毕业论文--光照对番红花侧芽愈伤组织的影响.doc

南 阳 理 工 学 院 本科生毕业设计（论文） 学院（系）：张仲景国医国药学院 专 业： 中药学 学 生： 指导教师： 完成日期 年 月 南阳理工学院本科生毕业设计（论文）光照对番红花侧芽愈伤组织的影响Comparison of the Anti-inflammatory Effect of the cultivated and the wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun 总计： 毕业设计（论文）11页表 格： 2 个插 图： 0 幅蕲春人工种植艾叶与蕲春野生艾叶的抗炎作用比较 南 阳 理 工 学 院 本 科 毕 业 设 计（论文） 光照对番红花侧芽愈伤组织的影响Comparison of the Anti-inflammatory Effect of the cultivated and the wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun 学 院（系）： 张仲景国医国药学院 专 业： 中药学 学 生 姓 名： 学 号： 指 导 教 师（职称）： （讲师） 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 南阳理工学院 Nanyang Institute of TechnologyI蕲春人工种植艾叶与蕲春野生艾叶的抗炎作用比较光照对番红花侧芽愈伤组织的影响中药学专业 摘 要目的：比较光照对番红花侧芽愈伤组织的影响的强弱。方法：采用对照法在不同的光暗条件下诱导番红花侧芽愈伤组织，来观察光暗条件对番红花愈伤组织的影响强弱。结果：番红花的侧芽愈伤组织在光照和黑暗条件下均成功诱导。番红花侧芽愈伤组织在黑暗条件下诱导成功率高，有显著的差异。结论：番红花侧芽愈伤组织诱导在光暗条件下的诱导成功率不同，番红花侧芽愈伤组织在黑暗条件下的诱导率高于光照条件下的。 关键词 番红花；组织培养；愈伤组织；Comparison of the Anti-inflammatory Effect of the cultivated and the wild Folium Artemisiae Argyi from QichunChinese Pharmacy Major Liu Ya-lanAbstract: Objective: To investigate the anti-inflammatory effect of the cultivated Folium Artemisiae Argyi and the wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun. Method: To compare the effectiveness of using cultivated and wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun in the treatment of inflammation in mices ears (induced by xylene) and toes (induced by ovi albumin). Result: Both the cultivated and wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun are effective in suppressing swelling in mices ears and toes. The anti-inflammatory effect of the cultivated Folium Artemisiae Argyi from Qichun dose-group was better than the wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun. Conclusion: The aqueous extract from the cultivated and wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun both have the anti-inflammatory