（化学工艺专业论文）脂肪酶candida+antarctic+b催化合成碳酸甘油酯的研究.pdf

摘要 本文研究了脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 在四氢呋哺中催化甘油和碳酸二甲酯的转 酯反应，以单因素实验分析反应条件对此反应的影响，并初步讨论其反应进程。同时尝 试定向合成本反应的各种产物。 实验结果初步表明，反应有可能生成了4 种碳酸甘油酯，分别是：1 碳酸甘油甲酯 ( 单酯) ；4 羟甲基2 羰基1 ，3 二氧戊环( 环二酯) ：2 羰基1 ，3 一二氧戊环4 碳酸二甲酯、2 羰基1 ，3 二氧六环5 碳酸甲酯( 环三酯) ；而上述三种产物最终都有向环二酯转化的趋势。 以甘油转化率为标的，最佳反应条件为：初始加水量为甘油质量的8 ，6 0o c ，玎( 甘 油) ：辫( 碳酸二甲酯) - 1 ：l ，加酶量为3 8 8 9u g 碳酸二甲酯，o 0 5g 甘油m l 四氢呋喃，p h 7 时，反应2 3h 后甘油的转化率达4 5 。 通过控制反应进程定向合成单酯。在加水量8 、5 5o c 、1 2 9 6u g 碳酸二甲酯、刀( 甘 油) ：以( 碳酸二甲酯) = 1 ：3 、0 0 5g 甘油m l 四氢呋喃、p h 7 的条件下，反应2h 后单酯的 产率达到了6 3 选择性达7 5 。 强极性溶剂如d m s o 、d m f 可令c a l b 在反应条件下失活；丙酮易与底物甘油发 生缩合反应；中等极性溶剂四氢呋喃是本反应的理想溶剂。以石油醚为溶剂时环二酯的 产率达到8 0 ，选择性大于9 7 。 控制反应进程停留在生成环三酯阶段同样是定向合成环三酯的关键。在加水量8 、 6 0o c 、3 8 9u g 碳酸二甲酯、刀( 甘油) ：”( 碳酸二甲酯) = l ：1 0 、0 0 5g 甘油m l 四氢呋喃、 p h 7 的条件下反应2 3h 后环三酯的产率达5 2 ，选择性达5 9 。 关键词：脂肪酶；催化；合成；碳酸甘油酯：甘油；碳酸二甲酯 a b s t r a c t a b s t r a c t i n t h i ss t u d y , s y n t h e s i so fg l y c e r o lc a r b o n a t ef r o mg l y c e r o la n dd i m e t h y lc a r b o n a t ei n t h fc a t a l y z e db yc a n d i d aa n t a r c t i cl i p a s eb ( c a l b ) w a ss t u d i e d m e a n w h i l e ，m u c h a t t e n t i o nh a sb e e np a i dt og e td i f f e r e n tg l y c e r o lc a r b o n a t e s f o u rp r o d u c t sw e r ed e t e c t e df r o mt h er e a c t i o nm i x t u r e ，i e 1 - c a r b o n a t eg l y c e r o l e s t e r ( m o n o g l y c e r i d e ) ，4 - h y d r o x y m e t h y l 一2 - o x o 1 ，3 一d i o x o l a n e ( d i g l y c e r i d e ) ，4 - ( m e t h o y c a r b o n y l o x y m e t h y l ) - 1 ，3 - d i o x o l a n 一2 一o n ea n d2 - o x o - 1 ，3 一d i o x o l a n e 5 一m e t h y lc a r b o n a t e ( t r i g l y c e r i d e ) ， w h i l et h ed i g l y c e r i d ei st h eo n l yf i n a lp r o d u c tr e p o r t e di nl i t e r a t u r e a m o n gt h ef o u rp r o d u c t s ， t h em o n o g l y c e f i d e ，4 - ( m e t h o y c a r b o n y l o x ym e t h y l ) 一1 ，3 - d i o x o l a n - 2 一o n ea n di t si s o m e rw e r e c o n v e r t e dt ot h ed i g l y c e r i d e sg r a d u a