中六种分泌细胞中与生殖密切 相关的分泌细胞1 。草鱼中只存在一种g t h 分泌细胞，但这种g t h 分泌细胞中却存在分泌颗粒和分泌小球。有的学者认为小的分泌 颗粒分泌l h ，而大的分泌小球则分泌f s h ，然而该假说尚未得到证 实。 1 2 2 鱼类g t h 的研究历史 g t h 是糖蛋白激素，它是由q 和b 两个亚基组成的。19 8 2 年 b u r z a w a g e r a r d 的研究表明鱼类有g t h 的存在，当时只发现一 种g t h 。2 0 世纪8 0 年代末，通过对鲑鱼的研究发现在鱼类中有两 种不同g t h 的存在，分别命名为g t hi 和g t hi i 陋3 。此前所发现的 g t h 为g t hi i 。对哺乳动物的研究，也分离出了g t h 的两个亚基并 获得了c d n a 序列m 。而且将这两种g t h 分别命名为f s h 和l h 。在 19 9 9 年，b e r g e n 提议将鱼类的g t hi 和g t h1 1 分别命名为f s h 和 l h ，得到了广泛的认可。 在国外的研究中，鲑鱼作为主要的研究对象，在g t h 的研究 中处于领先。1 9 8 8 年在大马哈鱼( 锄c d 硝如幽，s 加于a ) 中通过色谱 纯化分离出两种g t h 。之后i 在鲤鱼1 ( o 矽j 乃姻c a 印j a ，细 须石首鱼1 1 1 ( 胧甜印唧力j a s 姗咖- a 芒，曲，真鲷1 2 1 ( 尸a d s 伽晒 肋如，) ，虹鳟1 3 1 ( 锄c d 砌肌拍“s 脚啸j s s ) ，大眼金枪鱼( 劢蝴舢s d 6 e s “由等硬骨鱼类中都克隆了这两种g t h 。 随着分子生物学技术的发展，g t h 的二元性，即g t h 包括f s h 和l h 两种激素，在更多的鱼类中得到了证明。包括青鱼 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 ( 酣y l o p h a r y n g o d o np ic e u 由、1 确。超饕鱼( c a r a s siu sa u r a t u 由、鼬， 鳙鱼( 、日y p o p at b a i m ic bt h y sn o b jn 吏1 ，斑马鱼( d a n ior e r i 凶、嘲。 秋白鲑( 铆p g 移力，sa ，舌“刎7 a - j s ) 1 引，马苏大马哈鱼( 砌c d 砌y 刀幽，s 嬲s p 西20 i ，斜带石斑鱼( 助勘啦吕“sc d j d j 幽s ) 2 ，日本鳗鲡 ( 彳力j - a 却伽j c a ) 2 纠，西伯利亚鲟( 彳e 劫鲫s 盯施e 订d 2 3 3 等 等。 系统进化分析表明g t hq 作为糖蛋白激素所共有的亚基，在不 同的物种中相当保守3 。在鲤鱼他引，鲫鱼乜5 3 和几种鲑鱼呦m 7 1 中克隆 出两种不同序列g t hq 。这可能与这几种鱼的染色体二倍化有关 眈引。而f s hb 和l hd 在进化上相对较快，在不同物种中相似性不 如g t hq 高，但在不同物种中，f s hb 和l hb 的半胱氨酸残基是保 守的，如图卜1 ，这与它们的构象和功能都是密切相关的。 争夺 f # 妇；埏# 电戡茂礴融 别螗叠吲矗捌雌 o 蜘i d 抽y 尊 图1 1 左图示几种硬骨鱼类f s hd 的对比。半胱氨酸用黑色背景突出显示。右 图示硬骨鱼类f s hd 的进化树( 摘自z v iy a r o n ，20 0 3 ) 5 =二：m一： 硕士学位论文 1 2 3 鱼类g t h 的功能研究 在哺乳动物中，存在着两种促性腺激素，f s h 和l h 。f s h 的功 能主要是促进配子的发生和性腺发育，而l h 的主要作用为配子成 熟和排出。 鱼类是脊椎动物中种类最多的一个类群，与其它脊椎动物一 样，其生殖调控主要依赖于下丘脑一脑垂体一眭腺轴。由下丘脑分 泌的促性腺激素释放激素调节脑垂体分泌g t h 。g t h 包括f s h 和l h 两种。这两种g t h 都由q 和b 两个亚基组成。它们的q 亚基是完 全一致的，而b 亚基则不相同，其b 亚基为它们的功能亚基。