茯苓菌种质量标准及检验规程.doc

茯苓菌种质量标准及检验规程【摘要】 目的规范茯苓菌种分离、培育方法，制定茯苓菌种质量标准及检验规程。方法在传统产区选择23代，体重2.5 kg以上的优质鲜菌种作为种苓，进行（母种、原种、栽培种）的分离与培养。结果制定了茯苓菌种质量标准及检验规程。结论标准及规程的建立保证了茯苓菌种的质量。【关键词】 茯苓 菌种 质量标准 检验规程 茯苓为传统常用中药材，在我国有着两千多年应用历史1，人工栽培的尝试始见于一千五百多年前南北朝时期的本草经集注，爰至南宋，栽培技术已臻完备，宋癸辛杂识记载的使用新鲜菌核作种的“肉引栽培”方法，一直沿用至20世纪60年代2。20世纪70年代初，在华中农业大学杨新美教授指导下，湖北成功地研制出“茯苓纯菌丝菌种”，并以其代替传统“肉引”作为种源，开创了茯苓的“菌种栽培”3。该种技术经三十多年应用，已在全国广泛推广。但是，由于各地在菌种分离、培育等具体方法方面存在一定差异，导致菌种质量不一4。19992002年，本课题组在承担“九五”国家重点科技攻关项目“茯苓药材规范化种植研究”期间，初步规范了茯苓菌种分离、培育方法，制定了茯苓菌种质量标准及检验规程。目前，该项研究仍在继续进行。现将该项工作的初试情况报道如下。1 茯苓菌种的分级 用于分离茯苓菌种的鲜茯苓菌核称为种苓，由种苓直接分离、培育的一级菌种，称为茯苓母种；母种经扩大培育的二级菌种，称为茯苓原种；原种经扩大培育的三级菌种，直接用于栽培种植，称为茯苓栽培菌种。2 种苓来源及标准2.1 种苓来源在传统产区，选择优良栽培菌株（品系），提前进行培育；在栽培培育出的新鲜菌核中，进行认真挑选。2.2 种苓标准23代，体重2.5 kg以上的优质鲜菌核；个体较大，近球形；外皮较薄，颜色黄棕色或淡棕色，有明显的白色或淡棕色裂纹；生长旺盛，切或掰开后，内部苓肉色白，茯苓气味浓郁，有较多乳白色或淡青色浆汁渗出；外皮完整，无虫咬损伤，无腐烂异样。2.3 种苓的储存与运输种苓选定后要及时进行分离使用；若需暂短储存或运往他地使用，必须埋在湿沙内，以防干燥。3 培养基制备3.1 母种培养基原料为马铃薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，松根或松木屑煎汁40 ml，琼脂20 g，水1 000 ml；将松根（或松木屑）加适量水（以淹没23 cm为度），煎煮30 min，用八层纱布（用水浸湿后拧干）过滤，取滤液静置1 h使沉降，取上清液浓缩至约40 ml，备用。将马铃薯去皮（挖去发芽薯块芽眼），洗净，切成薄片，用水冲洗干净，称取200 g，加水1 000 ml，煮沸至软而不烂为度，用八层纱布（用水浸湿后拧干）过滤，取滤液。称取琼脂20 g，加入马铃薯滤液中，煮至全部溶化。溶液中加入葡萄糖，搅拌溶化，再加入松根（或松木屑）煎汁，并加水补足1 000 ml，分装于试管或三角瓶中；将配制的母种培养基置高压灭菌锅内，用1.0 kg/cm2压力（温度121.3）灭菌30 min；试管趁热摆放斜面，冷却后，备用。3.2 原种培养基原料为小麦粒90%，松木屑10%，营养液（1%蔗糖、0.4%硝酸铵或硫酸铵）；将麦粒精选，除去瘪粒、杂质，洗净，置40左右温度的营养液中浸泡10 h，取出，滤干。将滤出的小麦粒与5%松木屑混拌均匀，装入400 ml盐水瓶或聚丙烯硬塑料瓶内，边装料边振摇，并用扁形铁钩或木棒稍压实，使之均匀装至瓶肩处。将另5%松木屑用营养液润湿，盖在瓶内培养基料表面，厚约0.4 cm。用锥形木棒在瓶中扎一直洞约至瓶底，揩净瓶内壁、外壁沾有的物料，塞紧棉塞或具海绵塞的瓶盖。瓶盖外部用二层报纸包裹，用棉索或橡筋进行包扎；将配制的原种培养基置高压灭菌锅内，用1.4 kg/cm2压力（温度129）灭菌2 h，或置常压灭菌灶内，用流通蒸气（100）灭菌810 h；灭菌后慢慢冷却，备用。3.3 栽培种培养基（松木屑型培养基）原料为松木屑78%，米糠（或麦麸）20%，蔗糖1%，熟石膏1%，水料比11.01.2；首先将蔗糖溶于水中。将米糠（或麦麸）与熟石膏混匀，再加入松木屑，拌匀。然后加入溶化了的蔗糠水，翻拌均匀，使培养基料含水量为44%70%。即紧握培养基料使指间稍见渗水为度。培养基料配制后放置30 min，待水份均匀透入料中，进行装袋。