l l ya n dp a r t i a l l y , w h i c hw a sn o to b s e r v e du n d e rs a m e r e a c t i o nc o n d i t i o n si nl i t e r a t u r e f o rt h ec o n v e r s i o no fg l y c e r o l ，、】 r i t l la ni n i t i a lw a t e rc o n t e n to f8 ，m o l a rr a t i oo f g l y c e r o lt od i m e t h y lc a r b o n a t eo f1 ：1 ，6 0o c ，l i p a s el o a d i n go f3 8 8 9w gd i m e t h y lc a r b o n a t e ， o 0 5gg l y c e r o l m lt h f ，t h eh i g h e s tg l y c e r o lc o n v e r s i o nr e a c h e d4 5 a tp h 7i n23 h t oo b t a i nt h em o n o g l y c e r i d ea st h em a i np r o d u c t ，、i t l la l li n i t i a lw a t e rc o n t e n to f8 ， m o l a rr a t i oo fg l y c e r o lt od i m e t h y lc a r b o n a t eo f1 ：3 ，5 5o c ，l i p a s el o a d i n go f12 9 6u g d i m e t h y lc a r b o n a t e ，o 0 5gg l y c e r o l m lt h f ，ay i e l do f m o n o g l y c e r i d eo f 6 3 w a sa c h i e v e d a tp h 7i n2h t h eh i g hp o l a r i t ys o l v e n ts u c ha sd m fa n dd m s oc a nd e a c t i v a t ec a l bu n d e rt h e r e a c t i o nc o n d i t i o n s ；a c e t o n ec a nn o tm a k eag o o dc o n v e r s i o no fg l y c e r o le i t h e r h o w e v e r , 唧w a sf o u n das u i t a b l es o l v e n tt ot h i sr e a c t i o n t h ey i e l do fd i g l y c e r i d ei s8 0 a n dt h e s e l e c t i v i t yo fd i g l y c e r i d eo v e r9 6 n e a r l yw h e np e t r o l e u me t h e rw a su s e da st h es o l v e n t a i m i n ga tt oa c h i e v em o r et r i g l y c e r i d e s ，埘t l la l li n i t i a lw a t e rc o n t e n to f8 ，m o l a rr a t i o o fg l y c e r o lt od i m e t h y lc a r b o n a t eo f1 ：10 ，6 0o c ，l i p a s el o a d i n go f38 9u gd i m e t h y l c a r b o n a t e ，o 0 5gg l y c e r o l m lt h f ，t h eh i g h e s ty i e l do fl a i g l y c e r i d eo f5 2 w a sa c h i e v e da t p h 7 i n2 3h k e y w o r d s ：l i p a s e ；c a t a l y z e ；s y n t h e s i s ；g l y c e r o lc a r b o n a t e ；g l y c e r o l ；d i m e t h y lc a r b o n a t e i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：嬲 日 期：生旦， ：! 