g t h 则通过血液迁移到性腺中，与其受体g t h r 结合。g t h r 则促进性腺 分泌内固醇类激素，促进性腺成熟、排卵排精。在雌性卵巢中， 主要的雌性激素为17b 一雌二醇。而在雄性的精巢中则主要为睾丸 酮。g t h 是性腺产生性激素的主要调控者，摘取了脑垂体的鱼类， 产生性激素的调控途径被破坏，第二性征不能表达n 1 。 1 。2 。3 1 鲑鱼类g t h 的功能研究 如前所述，对于g t h 的研究，在鲑鱼类中是比较深入的。通 过对几种鲑鱼的研究发现，f s h 和l h 都对雌二醇的分泌有激活作 用。但是对于诱导成熟的类固醇( m a t u r a t i o n i n d u c i n gs t e r o i d ) 则仅仅被l h 所调控。原位杂交和免疫组织化学的结果表明在个体 未成熟的卵黄发生期，f s h 在脑垂体中广泛存在。而l h 则在卵细 胞成熟期在脑垂体中广泛存在乜们叫。在虹鳟中，f s h 负责卵黄蛋白 原和卵巢的结合3 1 m 引。对于银鲑( 锄c d 砌朋c 力“s 竹s “芒c 力) 的研 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 究表明在未达到性成熟个体的血液中只能检测到f s h ，且f s h 在卵 黄发生期表达水平最高，随后在排卵期降低b 引。因此，在鲑鱼类 中f s hb 的m r n a 水平在配子发育早期升高，而l hbm r n a 水平则在 排卵期起主要作用。在排卵之后f s hb 的m r n a 水平又升高，直到 再次排卵前。因此在鲑鱼类中，f s h 主要作用为促进配子发生和性 腺发育，而l h 的主要作用为促进配子最终成熟和排卵( 如图卜2 ) 。 伪船捌= ；v m 伊扫“档 张吲 罄f 彻螂撇舟。粕罐纠b 图卜2a 和b 分别为鲑鱼类f s hp 和l hp 的作用机制( 摘自z v iy a r o n ，2 0 0 3 ) 1 2 3 2 非鲑鱼类g t h 的功能研究 星康吉鳗( 仍刀g e ，妒j a s 芒 ) f s h8 的m r n a 水平与鲑鱼类 相似，在卵黄发生早期达到峰值而后下降。l hb 的m r n a 水平则在 卵巢发生期显著上升引。日本鳗鱼中，f s hb 的m r n a 水平在未成 熟个体中高表达，但注射性腺发生期的g t h 之后，则一直到排卵之 后都维持在较低水平。但是l hb 的m r n a 水平在卵巢成熟期和排卵 期才显著上升。所以，在日本鳗鱼中，f s h 主要调控性腺发育，而 l h 主要调控卵巢成熟及排卵引。在鳗鱼类中，g t h 有着与鲑鱼类 硕士学位论文 相似的调控模式。而在大眼金枪鱼中雌二醇和睾酮均被f s h 和l h 所调控，且l h 的作用较强n 4 | 。 在鲤鱼中，f s h 和l h 对于类固醇的调节机制和卵母细胞成熟的 调控作用相似，且l h 比f s h 的作用更强n 训。鲫鱼的研究也表明，f s h 和l h 在生殖周期中是平行表达的，即从卵黄发生期到成熟排卵f s h 和l h 的表达量都是基本一致的。在未达性成熟的个体中f s h 和l h 的 表达量都较低，在成熟排卵期达到最高，在排卵后f s h 和l h 的表达 量都同时降低。在所有的时期l hb 都高于f s hbn 6 m 引。青鱼的f s h b 和l hb 在性成熟前在血液中就能检测到口 。在鲤科鱼类中，g t h 可能有相似的调控模式，即f s h 和l h 都调节性腺成熟及排卵，但l h 的作用更加有效。 1 3 鱼类g t h r 的研究现状 g t h r 包括f s h r 和l h r ，它们和促甲状腺激素一样属于g 蛋白偶 联受体，为七层跨膜结构的膜蛋白。在灵长类和马中，除了l h r 除了与l h 结合还与绒毛膜激素( c g ) 结合。1 9 9 2 年3 们和1 9 9 4 年1 ， 以银鲑为材料证实了f s h 和l h 能够与颗粒细胞和滤膜细胞结合。直 到1 9 9 9 年，从琵琶鳟( 砌c 椭朋幽，s 砌d 加u s ) 的卵巢中克隆出 两种g t h r 被报道4 1 j 。