effect. The anti-inflammatory effect between cultivated Folium Artemisiae Argyi from Qichun and wild Folium Artemisiae Argyi from Qichun has no obvious difference.Key words: Qichun; Folium Artemisiae Argyi; cultivated; wild; anti-inflammatory .II目 录1 引言11.1 概述11.2 番红花的性状11.3 番红花的药材性状11.4 番红花的主要化学成分21.5 番红花的药理作用21.5.1 对肿瘤的抑制作用21.5.2 对炎症和镇痛的作用31.5.3 对肝脏的作用31.6 研究目的及意义32 材料与方法42.1 实验材料42.2 方法42.2.1 配方52.1.2 配制52.1.3 灭菌62.3 接种62.3.1番红花外植体的选择和前处理62.3.2 接种前准备62.3.3 接种62.4 统计学分析73 结果74 讨论与结论8参考文献10致谢11III1 引言番红花（学名：Crocus sativus L.）又称藏红花、西红花，是一种鸢尾科番红花属的多年生花卉，也是一种常见的香料。多年生草本。球茎扁圆球形，直径约3厘米，外有黄褐色的膜质包被。本草纲目上“时珍曰番红花，出西番回回地面及天方国，即彼地红蓝花也。元时，以入食馔用。1”原产欧洲南部，我国各地常见栽培。花柱及柱头供药用，即藏红花。味辛、性温，有活血、化瘀、生新、镇痛、健胃、通经之效2。西红花还具有增强免疫、利胆保肝、收缩子宫抑制肿瘤甚至对某些癌症也有抑制作用3。另外番红花还具有很大的观赏价值。由此可见番红花的价值十分高，但由于自然条件下的番红花繁殖困难以及栽培时易出现退化现象，且干燥的藏红花图片十月下旬开花，颜色从淡紫色到深紫带有条纹的苯胺紫。因为藏红花的花期只有15到20天，日照会使摘下的花蕊发蔫，颜色变浅，质量下降，所以要在日出前集体抢收。娇贵的藏红花从采收、烘干到筛选等步骤全部以手工完成，导致番红花的资源严重缺乏。近年来随着人工培养番红花的浪潮的袭来，为提高番红花测压愈伤组织诱导的成功率进行研究，为其资源的扩大提供相关的技术资料。1.2 番红花的性状 番红花是多年生草本植物，地下鳞茎呈球状，直径约3厘米，外有黄褐色的膜质包被。叶基生，9-15枚，自鳞茎生出，灰绿色，长15-20 厘米，宽2-3毫米，边缘反卷；叶丛基部包有4-5片膜质的鞘状叶。花顶生，花茎甚短，不伸出地面；花1-2朵，淡蓝色、红紫色或白色，有香味，直径2.5-3厘米；花被裂片6，2轮排列，内、外轮花被裂片皆为倒卵形，顶端钝，长4-5厘米；雄蕊直立，长2.5厘米，花药黄色，顶端尖，略弯曲；花柱橙红色，长约4厘米，上部3分枝，分枝弯曲而下垂，柱头略扁，顶端楔形，有浅齿，较雄蕊长，子房狭纺锤形。花期11月上旬至中旬。蒴果椭圆形，长约3厘米1。1.3 番红花的药材性状 弯曲的细丝状，暗红色，顶端较宽，向下间弯曲的细丝状，暗红色，顶端较宽，向下渐细似喇叭状，下端为残留的黄色花柱，顶端边缘显不整齐齿状，体轻，质松软，干燥后质脆易断。将柱头投入水中则膨胀，并散出色素，水染成黄色。气特异，味微苦。1.4 番红花主要的化学成分 由于入药部位是花柱从花柱里分离所得的化学成分有类胡萝卜素及苷类、脂溶性色素、挥发油类共轭多烯及其苷类、黄酮类、蒽醌化合物等11。1.4.1 类胡萝卜素及苷类 藏红花酸与糖形成的一系列酯类化合物，包括了藏红花素（-藏红花素、-藏红花素、-藏红花素等）以及顺式藏红花苷酯类化合物。1.4.2 挥发油 是由其中的胡萝卜素降解而成的有60多种11。1.4.3 脂溶性色素 含-胡萝卜素、-胡萝卜素、八氢番茄烃番茄烯、玉米黄质、六氢番茄烃等。1.4.4 黄酮类 宋纯清等人从番红花的花被中分离得到山奈素I、紫云英苷II、槲皮素-3-对香豆 酰葡萄糖苷III、山奈素-3-葡萄糖-6-己酰葡萄糖苷IV、山奈素-3-葡萄糖-葡萄糖苷V、槲皮素、翠雀素、翠雀素-3,5-二葡萄糖苷和3-加急花翠素等众多二十九烷和黄酮类化合物16-17。1.4.5 蒽醌化合物 从番红花侧芽的部位分离得到：大黄素、二氢大黄素、1-甲基-3-甲氧基-6,8-二羟基蒽醌-2-羧基、1-甲基-3-8-羟基蒽醌-2羧酸18。