生 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 觯 导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 碳酸甘油酯是一种重要的有机合成中间体，同时也可作溶剂使用。碳酸甘油酯的合 成方法较多。在化学法合成中，根据合成途径的不同，可分为直接合成法，酯交换法， 甘油羰基化法和手性合成法等。酶法合成即以脂肪酶作为催化剂催化合成碳酸甘油酯。 以下将分别介绍这两大类方法在合成碳酸甘油酯方面的应用。 1 2 碳酸甘油酯的合成 1 2 1 化学法合成 根据合成途径的不同，化学法合成碳酸甘油酯又可分为以下四种方法：直接合成法， 酯交换法，甘油羰基化法及手性合成法。 1 2 1 1 直接合成法 甘油在超临界二氧化碳的条件下可直接反应生成碳酸甘油酯。在p u r o s i v 沸石催化 下产率最高，可达3 2 1 5 1 1 1 。 e 至一c a t a l y s t 吱, o h 厶侧叫 ( 方程式1 - 1 ) 此反应亦可在各种有机锡催化剂催化下完成。m i c h e l e 等【2 1 分别用n b u 2 s n ( o m e ) 2 、 睁6 一0 ，o h + 3 ： 哪舢2 ， 江南大学硕士学位论文 甘油和光气( c o c l 2 ) 在室温下反应生成碳酸甘油酯【6 】，在嘧啶环境中反应3h ，光气 的转化率达8 3 ，相同时间内在m e 3 c o k 中转化率达8 5 。 甘油在1 1 0o c 下与含有8 0 ( v v ) c o 和2 0 ( v v ) 0 2 的混合气体反应，以c u c l 为催 化剂可直接羰化合成碳酸甘油酯，甘油的转化率为4 7 1 7 j 。 1 2 1 4 手性合成法 先将外消旋的酒石酸盐乙酰化，然后将醋酸盐产物醇解得到外消旋的碳酸甘油酯峭j 。 外消旋的碳酸甘油酯是一种合成子，与具有光学活性的碳酸甘油酯相比，其利用率较低。 而具有光学活性的碳酸甘油酯利用率较高，应用较广泛。它可在酰化试剂醋酸乙烯酯或 月桂酸酯存在下在戊醇中合成，同时也可在溶剂四氢呋喃、二异丙醚或氯仿中合成。 1 2 1 5 其它方法 n u e c h t e r 等1 9 】在离子液体中，以二氧化碳和环氧乙烷为反应物，在微波辅助条件下 反应合成了碳酸甘油酯，当反应温度为6 0o c ，压力为5 0b a r 时，反应1h 后产率达到 4 7 ；k o s s e v 等【1 0 l 报道了在相转移催化条件下用碱金属卤化物催化表氯醇和碳酸氢钠合 成碳酸甘油酯，7 0 0 c 下反应1 5h 后产率达到了7 0 ；过渡金属络合物如p d c l 2 ( m e c n ) 2 和c u c l 2 催化烯基醚酯醇解生成碳酸甘油酯】，其催化活性高于一般生物催化剂的催化 活性，4 0o c 下反应2h 后产率可达9 9 ；甘油和卢酮酯反应合成碳酸甘油酯，酮酯易 去羰基，产率可达到9 7 i 亿j 。 o o 八o 。 协 1 2 2 酶法合成 p d c l 2 ( m e c n ) 2 ( 方程式1 3 ) 甘油和碳酸二甲酯在脂肪酶催化下可反应生成碳酸甘油酯。k i m 等1 1 3 1 分别用脂肪酶 n o v o z y m4 3 5 、n o v o z y m7 3 5 、r mi m 、c r l 、p r l 、c c l 、a n l 和p c l 作催化剂，在 溶剂四氢呋喃中催化合成碳酸甘油酯。研究表明以n o v o z y m4 3 5 为催化剂时甘油的转化 率几乎达到了1 0 0 ，以c r l 作催化剂时甘油的转化率为1 5 ，其它六种酶催化剂对此 反应没有催化活性。由于脂肪酶n o v o z y m4 3 5 对此反应的催化活性高，反应条件温和， 且有机体系中的酶促反应越来越受到关注，故以脂肪酶n o v o z y m4 3 5 催化甘油和碳酸二 甲酯反应合成碳酸甘油酯是一种较好的合成方法。 1 3 碳酸甘油酯的应用 碳酸甘油酯的应用广泛，并可用于合成多种用途广泛的下游衍生物。碳酸甘油酯结 构中含有羟基，故可用于多种相关的衍生酯类化合物的制备。它和多羟基化合物 h o c h ( r 2 ) c h ( o h ) c h ( o h ) r 3 r 4 与酸酐( r l c o h o 在高温下反应可合成环碳酸酯【1 4 】，环碳 酸酯可用于涂料业中涂层的制备。k i l a m b i 等【l5 】在胺催化下以碳酸甘油酯为原料通过 m i c h a e l 反应合成了丙烯酸酯。碳酸甘油酯和乙烯基乙醚在胰脂肪酶的催化下合成了酰 基甘油，酰基甘油可用作合成缩醛磷脂的中间体【1 6 】。r a m a i a h 等【1 。7 】报道了在p h 3 p c c l 4 2 o ， o = 一屯 第一章绪论 体系中以碳酸甘油酯为原料合成酯类化合物的方法。