此后，罗非鱼( 伢吕d c 力，伽j s 力j - d 芒j c 口砖4 引， 斑点叉尾鲴( 凡芒a - u sp 蝴c 芒a “曲训1 ，非洲鲶鱼( 甜a ，j a s 船r j 印拍，由和斑马鱼3 中，f s h r 和l h r 都获得了c d n a 序列。 相对于g t h 来说g t h r 在生殖周期中的表达研究要少许多。对于 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 银鲑的研究显示f s h r 在卵黄期卵巢的卵泡内膜细胞和颗粒细胞 中，而在排卵期前却只在卵泡内膜细胞中集中表达。对于精巢， 在各种时期中f s h r 均只表达于滋养细胞中。而l h r 则在排卵期前高 表达于颗粒细胞中和精巢成熟期的间质细胞中明n 叫。在斑马鱼中， 卵黄生成期f s h r 的表达水平明显升高，在卵母细胞的卵黄生成作 用完成后明显下降。而l h r 则在卵黄生成后达高表达n 引。斑点叉尾 铜的f s h rm r n a 水平在卵巢发育时增加，并在卵子成熟前降低。l h r 则在排卵期达到峰值h 3 m 引。鲑鱼中的g t h r 表达模式也与其它鱼类 似，与g t h 是同步的删1 。 g t h r 与g t h 结合的特异性和亲和性主要依赖于b s t r a n d s 区 的富含亮氨酸区域，而其跨膜结构则行驶g 蛋白信号转导功能。g t h 与g t h r 的细胞外区域结合，引起七层跨膜区域发生构象变化，通 过c a m p 激活，导致类固醇激素合成级联反应。对哺乳动物的研究 表明，g t h 和g t h r 没有交叉结合反应，即f s h 只能与f s h r 结合，而 l h 只能和l h r 结合。这种结合在鱼类则呈现出多样性。如斑马鱼n 阳 和非洲鲶鱼4 引，f s h r 不仅能与f s h 结合而且能与l h 结合，l h r 也可 以与f s h 和l h 结合。但琵琶鳟n 妇的f s h r 只能特异性结合f s h ，不能 与l h 结合。l h r 高特异性的与l h 结合，也能与f s h 结合，但结合效率 较l h 低。 硕士学位论文 f f f fj j f f f f j j j j j i j j j j f s h r 岫 f s h 髓。，选，基一 f f f f ；jf f ff f f f i ，?! 朋f f j j j j ij j j j jj j j j j !? 叫“ 。、；。 f s h 牛s h r 腿f s h _ f 引r 惦d 忡 图1 3 f s r 与f s h 结合模式田( 摘自q i n g ，2 0 0 5 ) 嘲 0 9 8 7 65432 1 圉1 4 人类f s i 【r 结构模式图，箭头表示d s tr a n d 区域( 摘自q i n b ，20 0 5 1 4 本文的研究目的及意义 g t i 和g t h r 在鱼类生殖周期中有着重要的作用，其对性腺类固 醇激素的调节直接影响到鱼类的性别决定和生殖发育。就闷前而 肓，尽管在鲑鱼类中研究已经比较深入，但在鲤科鱼类中研究尚 浅。如前所述鲤科鱼类的表达模式和鲑鱼类有很大区别，因此对 草鱼g t h 和g t h r 的研究丰富了对鱼类g t h 和g t “r 的认识。另外，草 ，ll，l五酉 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 鱼是我国著名的水产养殖品种，其经济价值高，市场需求大。草 鱼的性腺发育和人工繁殖从2 0 世纪5 0 年代就是研究热点，但从分 子生物学角度的研究还只是冰山一角。本文从分子生物学手段入 手，克隆了草鱼的g t h 全长和g t h r 部分序列，为草鱼繁殖生理和人 工繁育提供了重要的理论依据。 硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 实验材料 实验材料草鱼( 包括5 龄，3 龄，1 龄的雌雄个体) 均购买自长 沙市的农贸市场。 2 2 方法 2 2 1 材料的收集 用手术刀和解剖剪取得垂体和性腺材料，装入e p 管后放入液氮 罐，防止r n a 在常温下降解。