毕业论文--不同香蕉汁浓度对曲茎石斛组培转接苗的影响.doc

不同香蕉汁浓度对曲茎石斛组培转接苗的影响南 阳 理 工 学 院 本科生毕业设计（论文） 学院（系）： 张仲景国医国药学院 专 业： 中药学 学 生： 指导教师： 完成日期 2016 年 5 月南阳理工学院本科生毕业设计（论文）不同香蕉汁浓度对曲茎石斛组培转接苗的影响Effect of different banana juice concentration on tissue cultureof Dendrobium flexicaule transfer seedlings总 计： 15 页表 格： 4 个插 图 ： 幅南 阳 理 工 学 院 本 科 毕 业 设 计（论文）不同香蕉汁浓度对曲茎石斛组培转接苗的影响Effect of different banana juice concentration on tissue culture of Dendrobium flexicaule transfer seedlings学 院（系）： 张仲景国医国药学院 专 业： 中药学 学 生 姓 名： 学 号： 指 导 教 师（职称）： （讲师） 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 2016年5月 南阳理工学院 Nanyang Institute of TechnologyII不同香蕉汁浓度对曲茎石斛组培转接苗的影响中药学专业 摘 要目的：本试验以曲茎石斛分化小苗为材料，研究比较不同浓度香蕉汁配制的培养基对曲茎石斛组培转接苗生长的影响。方法：在无菌的条件下，将曲茎石斛苗置于不同香蕉汁浓度配制的培养基内，观察其株高、根系、苗壮、颜色各指标情况，并对各指标评分，以获得最适香蕉汁浓度。结果：不同香蕉汁浓度对曲茎石斛转接苗的影响不同，其中最适香蕉汁浓度为100g/L。结论：适量香蕉汁对曲茎石斛组培苗的根系生长有促进作用，但浓度过高会起到抑制作用。关键词曲茎石斛；培养基；香蕉汁浓度Effect of different banana juice concentration on tissue culture of Dendrobium flexicaule transfer seedlingsPharmacy MajorWEI Hui-Ran AbstractObjective: In this experiment, the song stems Dendrobium seedlings were used to study the different concentrations of a medium banana juice formulated song to the Dendrobium tissue culture adapter Seedling. Methods: Under sterile conditions, place the song stems Dendrobium seedlings in a medium banana juice of different concentrations, observation of the plant height,the color of the indicators,and the index score,in order to obtain the best concentration of banana juice. Result: Effect of different concentration of banana juice of Dendrobium flexicaule transfer seedlings,and the optimum concentration of 100g/L banana juice.Conclusion: The amount banana juice have promoting effect on Dendrobium flexicaule seedling root growth ,but the concentration is too high will play a role in inhibiting.Keyword：dendrobium flexicaule;culture