这个反应条件比较温和，在5 5 6 0o c 下反应4 h 后产率达6 0 。 电+ 旷l 弋删u p 时，c c h ( 方程式1 4 ) o 碳酸甘油酯和光气在四氢呋喃和活性碳中合成脂肪族的氯甲酸酯，产率为9 1 t 1 3 1 。 k a t s u y a 等1 9 1 报道了单糖和碳酸甘油酯在l e w i s 酸的存在下合成了碳酸甘油糖酯。碳酸 甘油糖酯用于医疗业，可抑制癌细胞增长【2 0 】。 o ，o h + ：执讹h a o o 八r 。讹 f 方程式1 - 5 ) 另外，碳酸甘油酯还可用于聚酯类化合物的制备，如聚碳酸酯和聚氨酯【6 j 。 碳酸甘油酯是一种新型的多功能合成子，能与氧、氮和硫等亲核试剂进行亲核取代， 同时也可和硫醇反应合成多种产物2 1 1 。文献【2 2 1 报道了碳酸甘油酯与硫酸钠反应制备缩水 甘油，缩水甘油可用作药物中间体。在碱或酸催化剂的存在下，碳酸甘油酯和十二醇反 应可得到高纯度的十二醇甘油醚。十二醇甘油醚是一种抗菌剂，可作为化妆品的原料【2 引。 外消旋的碳酸甘油酯利用率较低，可通过手性合成法转化为具有光学活性的s 一碳酸 甘油酯和r 碳酸甘油酣2 4 1 。具有光学活性的碳酸甘油酯利用率高，应用范围广。 碳酸甘油酯可用作乳化剂。它可以使较难乳化的试剂乳化，同时具有提高头发的干 梳理性和抗静电性的功能，故可取代具有这些功能的硅树脂油【2 5 l 。此外，它还是一种气 体分离膜和一些洗涤剂中的重要成分，更是涂料业中非常重要的溶剂【2 睨。 1 4 展望 综上所述，用脂肪酶作催化剂催化合成碳酸甘油酯，反应条件温和，产率高，节约 能源和资源，对环境友好，且在有机体系中的酶促反应越来越受到关注。因此，脂肪酶 促合成碳酸甘油酯是极具应用前景的。甘油和碳酸二甲酯分别因其廉价和环境友好的优 点，成为合成碳酸甘油酯的重要原料。就研究现状而言，人们对于脂肪酶促甘油和碳酸 二甲酯反应合成碳酸甘油酯的反应进程及副产物的研究仍不够充分。随着碳酸甘油酯合 成方法和用途的不断发展，碳酸甘油酯及其衍生物必将受到越来越多的关注。 1 5 立题依据和主要研究内容 1 5 1 立题依据 生物柴油生产过程中副产的大量甘油带动了新的以甘油为原料产业的迅猛发展。碳 酸二甲酯作为一种环境友好的新型绿色有机化学品，可替代光气、硫酸二甲酯、卤代甲 烷等剧毒物质1 2 引，故成为合成碳酸甘油酯的较好原料。 江南大学硕士学位论文 碳酸甘油酯的合成中催化剂的选择是很重要的影响因素。脂肪酶作为一种高效的生 物催化剂，不仅具有高立体专一性和区域专一性【2 9 1 ，反应条件温和，能耗低，对环境友 好，节约资源具有实际应用价值。 1 5 2 主要研究内容 基于以上分析，本课题拟作如下研究： ( 1 ) 以甘油和碳酸二甲酯为底物，四氢呋哺为溶剂，在脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb ( 简称 c a l b ) 催化下合成碳酸甘油酯。 ( 2 ) 通过对初始加水量、反应温度、加酶量、底物摩尔比、底物浓度、体系p h 值、分子 筛等条件的单因素考察，对此转酯反应进行初步探索。 ( 3 ) 深入探索此反应，从综合改变工艺条件、更换溶剂、改变体系分散性等角度出发， 尝试定向合成本反应的各种产物。 4 第二章脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 催化合成碳酸甘油酯 第二章脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 催化合成碳酸甘油酯 2 1 引言 本章将以c a n d i d a a n t a r c t i cb ( c a l b ) 催化甘油和碳酸二甲酯在四氢呋喃中的反应， 并且对各种反应条件，包括初始加水量、反应温度、加酶量、底物摩尔比、底物浓度、 体系p h 值、分子筛等进行单因素分析。 2 2 材料与方法 2 2 1 试剂及仪器 甘油、碳酸二甲酯、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲酸、无水乙醇、无水乙醚、 无水氯化钙、石英砂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硼酸、硼砂( a r ，国药集团化学试剂 有限公司，其中有机溶剂在使用前均用4a 分子筛干燥) ；羧甲基纤维素钠、硅胶g 、硅 胶h 、5a 分子筛，4a 分子筛( c p ，国药集团化学试剂有限公司) ；c a l b ( 4 0o c 下橄榄 油水解酶活为7 5 0 0u g ，购自诺维信公司) 。 