冻好的组织材料立即进行r n a 提取或放 入一8 0 冰箱冻存。 2 2 2 总r n a 的提取 2 2 2 1 实验用具的预处理 r n a 提取过程中所要用到的研钵、t i p 头、e p 管都需要浸泡于o 1 的d e p c 水( d e p c 水有挥发性致癌毒性，应穿实验服并戴一次性手套， 操作，并注意在通风橱中操作) 中处理1 h 后，用高压灭菌锅灭菌， 以去除r n a 酶。灭菌后的实验用具放入6 0 的烘箱中干燥，备用。 2 2 2 2r n a 的提取和第一链c d n a 的获得 从液氮罐中拿出组织或从一8 0 冰箱中取出要提取的组织。本实 验所用r n a 提取试剂盒为o m e g a 公司生产的e z n at o t a lr n ak i t 试剂盒，r n a 提取按照该试剂盒说明书进行。具体操作方法如下： 1 取4 0 m g 的组织，用液氮冷却后的研钵充分研磨材料，然后加 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 入1 m l 裂解液，移入2 o m le p 管中，室温下裂解5 m i n 。 2 加入2 0 0ul 氯仿，充分混匀，冰上放置1 5 m i n 。 3 4 1 2 0 0 0 r m i n 离心1 5 m i n 。离心好的样品分为3 层，吸取 最上层的透明相到新的e p 管中。 4 加入相当于透明相1 3 体积的9 6 1 0 0 乙醇，混匀。 5 转移混合液至h i b i n dr n a 柱中，室温下l o o o o r m i n ，离心 1 m i n 。弃去收集管中的滤液。 6 加入3 0 0ulw a s h b u f f e ri ，室温下1 0 0 0 0 r m i n ，离心1 m i n 。 弃滤液。再加入5 0 0ulw a s hb u f f e ri ，室温下1 0 0 0 0 r m i n ，离心 1 m i n 。弃去滤液。 7 将柱子套回收集管中，加入5 0 0plw a s hb u f f e ri i ，室温下 1 0 0 0 0 r m i n 离心1 m i n 。再重复一次后，1 4 0 0 0 r m i n 空转l m i n 以出 去柱子中剩余液体。 8 将柱子移入新的e p 管中，加入3 0uld e p c 水到膜中央。室温 放置2 m i n 后1 2 0 0 0 r m i n 离心l m i n 。离心管中的剩余液体即为提取 出的r n a 。 提取时要注意r n a 酶污染，应戴一次性手套并经常更换。提取好 l 的r n a 电泳和分光光度计检测并立即反转录为c d n a 或冻存于一8 0 冰 箱中。 提取好的r n a 用m b i 公司生产地r e v e r t a i df i r s ts t r a n dc d n a s y n t h e s i sk i t 试剂盒反转录获得第一链c d n a 。其反应过程为三步法： 第一步，在2 0 0ule p 管中加入1 0 n g 一5ugr n a ，o l i g o ( d t ) 1 8p r i m e r 硕士学位论文 1pl ，加水定容至1 2ul 。混匀，微型离心机离心，p c r 仪上7 0 5 m i n 。 冰上冷却。第二步，依次向e p 管中加入4 | ll 的5 r e a c t i o nb u f f e r ， 1ul 的r i b o l o c kr n a s ei n h i b i t o r ( 2 0 u ul ) 和2ul 的1 0 m md n t p 。 混匀，微型离心机离心，p c r 仪上3 7 5 m i n 后冰上冷却。第三步， 力口入 1plr e v e r t a id 删hm i n u sm m u l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e ( 2 0 0 u ul ) 后微型离心机离心，p c r 仪上4 2 延伸1 h ，最后，7 0 l o m i n 终止反应。