1.4.6 其它 藏红花还含有挥发油前体、类黄酮、树脂及大量氨基酸等。1.5 西红花的药理作用 西红花具有活血化瘀、归精新肝、调和气血、安神开窍等功效。还能抑制肿瘤、抗炎镇痛、保护肝脏等作用。现代医学研究表明，番红花提取物能预防动脉粥样硬化和治疗心脑血管疾病，还有抗菌、抗焦虑、抗应激等作用。1.5.1 对肿瘤的抑制作用 冀慧宝，吴绮思等人通过研究发现西红花能明显抑制人膀胱肿瘤细胞的生长。其机理可能是其成分具有破坏肿瘤细胞的DNA、RNA有关12。临床药理表明西红花苷对多种肿瘤细胞有治疗效果其有效成分对肿瘤细胞具有选择性，而且西红花苷类能减少肿瘤数和抑制肿瘤初阶段，增加正常细胞的生长，影响细胞酶的分裂所以西红花对肝癌、子宫癌等癌症具有一定的治疗效果15.1.5.2 对炎症和镇痛的作用 西红花总苷在小鼠试验中能明显抑制二甲苯引起的小鼠急性耳廓肿胀、减轻致炎物质醋酸诱发的疼痛反应，醋酸导致的小鼠腹腔毛细血管通透性增高及蛋清，这表明西红花苷对炎症早期的毛细血管通透性增高和水肿及炎症引起的疼痛有抑制作用，具有一定的镇痛效果13。1.5.3 对肝脏的作用 实验表明西红花通过改善微循环促进胆汁的分泌和排泄，从而降低异常增高的球蛋白和总胆红素；对有毒物质引起的早期急性肝损伤有预防作用，其可提高细胞中谷胱甘肽的浓度和增强谷胱甘肽S-转肽酶和谷胱甘肽氧化酶的活性，作为一种植物药，藏红花的副作用小，疗效可靠是不可多得的好药材14。1.6 研究目的及意义 由于西红花(西红花是番红花的药材名)是我国十分珍贵的药材，在自然条件下不能进行有性生殖只能以球茎进行无性繁殖。近年来很多人尝试扩大番红花的资源种植，但其苛刻的生存条件和缺乏相关的技术指导而很少人能成功。何美莲，陈家宽等人指出现今发现的西红花的化学成分有水溶性色素、脂溶性色素（如：玉米黄素、八氢蕃茄烃等。）、挥发油类等。在花被中的成分山奈素、紫云英苷等。以及在侧芽中的大黄素2-烃基大黄素等4 。西红花具有活血化瘀，凉血解毒，解郁安神的功效。其主要化学成分有西红花苷、西红花苦苷、西红花酸等。朱昱等人研究发现西红花侧芽醇提取物具有抗炎活性5。现代研究表明西红花酸能抑制大鼠心肌肥厚以及能够促进兔的胆汁增加6。另外西红花还具有抗癌作用以及抗肿瘤的作用等，是药理作用广泛、低毒性的不可多得的药材4。丁向东通过研究证明番红花大球茎栽种期在10月底到11月中旬适合7。经研究番红花的留芽数与番红花的球茎产量及单球重有关8。番红花组织培养可改变的外界因素有温度、PH值、光照等，光照可以分为有光照和无光照。番红花材料在不同的光照条件下的愈伤组织的诱导率和颜色、继代生长情况差异较大9。pp培养基可以有效的防止番红花愈伤组织的褐化10。本课题主要对番红花的组织培养进行研究，为番红花的种殖提供相关的资料；对光照对番红花侧芽诱导愈伤组织的研究，观察番红花在不同浓度光暗条件下的生长情况，可以为扩大番红花资源种植提供基础资料，提高西红花质量和产量有重要意义。2.1 实验材料 实验仪器：烧杯；量筒；玻璃棒；酒精灯；移液管；培养瓶；接种镊子；解剖刀；电炉；胶头滴管；立式高压蒸汽灭菌器；电子天平；紫外灯；喷壶；卫生棉；打火机；石腊膜；超净工作台；培养瓶；剪刀；试管刷；试剂瓶；引流器；PH试纸； 实验药剂：蒸馏水；琼脂粉；蔗糖；MS母液（大量元素I、大量元素II、大量元素III、微量元素、有机元素、铁盐元素）；活性炭；95%酒精；70%酒精；2.2方法2.2.1 配方表1 MS培养基的配制母液名称化合物名称原配方量/mg扩大倍数称取量/mg母液体积/ml配1L培养基称取量/ml大量元素母液INH4NO316505082500100020KNO319005095000KH2PO4170508500大IICaCl22H2O4405022000100020大IIIMgSO47H2O3705018500100020微量元素母液MnSO4H2O22.3100111550010ZnSO47H2O8.6100430CoCl26H2O0.0251001.25CuSO45H2O0.02510012.5H3BO36.2100310Na2MO42H2OP0.2510012.5KI0.8310041.5铁盐母液FeSO47H2O28.7100143550010Na2-EDTA37.31001865有机物母液烟酸(Vpp）0.55025100020盐酸吡哆醇（VB6)0.55025盐酸硫胺素(VB1)0.1505肌醇100505000甘氨酸250100愈伤组织诱导培养基分别为：（1）MS+NAA 5mg/L + 6-BA 5mg/L-P（2）MS+2,4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L-Q（3）MS+6-BA 5mg/L + 2,4-D 1mg/L-R（4）MS + KT 5mg/L + IAA 4mg/L-T (5) MS+6-BA 0.5mg/L + 2,4-D 2mg/L-A 以上所有培养基均添加琼脂0.7%，蔗糖添加2%，pH 5.8，培养温度20+2，光照条件和黑暗条件分别培养。