气相色谱仪，f u l i9 7 9 0 ，浙江温岭福立分析仪器有限公司；恒温磁力搅拌器，8 1 2 ， 广州仪科实验室技术有限公司；电动离心机，8 0 2 ，金坛市岸头国瑞实验仪器厂；离心 机，l x 2 0 0 ，海门市其林贝尔仪器厂；红外光谱仪，f t l a 2 0 0 0 ，a b b ；气相色谱串联 质谱联用仪，1 2 0 0 l g c m s m s ，美国瓦里安公司( v a r i a n ) ：核磁共振仪，u l t r a s h i e l dp l u s4 0 0 ，德国布鲁克公司( b r u k e r ) 。 2 2 2 碳酸甘油酯的合成 在装有回流冷凝管的1 0 0m l 三口烧瓶中，加入6 0m m o l 甘油、6 0m m o l 碳酸二甲 酯与1 1m l 四氢呋喃，在磁力搅拌下预热到反应温度后加酶，并开始计时。加酶( 1 0 0 0 0 g 脂肪酶，在4 0o c ，p h = 7 0 的条件下，水解橄榄油每分钟产生1i _ t m o l 的脂肪酸，即为一 个脂肪酶活单位u ) i 0h 后加入2 0g5a 分子筛。反应过程中定时取样，样品经除去酶、 分子筛、四氢呋喃及残留的碳酸二甲酯后，保存于1 8o c 以备g c 分析和柱层析分离。 将经上述处理后的样品用饱和食盐水：乙醚= 1 ：2 ( v v ) 两相萃取3 次，合并有机相并 挥发乙醚后，进行柱层析分离。萃取剂加入量为每次2 5m l t , 醚儋样品。柱层析条件： 洗脱剂为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸= 3 0 0 ：1 0 0 ：60 , v ) ，硅胶h ( 1 0 0 2 0 0 目) ，上样量为 o 0 2g g 硅胶。 2 2 3 产物分析 定性分析：采用t l c 跟踪反应进程，用g c m s 对具不同比移值的产物定性。 t l c 分析条件：展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸= 3 0 0 ：1 0 0 6 ( 价) ；碘蒸汽显 色。 g c m s 分析条件：1 2 0 0 lg c m s m s 气质联用仪，美国v a r i a n 公司。t r a c eg c 色 谱仪，汽化室温度2 8 0o c ，d b 5 毛细管柱。程序升温，初温5 0o c ，保持2m i n 再以1 0 江南大学硕士学位论文 o c r a i n 的升温速率升至2 5 0o c ；t r a c em s 检测器，载气( h e ) 流量0 9m l m i n ，ei 电离 源，7 0e v ，扫描范围3 3 4 5 0 。 定量分析：f u l l9 7 9 0 气相色谱仪，浙江温岭福立分析仪器有限公司。数据采集及 处理系统：s r a d v 色谱工作站；s e 5 4 毛细管柱；f i d 检测器；进样器与检测器温度为 3 0 0o c ：进样量0 2 此；载气( n 2 ) 流量3 5m l m i n ；程序升温：起始温度1 6 0o c ，保持 1 3m i n ，再以2 0o c m i n 的速度升温至2 1 0o c 。 样品采用g c 进行定量分析。以归一化含量表征反应进程，以甘油内加法定量甘油， 环二酯内加法定量环二酯。所有单因素分析的实验点误差全部相对误差3 以内。各物 质的转化率及产率的计算公式如下： 讪暑【l 一捌t o 喊 y d 蕾型c a i 坠嗍 ( 2 ) 擀捌心删 m 粉蒜i o o 式中： c 彤：甘油的转化率 y d ：单酯的产率 y 。：环二酯的产率 y 。：环三酯的产率 a 。：原始样品中甘油的峰面积 a g ：内加甘油后样品中甘油的峰面积 ：原始样品中单酯的峰面积 a d ：内加甘油后样品中单酯的峰面积 氏：原始样品中环二酯的峰面积 a7 。：内加环二酯后样品中环二酯的峰面积 a 。：原始样品中环三酯的峰面积 a 。：内加环二酯后样品中环三酯的峰面积 w 。：内加物质量( 曲 m 。：体系总质量( g ) m q ：取样质量( g ) m g ：初始甘油总质量( g ) m d ：理论上生成的单酯质量( g ) m 。：理论上生成的环二酯质量( g ) m 旺：理论上生成的环三酯质量( g ) 6 第二章脂肪酶c a n d i d a a n t a r c l c b 催化合成碳酸甘油酯 一= 警 一= 警 2 3 结果与讨论 2 3 1 反应进程 我们首先用y a m 等报道m 1 的实验条件考察了c a l b 催化四氢呋喃中甘油和碳酸二 甲酯的转酯反应。 用t l c 跟踪反应进程。t l c 分析条件：展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯：甲酸- 3 0 0 1 0 0 ：6f v v ) ；碘蒸汽显色。如图2 一i 所示： 图2 - 1t l c 显色围 f i 9 2 - 1 t h es c h e m a t i cd i a g r a mo f t l c 各显色点所对应的物质结构由g c m s 和n m r 确定，见表2 - 1 。 