得到的c d n a 片段用b a c t i n 引物扩增检测。 2 2 3p c r 扩增得到部分c d n a 片段 2 2 3 1r t p c r 号l 物设计 参照文献报道，以人( 胁肋唧j 鲫、西伯利亚鲟，斑马鱼、鲫 鱼、虹鳟的基因保守序列，利用p r i m e rp r e m i e r5 软件设计引物。所 设计特异引物如表2 1 所列： 表2 1通过对比不同物种序列所设计的特异引物 1 4 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 2 2 3 3r t p c r 扩增 以b a c t i n 引物扩增条件为例( 其它引物扩增的退火温度见表 2 1 ) ：9 4 变性5 m i n 后进入循环；9 4 变性3 0 s ，5 3 退火3 0 s ， 7 2 延伸1 m i n ，共3 5 个循环；最后7 2 延伸1 0 m i n 。得到的产物， 用1 2 的琼脂糖凝胶电泳检测。p c r 反应体系：见表2 2 。 表2 2p c r 反应体系 样品体积( “l ) d d h 2 u b u f f e r d n t p ( 1 0 m m ) m 9 2 + ( 2 5 埘) 正向引物( 1 0 i i l m ) 反向引物( 1 0 m m ) 总c d n a t a q 酶( 购自m b i 公司) 1 1 6 2 1 6 1 6 o 6 o 6 1 1 2 2 3 4 目的片段的回收与纯化 检测到阳性的反应后。重复扩增反应一次，扩大p c r 反应体系至 5 0ul ，产物用2 o 的琼脂糖胶电泳。本实验所用胶回收试剂盒为上 海生工生产的柱式d n a 胶回收试剂盒。具体操作如下： 1 用干净的手术刀，在紫外灯下切割所需要的片段，然后琼脂糖 胶块装入1 5 m le p 管中，并称取所割得的琼脂糖胶的重量。 2 加入b i n d i n gb u f f e ri i ( 每1 0 0 m g 胶加入7 0 0ul ) 。放入5 0 6 0 的水浴中融解l o m i n 。每2 分钟震荡一次，直到切割下来的胶块完 全融解为止。 3 将融解后的溶液加入试剂盒提供的柱式离心管中，常温放置 2 m i n 后8 0 0 0 r p m 离心l m i n ，弃去收集管中的废液。 4 加入5 0 0ulw a s hs 0 1 u t i o n ，8 o r p m 离心1 m i n ，弃去收集管 硕士学位论文 中的废液。 5 重复第4 步骤一次。 6 把离心柱放入离心机，1 0 0 0 0 r p m 离心1 m i n 。 7 将离心柱套入一个1 5 m l 的e p 管中，加入4 0ule 1 u t i o n b u f f e r ，6 0 水浴中放置3 m i n 后，1 0 0 0 0 r p m 离心l m i n 。e p 管中的溶 液即为产物。经过琼脂糖凝胶电泳检测后放入一2 0 冰箱保存或立即 进行后续的连接实验。 2 2 3 5 连接 胶回收的产物做t a 克隆，克隆载体为t a k a r a 公司提供的p m 俨 1 8 一tv e c t o r 载体，载体图谱如图2 1 所示。其反应体系为1ul 载 体，1ul 的胶回收产物，3ul 的d d h ：o 和5pl 水。在1 6 水浴中反 应过夜。 图2 lp m d1 8 一tv e c t o r 载体图谱 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 2 2 3 6 转化大肠杆菌及筛选、鉴定 将5ul 连接产物加入装有1 0 0pl 嬲口感受态的e p 管中，用 t i p 头小心反复吸取混匀后冰上2 0 m i n ，4 2 水浴热激9 0 s 后立刻冰 上冷却2 m i n ：向e p 管内加入8 0 0ull b 培养基，摇床3 7 ，2 3 0 r p m 培养4 5 m i n 。取1 0 0ul 菌液在含有1 0 0 m g la m p 的l b 平板上涂均匀。 