medium;Banana juice concentration 目 录1 文献综述11.1 曲茎石斛概述11.2 曲茎石斛原植物、药材特征及生长习性11.2.1 原植物形态特征11.2.2 药材特征11.3 曲茎石斛的化学成分11.4 曲茎石斛的药理作用21.5 组培技术在中药育苗上的优势及应用前景21.5.1 组培技术在中药育苗上的优势21.5.2 组培技术在中药育苗上的应用前景21.6 曲茎石斛组培研究进展32 引言33 材料和方法33.1 材料43.2 方法43.2.1 配方43.2.2 配制53.2.3 灭菌53.3 转接63.3.1 转接前准备63.3.2 转接63.4 数据分析64 结果与分析65 结论与讨论8参考文献9致谢10III1 文献综述1.1 曲茎石斛概述曲茎石斛(Dendrobiumflexicaule)为多年生草本兰科石斛属植物，是我国 1986年新发现的石斛属新种 ,在此之前又名金钗（柴），此金钗是伏牛山西峡“金钗石斛”，因其茎与茎直间相互交叉弯曲生长，民间又称为“人字金”、“辫子金”1。主要分布于中国河南(伏牛山中部地区)、四川南部（甘洛）、湖北（神农架地区）。药用植物解：曲茎石斛性寒，味甘，淡，微咸。有滋阴助阳、补心生血、生津止渴、养肝肾之功效4。1.2 曲茎石斛原植物、药材特征及生长习性1.2.1 原植物形态特征曲茎石斛茎圆柱形，稍回折弯曲状，干后呈现淡棕黄色。叶子是长圆状披针形，长在茎的上面的部分，叶的顶部较平不锋利，稍微钩转，叶子下面和叶柄下面的叶基是抱茎的鞘。花序是从落了叶的老茎上部长出，花序梗茎与根交界的部分存在有膜质鞘，花苞片浅白色，花苞片的顶部锐利；花的柄和雌蕊下面膨大的部分是黄绿色带有淡紫色；花张开时，花瓣有两种颜色，淡紫色与黄绿色，椭圆形状，花瓣的顶部不锋利，具5条脉。花瓣唇瓣是淡黄色，上面是淡紫色，中间往下呈现紫色，宽卵形，呈楔形，上面有很多短短的绒毛，不分明3裂；蕊柱是黄绿色；蕊柱中部有2个圆形紫色斑块而且长有上面紫色下面黄绿色的叉状毛，最下面呈紫色、与唇瓣结合而形成关节；药帽乳白色，近似菱形，花期5月7。1.2.2 药材特征茎园条形,呈没有规律可循的曲拐状，并有扭曲成环者，有的拥有龙头和凤尾。外面是黄绿至棕黄色，茎与根交界的部分微有光泽、节上有残留的叶鞘 ,有细纵纹 ；叶鞘鞘口是张开的，与节间留着距离，形成一个稍微膨大的环节，褐色，断面纤维状，气味甘淡微凉，嚼之有粘性，质柔韧，易折断7。1.3 曲茎石斛的化学成分曲茎石斛是以茎入药，它的化学成分主要是石斛碱（dendrobine）及多糖类。石斛碱有解热、降血压、止痛、强壮的作用，多糖可加强机体免疫效应。以及氨基酸、菲类、6-羟基石斛碱（6-hybroxydendrobine）、联苄类、甾体及挥发油、石斛次碱（nobilonine）等成分10。1.4 曲茎石斛的药理作用曲茎石斛在提升人的身体抵抗力方面、压制肿瘤、抗苍老衰弱、添补五脏虚损等方面显著的功效。民间有“救命仙草”之称。活在石壁上，茎入药。性寒，味甘，淡，微咸。可以运用到肠胃疾病、糖尿病、眼科疾病等调治。有益肾气，滋阴润肺，健脾胃，建脑明目，并具生津止渴，抗劳累的效果10。抗衰老，提高免疫力曲茎石斛兰能提高超氧化物歧华酶（SOD）水平，压制犹如单胺氧化酶（MAO），有推迟衰老的作用。最近的几年里引人注意关心重视的石斛兰多糖具备明显的抗辐射、抗衰老等多种效果。活血化瘀，提高心脑血管功能曲茎石斛兰中存在酯类成分，具有消散瘀血、扩张血管、脑血栓形成等作用。由石斛兰、金银花等中药提炼加工得到的的脉络宁注射液，有消散瘀血、清热养阴等功能。抗肿瘤曲茎石斛兰中萃取的菲类和联苄类成分，有抗癌症的作用。可以增进淋巴细胞形成压制因素,起到增加免疫的效果。曲茎石斛的醋酸乙酯提取物对癌细胞具备明显的细胞毒性效果，格外对肺癌细胞具有极大压制作用。 治疗消化系统疾病曲茎石斛对肠管有兴奋作用，能让其紧缩频率增进。从研究结果表明，把石斛煎剂吃下去可以协助消化，鼓动胃液分泌，石斛浸膏能激发小肠平滑肌的紧缩、推动胃肠一点一点的动起来。对慢性萎缩性胃炎能得到特殊效果。治疗眼科疾病石斛兰对眼科疾病具有明显的治疗作用，对白内障即有抑制作用，又有治疗作用。中药“清睛粉”有退翳明目、滋阴散热之功效。“石斛夜光丸”对治疗白内障、青光眼等眼科问题调治有很强的成效。