表2 - 1t l c 显色点对应物质的结构厦系统命名 t e b2 - 1t h es t r u c t u r ea n ds y s t e m a t i c n 啪i n g m e t h o do f t h c 结构 系统命名 江南大学硕士学位论文 产物为无色粘稠液体。将反应后的样品做气相色谱质谱联用( g c m s - m s ) 分析。g c 流出曲线见图2 2 ： 图2 - 2 气相色谱流出曲线 f i g 2 - 2 g a sc h r o m a t o g r a p h yc u r v e s 保留时间为7 1 0 1r a i n 、7 7 1 3m i n 、7 8 9 0r a i n 、8 0 3 2m i n 的流出峰所对应的质谱图 分别如图2 3 所示。 8 s p b p ( 5 m 4 2 “7 ：) 扣晦= 1 x m o 扣l 7 3 x 0i3r a s c + 日日c ：3 5 0o ，i o n ：n a r i c ：22 9 6 e + 日日c 匣凶 1 0 0 懈 4 ：9 日9环二酲 7 5 i 5 0 蛀 罡b 2 5 i 4 1 8”日9 2 o f 0 i 融o 。5 b 。一，由。，幻。幽一。幽。 。幽2 0 e 。dr a 毛扣。r n ： s p 。”狴( 1 ：9 0 e 拈1 1 功b - 唯 咖咖 01 1 +bbclo：x8p 8 90 01 7 3x m s7r a i nscan：8773 3 0 ：3 5 0o n：naric：2e3e 1 0 0 咏 1 13 9五元环三醋 5 0 蛀 25钲 5 9 0扎i珊卜，：oi1769 0 i 。5 b 。，由。一，自 。幽。幽。幽。之：。i r e 。dr 。a 。挚n v z 。 s 9 8 d ( 1 ( 2 7 7 b p = 叩1 7 e + 7 1 ，1 2 0 0 8 - r r i i n s 8 0 3 2 0 ：n s 0 ，i 0 3 0 3 6 0 o ，7 日c 一n a r i c ：68 75e+7日c幽 1 0 0 蛀 g l 7 5 9 一 510六元环三酷 。i9 ： 圜5 0 蛀 ji 。7 7 0氧二44 1 l11691460 1萼9 j l 】 。5b。，曲 。，自。1 幽。幽。如1 1 a。co。：，edr a 。：和。m ： 图2 3 产物的质谱图 f i g 2 3m ss p e c t r u mo fp r o d u c t 从图2 3 中可以明显看到4 产物碳酸甘油酯的分子离子峰m z = 5 0 9 ( 单酯) 、 1 1 8 9 ( 环二酯) 、1 7 6 9 ( 环三酯) 、1 7 6 9 ( 环三酯) 。各主要质谱峰解析如下： 删z = 5 0 9 ： 9 江南大学硕士学位论文 m l z = 1 1 8 9 ： n d z = l1 8 9 h t - c 2 h 4 0 2 _ - c 3 h 6 0 3 e 尹t 肌z = 1 7 6 9 ： m l z = 1 7 6 9 ： c h 3 0 h m z - - - - 6 1 o m z , = 8 7 5 ；+ 9 r e z - - - 4 29- i - c 2 h 3 0 2 - c 4 h 5 0 3 屯h 5 噬 1 0 r e z z - - 4 2 9 如妇i1 8 9 吐0 h 妇1 1 8 。9 0 3 1 0 、 m z = - 8 9 j9 o + 一0 i m z = 5 9 0 o o= = o 戈3 盼 第二章脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 催化合成碳酸甘油酯 鉴于以上分析，我们有必要进一步了解几种产物之间的转化，并通过单因素分析来 观察何种条件对生成何种产物有利，为之后定向合成各种产物提供依据；同时为提高甘 油的转化率对反应条件进行优化。 2 3 2 初始加水量对反应的影响 在非水相酶催化反应中，体系的初始加水量对酶分子构象、酶热稳定性、酶活性及 选择性都有着很大的影响 3 1 - 3 2 l ，并且在绝对无水的情况下酶一般不具有催化活性。由于 体系中最亲水的物质是甘油，故以甘油的质量为基准计算加水量。 1 2 0 1 0 0 葶 咖 加8 0 鼍 皿6 0 震 虹 4 0 2 0 1 8 芝1 5 删 篓1 2 士。 