先正面朝上在3 7 培养箱培养l h 后倒置培养1 1 1 5 h 。 挑取培养后l b 平板上的单菌落到含有1 0 0 m g la 1 p 的l b 液体培 养基中，3 7 ，2 5 0 r p m 摇床培养6 h 。 2 2 3 7 阳性菌液的检测、保存及测序 收集到的菌液用m 1 3 引物做p c r 扩增以检测克隆是否为含目的基 因载体的菌液。将确定为阳性克隆的菌液分装l o oul 送上海生工测 序，剩下的菌液则按照l ：l 的比例加入已灭菌的3 0 的甘油放一8 0 保存。 2 2 3 8 序列分析 测序结果经过与引物的拼接后，在n c b i 上的b l a s t ( b 主主q ；么么鱼! 垒墨主：旦堡垫i ：旦! 堡：旦i 垒：g q y 么旦! 垒苎主：璺g i ) 中进行比对以确定 克隆序列为所需序列。 2 2 43 幂口5 r a c e 2 2 4 1 模板的获得 3 r a c e 的模板获得与上面所述第一链c d n a 相同，但反转录时 所用的0 1 i g o ( d t ) 。p r i m e r 被替换为3 r a c ea d a p t o r ( 如表2 3 所 示) 。 硕士学位论文 5 r a c e 的模板用c 1 0 n t e c h 公司提供的s m a r pr a c ec d n a a m p l i f i c a t i o nk i t 获得。其具体操作如下： 1 在2 0 0ule p 管中依次力口入3ulr n a ，1 | jl5 一c d sp r i m e r a 和1uls m a r ti i a0 1 i g o 。混匀后在p c r 仪上7 0 2 m i n ，然后 冰上冷却2 m i n 。 2 依i ! j 力口入2ul5 f i r s t s t r a n db u f f e r ，1uld t t ( 2 0 m m ) ， 1uld n t pm i x ( 1 0 i i 】m ) 和1ulp o w e r s c r i p tr e v e r s et r a n s c r i p t a s e 。 3 用移液枪轻轻混匀后，p c r 仪上4 2 延伸9 0 m i n 后7 0 7 m i n 终止反应。一2 0 保存待用。 2 2 4 2r a c e 引物设计 3 r a c e 和5 r a c e 的接头引物均由试剂盒提供。而特异引物则 根据通过特异引物所测出的序列进行设计。由于单侧引物的特异性 低，所以进行嵌套式p c r 以提高特异性。3 r a c e 的特异引物为正向 引物，如表2 3 所示。而5 r a c e 则为反向引物，如表2 4 所示。 表2 33 r a c e 扩增的引物设计 1 8 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 表2 4 5 r a c e 扩增的引物设计 2 2 4 3p c r 扩增 为了提高p c r 的特异性3 r a c e 采用嵌套式p c r 。以反转录的 c d n a 为模板，第一次p c r 用3 接头引物和外侧引物进行扩增，退火 温度如表2 3 所示，反应条件和体系与2 2 3 3 一致。第二次p c r 则 l 用3 接头引物和外侧引物进行扩增。 5 r a c e 与3 r a c e 相似，也采用嵌套式p c r 。第一次p c r 所用 的引物为试剂盒提供的u p m 和按已有引物设计的外侧特异引物。第二 次扩增使用的是试剂盒提供的n u p 引物和内侧特异引物，条件反应和 体系同2 2 3 3 。 2 2 4 4 产物的纯化，克隆及测序 胶回收，连接，转化，挑取克隆，扩大培养和测序步骤与 2 2 3 4 2 2 3 7 同。 2 2 4 5 序列拼接及序列分析 测序结果拼接后，用n c b i 提供的b l a s t 服务 硕士学位论文 ( h 主主乜；么么坠1 垒墨主：n 堡垫i ：翌! 塑：堡i h ：g q y 么堡! 垒墨主：璺g i ) 进行比对以确定克 隆序列为所需序列。用d n a m a n 软件找出开放阅读框并预测其编码的 氨基酸序列。 