将聚丙烯塑料袋（12 cm，高24 cm，厚4丝）折角呈方底形，把配制的培养基料装入袋中，每袋400 g左右，随后压实并抹平表面，揩净袋口内外壁表面沾有的物料，套入硬塑料颈圈，把袋口向外翻出1.42.0 cm，盖上具海绵塞的塑料套盖，套盖外部用两层报纸包裹，用棉索或橡筋进行包扎；将配制的栽培种培养基置常压灭菌灶内，用流通蒸气（温度100）灭菌810 h，或置高压灭菌锅内，用1.4 kg/cm2压力（温度129）灭菌2 h；灭菌后慢慢冷却，备用。 4 母种分离与培养4.1 分离将预先选好的种苓用清水冲洗至无泥沙，待表面稍干移入无菌室超净工作台上，用0.2%升汞溶液或70%酒精冲洗，进行表面消毒，再用无菌水（通过灭菌处理的清水）冲洗数遍，除去表面药液，打开紫外线灯照射片刻；待种苓表面稍干，用灭过菌的刀具以种苓与培养料（段木）着生部位为中心，纵向切或掰开；用经灭菌的解剖刀或接菌铲挑取长宽各0.40.7 cm，厚0.1 cm一小块白色苓肉，接入试管斜面或培养皿平板母种培养基上。挑取部位为种苓与培养料着生部位对侧，纵轴方向由外向内23 cm处，依次挑取苓肉，进行分离。用同样方法连续接一批试管或培养皿。4.2 母种培养从无菌箱或无菌室内将分离、接种后的试管或培养皿拿出，贴上标签，注明菌种编号、种苓来源、分离接种时间等，然后移入2224恒温箱内培养；分离出的鲜苓块经2 d培养，可看到接种块周围长出白色绒毛状的茯苓菌丝。随着培养时间的延长，可见茯苓菌丝在培养基上伸延，在培养过程中若发现有杂菌污染，要及时剔除。47 d，茯苓菌丝长满培养基表面，即得到一级母种。4.3 母种的提纯复壮与扩大培养将培养好的一级母种置无菌室超净工作台上，用无菌操作法，从菌落边缘（即幼嫩菌丝）挑取长宽各0.40.7 cm左右的菌丝体，移植到另一支母种培养基试管或平板内，于2224恒温箱内培养；培养12 d即可见茯苓菌丝在培养基上呈放射状生长，且较旺盛致密。平板上可见茯苓菌落特有的同心环纹，试管内可见菌丝呈波纹起伏生长。培养7 d左右，大量气生菌丝长满培养基，菌落环纹或波纹消失，并产生特异茯苓香味，即得到二级母种；沿用此种方法，将二级母种先端幼嫩菌丝经转接扩大培养，成为三级母种；茯苓一级母种经12次转管扩大培养，起到提纯和活化作用，培养出的二级、三级母种均可用于扩大生产茯苓原种。5 原种制备 按照“茯苓母种质量标准”选择优质母种，备用。将预先准备的优质母种置接种箱内，用无菌操作法，挑取长、宽各1.4 cm左右的菌块（连同培养基），或用打孔器挖取直径1.2 cm的菌块。迅速接种移入原种培养基瓶内中央孔边，随即塞（盖）严瓶口，贴上标签；将接种后的原种瓶置2224恒温箱或培养室内培养；培养12 d，可见母种菌块上的菌丝恢复生长并逐渐向纵深延伸。7 d左右，待茯苓菌丝伸长至原种瓶2/3时，即可移入常温室内继续培养。培养过程中，必须经常检查，并调整培养温、湿度，若发现菌丝生长异常，要及时分析原因，采取补救措施，若有杂菌污染，坚决剔除。6 栽培菌种制备 按照“茯苓原种质量标准”选择优质原种，备用；将预先准备的优质原种置接种箱内，用无菌操作法，将原种瓶打开，去除原种表面的菌膜及表层培养物。用接种枪或接种匙挖取4g左右略加捣碎的原种块，接种移入栽培种培养基袋口中央，随即原样封口；将接种后的栽培菌袋置2428培养室内培养；培养12 d，即可见原种接种块上的茯苓菌丝恢复生长并向袋内纵深延伸。7 d左右，待茯苓菌丝伸长至培养袋1/3时，即可移入低温室内进行常温培养。培养过程中，必须经常检查，认真记录，发现杂菌污染，及时剔除。7 茯苓菌种分级质量标准7.1 茯苓母种质量标准菌龄710 d；菌丝色白、均匀、致密、粗壮，茯苓特异香气浓郁；菌丝体表面可见晶莹的露滴状分泌物；菌种试管完整无损，棉塞严密，无杂菌污染。7.2 茯苓原种质量标准菌龄1530 d；菌丝生长旺盛，诘白、均匀、致密，爬壁现象明显，可见根状菌索。菌丝体尖端可见乳白色露滴状分泌物，茯苓特异香气浓郁；菌种瓶完整无损，无杂菌污染。7.3 茯苓栽培菌种质量标准菌龄3045 d；菌丝洁白致密，生长均匀，布满菌袋内；菌丝体尖端可见乳白色露滴状分泌物，茯苓特异香味浓郁；菌袋完整无破损，无发黄菌丝，无子实体长出，无杂菌污染。8 茯苓菌种质量标准检验规程 首选检查菌种菌龄，如母种为710 d，原种1530 d，栽培菌种3045 d。检验菌种培养容器，如试管、菌种瓶、菌种培养袋等，必须完整、无破损，棉塞或瓶盖、袋口严密，封闭。菌丝生长旺盛，色洁白、均匀、致密，布满培养容器内，无杂菌污染。菌丝体尖端可见乳白色露