器 婴e 3 o o51 01 52 02 5 反应时间h 5 0 4 0 葶 咖i 钿3 0 簟 皿2 0 谣 番 1 0 o 1 6 1 4 1 2 棚 加1 0 基 18 里 般6 酶4 2 o 051 0 1 5 2 0 2 5 反应时间h 0 51 01 52 02 5 051 01 52 02 5 反应时间h反应时间h 加水量( w wt - ；o o ) ：4 , 0 ，口0 5 ，a 3 ，5 ，8 ，t 0 ，0 2 0 胛( 甘油) ： ( 碳酸二甲酯产1 ：1 ；6 0 ；3 8 8 9u 倌碳酸二甲酯；0 0 5g 甘 油m l 四氢呋喃；p h 7 图2 _ 6 不同初始加水量下各物质的归一化含量 f i g 2 - 6 t h ee f f e c to fi n i t i a la d d i t i o no f w a t e ro nt h er e a c t i o n 结果表明，加水量在3 2 0 之间对甘油的转化率和单酯的产率影响并不十分显著。 在加水量较大( 2 0 ) 时，长时间反应后环二酯产率增加。从图中看出初始加水量为8 时 甘油的转化率以及各产物的产率均最高，所以以下固定反应的初始加水量为8 。 在初始加水量为o 和o 5 的时候，甘油的转化率和各产物的产率均最低。这是因为 酶在含水量较少的时候活性降低。从图2 - 6 ( a ) q 丁可以看出，在加水量为0 时加入分子筛 后0 5h 内甘油的转化率为0 ，证明在绝对无水的情况下酶不具有催化活性。而在反应2 1 5 江南大学硕士学位论文 h 后开始出现转化率，特别是当反应进行到2 3h 时加水量为0 与加水量为0 5 的甘油转 化率基本相同，这可能是由于外界的微量水汽进入体系所导致。 2 3 3 温度对反应的影响 考察温度对反应的影响，结果如图2 7 所示： 1 0 0 咖8 0 加 皋 士6 0 震 # 4 0 2 0 1 8 1 6 毋1 4 絮1 2 基1 0 皿8 臀6 旨4 2 0 051 01 52 02 5 反应时间h 4 0 譬 咖3 0 加 鼍 耍l 2 0 岛 * 1 0 0 1 6 1 4 芝1 2 删 加1 0 孽 8 皿 谲6 薛4 2 o 05l o1 52 02 5 反应时间h 051 01 52 02 5o51 01 5z oz 5 反应时间h反应时间h 温度( o c ) ：0 3 0 ，e 5 5 ，6 0 ，x 6 5 加水量：8 ；”( 甘油) ：胛( 碳酸二甲酯) = l ：1 ；3 8 8 9u g 碳酸二甲酯；0 0 5g 甘 油m l 四氢呋喃；p h 7 图2 7 不同温度下各物质的归一化含量 f i g 2 7 t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo nt h ec o m p o s i t i o no f t h er e a c t i o nm i x t u r e 结果表明，温度在6 0 0 c 之下时甘油的转化率随温度的升高而增加，而6 5o c 时甘 油转化率开始降低，造成这一结果的主要原因可能是脂肪酶在高温下活性降低。随着温 度的升高，甘油转化率恒定或开始略微下降时，单酯及环三酯的产率均下降，而环二酯 产率持续却上升，这说明单酯及环三酯最终均有向环二酯转化的趋势。 2 3 4 加酶量对反应的影响 考察加酶量对反应的影响，结果如图2 8 所示： 1 6 第二章脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 催化合成碳酸甘油酯 1 0 0 乎 谕8 0 缸 薯 士6 0 曩 血 4 0 2 0 1 6 1 4 1 2 嘲 加l o 篁 8 里 程6 1 1 酶4 2 o 4 0 出 蔬3 0 缸 晕 士2 0 疆 聃 1 0 0 051 01 5 2 0 2 5 o51 01 5 2 0 2 5 反应时间h 反应时间h 051 01 52 02 5o51 01 52 02 5 反应时间h反应时间h 加酶量( u 儋碳酸二甲酯) ：0 3 8 9 ，口1 9 4 4 ，a 2 8 5 2 ，3 8 8 9 加水量：8 ；刀( 甘油) ：刀( 碳酸二甲酯产l ：l ；6 0 ；0 0 5g 甘 油m l 四氢呋喃；p h 7 图2 8 不同加酶量下各物质的归一化含量 f i g 2 8 t h ee f f e c to fe r m y m ec o n c e n t r a t i o no nt h ec o m p o s i t i o no ft h er e a c t i o nm i x t u r e 随着加酶量的增加，甘油的转化率及各产物的归一化含量持续增大。然而在增大相 同加酶量的前提下它们的增加幅度在减小。 2 3 5 底物摩尔比对反应的影响 考虑到本反应是串联反应，底物摩尔比对反应产物的组成必然有较大的影响。