1.5 组培技术在中药育苗上的优势及应用前景1.5.1 组培技术在中药育苗上的优势不受生长季节限制地繁殖中药原植物；培养周期短；可短时间内大批量的培育出所需要的新个体，用于拯救濒危植物；防止病毒的危害，极大的提高了农业生产效率8。1.5.2 组培技术在中药育苗上的应用前景挽救濒临灭绝的中药原植物。通过组织培养技术和现代科技技术让部分濒危的中药原植物得到较为永久性的延续和保存下来；快速繁殖濒危植物或经济价值高的中药原植物。受到季节和自然条件的影响，无法较快的繁殖濒危的中药原植物和较大经济价值的中药原植物，很难短时间内达到一定数量，创造出应有价值的植物。想要有快速、高效的目的，只有通过组织培养技术的方法才能满足这一要求。通过组织培养技术培养中药小苗大大缩短了其育种时间与年限，使其培育过程大大简化性。利用组织培养技术的材料作为植物反应器。中草药是份财富，因市场需求量加大，生长环境遭到破坏和过度采集，很多种中草药资源缺乏，产量缺少，乃至濒临灭绝。假使可以运用组织培养技术的技巧在实验室内生产，不再依赖只能在自然环境的条件才能生长的条件，不仅可以解决这些困难，而且可以通过其技术与人工栽培结合，来满足市场需求、缓解对曲茎石斛资源的压力和提高药用价值9。1.6 曲茎石斛组培研究进展近年来，很多公司实行了规模化生产曲茎石斛组织，这既对曲茎石斛起到了护作用，也对市场需求和曲茎石斛资源的压力的局面有所缓解，促进了医药界等的发展。因为自然和人为的缘故，生态环境的转恶、人们对珍贵中药原植物进行盲目的掠夺采挖、生态系统的失调，中国的野生资源已受到严重威胁快要接近枯竭。而用传统的无性繁殖方法繁殖产量低，没有办法满足大面积栽培种苗需求，因此利用组织培养技术培养育苗成为了当前曲茎石斛人工栽培的主要育苗来源9。2 引言兰科植物(Orchidaceae)有750多个属，药用价值石斛兰约有39种，具有极佳观摩的价值。曲茎石斛是兰科石斛属多年生草本植物，以其茎入药，包括多糖、氨基酸、微量元素和石斛碱等有用的元素10，在抗肿瘤、治疗白内障、降低血糖和提高人体免疫力等方面均有优越治疗效果10。曲茎石斛在自然条件下滋生率低，种子萌发率极低，加之最近过去的几年里自然和人为的缘故，生态环境快速的转恶、人们对珍贵中药原植物进行盲目的掠夺采挖、生态系统的失调等原因，被国家列入重点维护的稀有濒临植物1。于是，利用组织培养技术来提高曲茎石斛兰的生产率，但是组织培养技术需要的成本过高和育苗周期长是妨碍曲茎石斛提高产业化的一大问题8。本文采取不同浓度香蕉汁培养基配方，对曲茎石斛进行培养苗生根的方法进行了研究，香蕉汁对曲茎石斛组培转接苗的根系生长具有显著地促进作用，并且可加快组培转接苗的生长速度，苗粗壮，根系多，可能是香蕉汁里所含有的某种成分恰恰是曲茎石斛苗生长阶段所需要和缺少的。探讨在组织培养快速繁殖过程中不同香蕉汁浓度对其生长发育中的影响，以期待能获得最有利的组织培养短时间繁殖条件，为得到大批优良的组培苗提供必需的原理依据2-5。3 材料和方法3.1 材料实验仪器：烧杯；量筒；玻璃棒；试剂瓶；胶头滴管；酒精灯；温度计；培养瓶；接种镊子；解剖刀；电子天平；电炉；超净工作台；紫外灯；立式高压蒸汽灭菌器；喷壶；打火机；封口膜；培养皿；剪刀；试管刷；引流器；PH试纸；香蕉；榨汁机；实验药剂：蒸馏水；琼脂粉；MS母液（大量元素I、大量元素II、大量元素III、微量元素、有机元素、铁盐元素）；活性炭；95%酒精；70%酒精；高锰酸钾；3.2 方法3.2.1 配方表1 MS培养基的配制母液名称化合物名称原配方量/mg扩大倍数称取量/mg母液体积/ml配1L培养基称取量/ml大量元素母液INH4NO316505082500100020KNO319005095000KH2PO4170508500大IICaCl22H2O4405022000100020大IIIMgSO47H2O3705018500100020微量元素母液MnSO4H2O22.3100111550010ZnSO47H2O8.6100430CoCl26H2O0.0251001.25CuSO45H2O0.02510012.5H3BO36.2100310Na2MO42H2OP0.2510012.5KI0.8310041.5铁盐母液FeSO47H2O28.7100143550010Na2-EDTA37.31001865有机物母液烟酸(Vpp）0.55025100020盐酸吡哆醇（VB6)0.55025盐酸硫胺素(VB1)0.1505肌醇100505000甘氨酸250100根据不同浓度，培养基配方有所差异表2 