黑暗培养：5个浓度*8瓶*5个外植体光照培养：5个浓度*8瓶*5个外植体2.2.2配制1)称量750ml的蒸馏水放置到干净的大烧杯中，加热；2)依次加入大I、大II、大III、微量、铁盐、有机，量取MS各种母液于1）的大烧杯中；3)用天平称取琼脂、蔗糖和活性炭放在一边备用；4)不断加热到沸腾，再加入7g的琼脂，之后加入20g蔗糖，其间不断搅拌，加水到1000毫升，最后再加入催化剂，使之加入的所有成分充分溶解；调配PH至5.8-6。5)最终把培养基分别装在培养瓶里面。2.2.3灭菌将装好培养基的培养瓶放凉后装入封闭的蒸锅内开始进行灭菌，另再把实验需要的镊子、解剖刀、无菌水及无菌纸一起放入其中进行消毒。蒸锅内的高压及120摄氏度的高温能有效的杀灭实验用具上的细菌及芽孢。1. 在将培养瓶放入蒸锅之前必须检查蒸锅的水位、排气阀是否关闭，如果水位是低水位必须加水。2. 将实验所需的要用到的工具及水与加入了培养基的培养瓶一起放入蒸锅中，盖上盖并旋紧。设置加热温度及时间进行加热灭菌。3. 在温度显示为104摄氏度时打开排气阀，放出其中的气体，知道温度降到100摄氏度以下时关闭排气阀继续加热直至灭菌结束。4. 灭菌结束打开排气阀取出培养瓶，应注意取出培养瓶时不要倾斜和摇晃(加热结束后瓶中的培养基处于液态的状态，轻微的震摇可能会导致培养基溅到瓶壁上。)2.5接种2.5.1番红花外植体的选择和前处理试验品种是由南阳理工学院提供的无病虫害的番红花，讲番红花上生长出来的幼嫩侧芽剪下，用纱布包着放在水龙头下冲洗过夜。2.5.2 接种前准备接种时有一个敞口的过程，为了防止引起污染，所以接种前要严格进行消毒。接种前准备在接种前，先打开超净工作台的紫外线灯和风机；培养瓶、镊子、剪刀等接种用具的灭菌（在培养基灭菌时已附带）；检查超净台内各种用具，准备好消毒用的酒精棉，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；放置待接种材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列； 2.5.3 接种接种人员最先开始清洗双手,上了工作台之后,使用酒精棉球擦抹双手,尤其是指甲的地方;之后再把工作台面擦抹一遍;首先酒精棉球擦抹接种器材,之后把镊子和剪刀依照顺序过火一回,而后屡次过火顶端的地方,对培养皿需要过火烤至干燥;点燃酒精灯，打开材料瓶和培养瓶，将需要接种的嫩芽先用70%的乙醇消毒30s，放入0.1%的升汞里8 min后，取出去芽鞘后再放入0.1%的升汞里3 min后，取出用无菌水漂洗4次用无菌滤纸吸干水分用手术到切成0.5cm的段并在每段上斜着切几条伤口。接种前需要灼烧7-12s培养瓶口，将准备好的材料接入培养瓶。（接种时材料和培养瓶不能离开酒精灯火焰10cm以内的范围）接种时要时常重新对接种所要用到的镊子和解剖刀进行消毒。（不能一直用到接种结束都不消毒，这样会增大培养基感染机率。）接种结束用石蜡膜进行封口标注日期和分组，根据实验需要将需要分开培养的培养基分开培养。2.4 统计学分析2.4.1不同激素及浓度下侧芽的萌动数侧芽接种于不同激素及浓度下，10天左右，有的侧芽的周围明显可见淡黄色或者半透明的愈伤组织，这个时期称萌动期，各个培养基萌动数如下表激素浓度接种数萌动数P4029Q4026R4028T4020A40182.4.2不同激素及浓度下侧芽的膨大数侧芽接种于不同激素及浓度下，20天左右，有的侧芽已经稍微膨大了，这时说明愈伤组织已经开始生长，这个时期为生长期，各个培养基膨大数如下表激素浓度接种数膨大数P4017Q4015R4012T4014A40152.4.3 