2 2 5 系统进化分析 、在g e n b a n k 中搜索青鱼、鲤鱼、金鱼、鳙鱼、斑马鱼、秋白鲑、 马苏大马哈鱼、大马哈鱼、虹鳟、斜带石斑鱼、日本鳗鲡、西伯利亚 锝、鸟龟( 妇u r e m y sr e e v e s n 、) 、鹌鹑( 、c o tl l r n i xc o t u r n i 加昶人 的g t h 序列。对于g t h r ，搜索到了斑马鱼，斑点叉尾鲴，非洲鲶鱼， 金头鲷，尼罗罗非鱼，虹鳟，大西洋鲑，赤腹蝾螈( 伽印s p y h h o g a s t e 南，鸡( 、g a n u sg a n u s 、) ，家鼠0 m u s 舢s c u i u 南稚煳 g t h r 序列。采用在线比对系统c 1 u s t a w l2 o 进行氨基酸序列的比较 ( h t t p ：w w w e b i a c u k t o o l s c l u s t a l w 2 i n d e x h t m l ) 。 将比对的序列输入d n a s t a r 软件，采用c 1 u s t a w lwm e t h o d 算法 构建系统进化树。 ， 2 2 6g t h 在不同组织的表达分析 提取大脑，间脑，中脑，小脑，脑垂体，心脏，肝脏，脾脏，肾 脏，肌肉，精巢和卵巢的r n a 。反转录为c d n a 后，以不同组织的c d n a 为模板，表2 1 中的特异引物扩增。b a c t i n 引物作为参照。反应 条件和体系和2 2 3 3 相同。结果用2 的琼脂糖凝胶电泳检测。 2 2 7g t h 在卵巢不同发育时期的表达分析 对不同发育时期的表达分析采用相对荧光定量p c r ( r e a 卜t i m e p c r ) 。本实验采用的是a b i 公司提供的a p p l i e db i o s y s t e m s7 5 0 0 草鱼促性腺激素及其受体的克隆及表达分析 r e a l t i m ep c rs y s t e m s 。 2 2 7 1r n a 样品和第一链c d n a 的制备 提取l 龄，3 龄和5 龄雌性草鱼卵巢组织的r n a 。在反转录之前， 用无r n a 酶的d n a s ei 进行消化以去除d n a 污染。其具体操作如下： 取一个用d e p c 水处理过的2 0 0ple p 管，依次加入3plr n a ，1ul d n a s ei 和1ulr i b o l o c kr n a s ei n h i b i t o r ，3 7 水浴中消化1 5 m i n 。 消化后的混合液按2 2 2 2 提供的步骤进行反转录。 2 2 7 2 荧光定量p c r 引物的设计 r e a 卜t i m ep c r 引物由a b i 公司提供的p r i m e re x p r e s s2 o 软 件设计，其退火温度均为6 0 ，如表2 3 所示。 表2 5r e a 卜t i m ep c r 引物的设计 2 2 7 3 荧光定量p c r 及结果分析 如前所述，本实验所用系统为a p p l i e db i o s y s t e m s7 5 0 0 r e a 卜t i m ep c rs y s t e m s 。反应的模板为稀释了2 0 倍的1 龄，3 龄和 5 龄的卵巢c d n a 。反应体系为2 0ul ，其中正反向引物浓度各为 2 0 n m o l l ，每管力日入5ulc d n a ( 按1 ：2 0 稀释) 幂口5uls y b rg r e e n p c rm a s t e rm i x ( a b i 提供) 。每个样品设3 个平行管以去除操作中 发生的误差。以b a c t i n 为参照。反应条件为：5 0 ，2 m i n ；9 5 ， 2 l 硕士学位论文 1 0 m i n 后进入循环；条件为9 5 ，1 5 s ，6 0 ，4 5 s 共4 0 个循环。设 置在6 0 ，4 5 s 退火这一过程收集荧光。参照l i v a r k 等提出的相对 标准曲线法，对相对定量结果进行数据分析。并用融解曲线法检测 p c r 引物结