不同浓度培养基配方不同浓度培养基备注50g/L1/2MS+50g/L香蕉汁+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭+20g/L蔗糖PH=5.8100g/L1/2MS+100g/L香蕉汁+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭20g/L蔗糖150g/L1/2MS+150g/L香蕉汁+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭20g/L蔗糖200g/L1/2MS+200g/L香蕉汁+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭20g/L蔗糖3.2.2 配制（以50g/L浓度的培养基为例）配方：1/2MS+50g/L香蕉汁+3.5g/L琼脂+0.5g/L活性炭+20g/L蔗糖1) 称量750ml的蒸馏水放置到干净的大烧杯中，加热；2) 按照大I、大II、大III、微量、铁盐、有机顺序，量取MS各种母液于1）的大烧杯中；3) 准确称量50g香蕉果肉，在榨汁机中，将其搅成碎状。并用天平称取琼脂、蔗糖和活性炭放在一边备用；4) 不断加热到沸腾，再加入3.5g的琼脂，之后加入20g蔗糖，其间不断搅拌，加入香蕉汁，并加水到1000毫升，最后再加入活性炭，使之加入的所有成分充分溶解；调配至PH至5.8-6。5) 最终把培养基分别装在培养瓶里面。3.2.3 灭菌培养基在制备之后的24小时里结束灭菌步骤。在封闭的蒸锅里，那里面的蒸汽不可以漏出来,压力持续上涨，让水的沸点一直升高,进而锅内热度亦跟着加强。在锅内压力提高时，锅内热度达到121。在这温度下，能够迅速灭杀各种细菌和它们在高温下具有高的抗氧的芽孢。 检查灭菌锅外层锅内水位（水量过少时应加水）、电源、排气阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。同时把接种时用的镊子、剪刀等器具用报纸包好，放在锅内。盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源，关闭排气阀，调节电压至220V加热灭菌。当温度上升到121后，打开排气阀，降温至60时，关闭排气阀。继续加热灭菌。时间到后，打开排气阀，等待气排空，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不能用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。3.3 转接转接时有一个敞口的过程，为了防止引起污染，所以转接前要严格进行消毒。3.3.1 转接前准备1 在转接前，先打开超净工作台的紫外线灯和风机；2 培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（在培养基灭菌时已附带）；3 检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；4 放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列； 3.3.2 转接转接人员最先开始清洗双手,上了工作台之后,使用酒精棉球擦抹双手,尤其是指甲的地方;之后再把工作台面擦抹一遍;首先酒精棉球擦抹接种器材,之后把镊子和剪刀依照顺序过火一回,而后屡次过火顶端的地方,对培养皿需要过火烤至干燥;点燃酒精灯，在打开材料瓶和培养瓶后，其瓶口灼烧5-10s；用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的石斛苗用于转接；用镊子将材料转接于新的培养基中，在转接期间要不间断地烤镊子；标注相关日期和品系，转至培养柜培养。3.4 数据分析培养90d后，对曲茎石斛组培苗长势进行分析。对苗的株高、根系、苗壮、颜色进行赋值，每个指标满分10，然后依据指标的重要性赋予一定的权重（株高30%、根系30%、苗壮20%、颜色20%）最后根据比较各个不同浓度所得的总分，得出最优的。采取邓肯氏新复极差测验法测验不同浓度的差异显著性，数据统计运用DPS软件进行分析。