不同激素和浓度下侧芽的诱导率接种一个月后，统计在不同培养基中侧芽愈伤组织的诱导率（诱导率=愈伤组织数/外植体总数100%），情况如下表激素浓度黑暗培养光照培养接种数出愈数诱导率%接种数出愈数诱导率%P401742.5401127.5Q401537.5401435R401230401025T40143540820A401537.5408202.4.4不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的质地愈伤组织比较蓬松的容易形成棉花状愈伤组织，无法继续培养，各个培养基的质地如下： 黑暗激素浓度接种数出愈数质地疏松致密P4017215Q4015114R4012012T4014014A4015312光照激素浓度接种数出愈数质地疏松致密P401183Q401468R401028T40844A408352.5.5 不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的颜色西红花侧芽愈伤组织容易褐化或者部分褐化，通过观察侧芽愈伤组织的颜色可以判断愈伤组织的褐化程度，情况如表：黑暗激素浓度接种数出愈数颜色褐色黄色白色P40171133Q40150132R40121101T40141112A40152130光照激素浓度接种数出愈数颜色褐色黄色白色P4011470Q40144100R4010640T408260A4083502.5.6不同激素和浓度下侧芽愈伤组织的生长量西红花侧芽愈伤组织在不同培养基中生长量不同，表如下黑暗激素浓度接种数出愈数生长量大生长量小P4017107Q4015114R401284T4014122A401596光照激素浓度接种数出愈数生长量大生长量小P401192Q401486R401037T40844A408263 结果 光照条件对侧芽愈伤组织诱导的影响：选用MS+NAA 5mg/L + 6-BA 5mg/L、MS+2,4-D 2mg/L + KT 0.5mg/L、MS+6-BA 5mg/L + 2,4-D 1mg/L、MS + KT 5mg/L + IAA 4mg/L、MS+6-BA 0.5mg/L + 2,4-D2mg/L这5种培养基，考察不同光照条件对侧芽愈伤组织诱导的影响（如上表），外植体个数为40。在培养30d后暗培养的愈伤组织颜色大部分呈黄色且膨大，而光培养下的愈伤组织大多颜色呈褐色（即很多愈伤组织已经褐化）。结果表明在5种不同的培养基里，愈伤组织诱导率存在差异（P0.05）,且愈伤组织的颜色、大小、质地差异较大，可以清楚的看出番红花侧芽愈伤组织在黑暗条件下要更容易诱导，且诱导出的愈伤组织生长旺盛。另外经过统计光培养下的侧芽培养基一共感染了10瓶，而暗培养下的侧芽培养基感染了3瓶，其中暗培养的受到感染的一共有15株，光培养受到感染的一共由43株4 讨论与结论4.1 暗培养对侧芽愈伤组织的影响：实验通过5种不同的培养基的光照对照进行实验得出侧芽在暗培养的情况下诱导出的愈伤组织颜色、生长量、质地均比在光培养下诱导出的愈伤组织要好。进行光照条件下愈伤组织生长缓慢，且褐化严重。暗培养诱导速度较快，不易褐化。说明黑暗条件下更有利于侧芽愈伤组织的形成。由此可以看出对于愈伤组织的形成而言，光照不是必需的。4.2 暗培养对球茎愈伤组织的影响：本次实验除了做了侧芽的培养外还做了一部分球茎的光暗对照实验但实验数据较少不易进行比较，经观察暗培养下的培养基里的球茎愈伤组织普遍比光培养下的生长的快，有的甚至已经长出了芽。从这这些明显的现象来判断在黑暗条件对球茎愈伤组织的诱导更好，暗培养更能够促进球茎愈伤组织的生长。4.3 活性炭对愈伤组织的影响：本实验也做了活性炭的对照，有活性炭加入的培养基诱导出的愈伤组织比没有活性炭的培养基里诱导出的愈伤组织更大，颜色更鲜艳，且有活性炭的培养基里诱导的愈伤组织出现褐化现象的瓶数较没加入活性炭的培养基要少。参考文献1裴鉴、丁志遵，中国植物志.科学出版社1985,16（1）：122.2李时珍，本草纲目（卷15）M.北京：人民卫生出版社，1982.3刘招光，红花之药理学研究J中华医学杂志，1935，（79）：727,983,985,911.4何美莲，陈家宽，周铜水何美莲，陈家宽，周铜水等.番红花化学成分及生物活性研究进展J.中草药,2006, 37(3):466-470.5 朱昱,韩婷, 等. 番红花不同药用部位的镇痛和抗炎活性比较研究J.药学实践杂志, 2008, 26（4）:269 -271.6范国平.番红花酸药理作用研究进展J.世界最新医学信息文摘（电子版）,2014, 14