4 结果与分析根苗高苗壮颜色总分评分得分评分得分评分得分评分得分50g/L5.901.766.601.968.631.737.801.577.02100g/L6.101.847.102.149.071.818.701.747.53150g/L6.902.066.101.828.431.696.701.356.91200g/L6.101.846.401.928.131.636.101.216.60表3 不同香蕉汁浓度处理下对曲茎石斛组培苗的壮苗生根的评价由表3可以看出，各个根和苗高方面差异不大，根方面，加入150g/L香蕉汁浓度根发育最好，100g/L和200g/L香蕉汁浓度根发育次之；苗高方面，在加入100g/L香蕉汁浓度苗较高；苗壮方面，加入100g/L香蕉汁浓度苗最壮，50g/L与150g/L香蕉汁浓度差异不大，200g/L香蕉汁浓度苗最矮；颜色方面，加入100g/L香蕉汁浓度时颜色浓绿，200g/L香蕉汁浓度时颜色最差。综合可看出，加入100g/L香蕉汁浓度是最好的，此时曲茎石斛组培苗根多，苗高，粗壮，颜色较浓绿。 表4 不同香蕉汁浓度处理下曲茎石斛组培苗的生长情况浓度处理苗高(cm)茎粗(mm)根长(cm)根数(条）叶数(片）分蘖数（个）鲜重（g)干重(g）50g/L3.082.634.633.264.211.430.2340.020100g/L3.283.554.774.175.001.500.3400.033150g/L2.503.985.805.674.672.000.3630.039200g/L2.323.195.516.754.52.000.3080.042从表4可以看出，曲茎石斛组培苗在不同香蕉浓度下的生长，苗高方面，100g浓度下的苗较高；50g浓度次之，200g浓度的苗较矮。不同浓度下呈现出随着香蕉汁浓度的增多，苗高降低的趋势。茎粗方面，100g浓度和150g浓度的组培苗茎相对来说比较粗大健壮，50g浓度的苗茎最细。不同浓度下均呈现出随着香蕉汁浓度的增多，组培苗茎增粗的趋势。根的生长方面，150g与200g浓度的组培苗根最长，100g浓度是次之，50g浓度的苗根最短。不同浓度下苗的根长呈现出随着香蕉汁浓度的增多，组培苗的根增长。根数方面，在200g与150g浓度最多，100g浓度下根数次之，50g浓度下根数较少。不同浓度下组培苗根的数目显示出跟着香蕉汁浓度的增多，根的数目加多的趋向。每株苗的叶片数量方面，100g浓度的组培苗叶片数量最多，150g浓度次之，50g浓度苗的叶片数较少。不同浓度下组培苗的叶片数量呈现出随着香蕉汁浓度的增多，叶片数量减少的趋势。苗的分蘖方面，50g浓度的组培苗基本没有分蘖，100g浓度组培苗的分蘖数较少，200g浓度与150g浓度下的组培苗都存在分蘖现象。苗的重量方面，150g浓度的组培苗鲜重最大，100g浓度次之，50g浓度组培苗的鲜重较小。不同浓度组培苗的鲜重呈现出随着香蕉汁浓度的增多，鲜重增多的趋势。不同浓度下组培苗干重的情况与鲜重基本一致。结合表3和表4可以得出，在加入100g/L香蕉汁浓度时，曲茎石斛组培苗根多，苗高，粗壮，颜色较浓绿，叶多。5 结论与讨论香蕉成分包括充裕的维生素和矿物质，如蛋白质、碳水矿物质、钙、可溶性糖等，香蕉汁对曲茎石斛组培转接苗的根系生长具有显著地促进作用，并且可加快组培转接苗的生长速度，苗粗壮，根系多，可能是香蕉汁里所含有的某种成分恰恰是曲茎石斛苗生长阶段所需要和缺少的。从研究的结果可以得出：只要香蕉汁浓度恰当，对曲茎石斛苗有促进作用。反之，香蕉汁添加过多，所含可溶性糖糖分过高，提升了培养基的浸透势，或许能起到约束其生长的作用。所以，当1/2MS培养基中加入100g/L香蕉汁浓度时是最好的，此时曲茎石斛组培苗根多，苗高，粗壮，颜色较浓绿。本研究只考察了不同香蕉汁浓度对曲茎石斛组培转接苗的影响，其他因素对曲茎石斛组培转接苗的影响需要进一步研究。第 15 页参考文献1 武荣花，栗燕.石斛资源保护研究进展A.河南农业科学，2009,12（5）：9-12、17.2 杨联河，李根林.曲茎石斛快速繁殖研究J.中国中药杂志，2002，27（6）：460.3 赵天榜，陈志秀，陈占宽，易明林，郅玉宝.石斛组织培养与栽培技术的研究J.河南农业大学学报，1994，28（6）：128-133.4 杨联河，王倩嵘，石拓，何俊彦，胡洁荃.曲茎石斛组织培养研究.