实验 结果如图2 - 9 所示： 1 7 埔 m 地 m 8 6 4 2 o 毋伽如睾1 e i i 谣旨 江南大学硕士学位论文 1 0 0 8 0 芝 咖 加6 0 晕 县4 0 撰 血 2 0 0 051 01 52 02 5 反应时间h 4 5 4 0 3 5 霉 谕3 0 篓2 5 士2 0 程1 5 廿 l o 5 o 051 01 52 02 5 反应时间h 051 01 52 02 5 051 01 52 02 5 反应时问h反应时间h 刀( 碳酸二甲酯) ：玎( 甘油) ：l ，口1 5 ，a 3 加水量：8 ；6 0o c ；3 8 8 9o g 碳酸二甲酯；0 0 5g 甘油m l 四氢呋喃；p h 7 臣 2 - 9 不同底物摩尔比下各物质的归一化含量 f i g 2 9 t h ee f f e c to fs u b s 缸 a t er a t i oo nt h ec o m p o s i t i o no ft h er e a c t i o nm i x t u r e 如图2 - 9 ，随着碳酸二甲酯比例的增加，甘油转化率增加并趋于恒定；而反应5h 后单酯产率下降，环三酯产率上升；在反应2 3h 后，单酯的产率下降，环二酯的产率却 持续上升。单酯的最高含量值基本相同，并未随着底物摩尔比的变化而发生明显变化。 这说明了单酯的含量到达了一定值的时候( 归一化含量3 5 4 0 ) 就有大量向环二酯转化 的趋势。 另外，行( 碳酸二甲酯) ：疗( 甘油) = 3 ：l 时，反应2 3h 后环三酯产率也出现了下降，这说 明碳酸二甲酯比例的增加有利于环三酯的生成，但单酯及环三酯最终都有向环二酯转化 的趋势。 根据以上的实验现象，推测当体系中甘油过量时，单酯的最高含量点出现的时间同 样应该较早，故而设计以( 碳酸二甲酯) ：甩( 甘油) = l ：1 5 的实验。然而实际情况却有所不同。 当底物摩尔比为甩( 碳酸二甲酯) ：力( 甘油) = l ：1 5 时，反应2 3h 后单酯的归一化含量仅为 2 3 。分析原因，发现条件中只有甘油的浓度比原先增加了o 5 倍，则此现象很可能是 由于甘油浓度增加，从而夺去体系中更多的水导致酶的催化活性降低。 加 m 0 如 拈 ； 历 坫 m 5 o 誉嘲如皋1日i程旨 第二章脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 催化合成碳酸甘油酯 2 3 6 底物浓度对反应的影响 考察了甘油浓度对此反应的影响。实验结果如图2 1 0 所示： 1 0 0 霉 谕8 0 缸 基 士6 0 要 丑 4 0 2 0 051 01 52 0 反应时间h 4 0 毋 谕3 0 缸 基 女2 0 衄 番 1 0 0 2 5 0 51 01 52 02 5 反应时间h 051 01 52 02 505 反应时间h 1 01 52 02 5 反应时间h 甘油浓度( e c m l 四氢呋喃) ：o 0 3 ，r t o 0 5 ，a 0 0 7 ，a 0 1 加水量：8 ；6 0o c ；3 8 8 9u g 碳酸二甲酯；力( 甘油) ：玎( 碳酸二甲酯) = 1 ：l ；p h 7 图2 1 0 不同甘油浓度下各物质的归一化含量 f i g 2 - 1 0t h ee f f e c to f g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o no nt h ec o m p o s i t i o no f t h er e a c t i o nm i x t u r e 本反应在四氢呋喃作为溶剂的情况下，底物浓度不宜超过0 0 5g 甘 油r n l 四氢呋 哺。 2 3 7 体系p h 值对反应的影响 p h 6 - 7 为磷酸二氢钠- 磷酸氢二钠缓冲体系；p h 8 - 9 为硼酸硼砂缓冲体系。结果如图 2 1 1 所示： 1 9 6 4 2 o 8 6 4 2 o 螂姐摹】efi韶旨 埔 m 他 加 8 6 4 2 0 116蛐姐罩l e i i 程旨 江南大学硕士学位论文 1 0 0 螽8 0 加 鼍 士6 0 是 血 4 0 2 0 2 5 芝2 0 删 錾1 5 嚣1 0 1 1 旨5 0 05 术 嘲 缸 尊 皿 器 番 1 0 0 1 01 52 02 5 05 反应时间h 05 1 01 52 02 5 反应时间h 1 01 52 02 5o5 反应时间h l o 1 52 02 5 反应时间h ，ph：6，d7，a8，a9 加水量：8 ；6 0o c ；3 8 8 9u g 碳酸二甲酯；刀( 甘油) ：顶碳酸二甲酯) = l ：l ；0 0 5g 甘油m l 四氢呋喃 图2 1 1 不同体系p h 值下各物质的归一化含量 f i g 2 - 11 t h ee f f e c to fp ho nt h ec o m p o s i t i o no f t h er e a c t i o nm i x t u r e 结果表明，p h 在6 - 9 的范围内对反应的影响并不显著，碱性环境略有利于单酯的生 成。 2 3 8 分子筛对反应的影响 分子筛对反应的平衡影响很大，故我们考察了分子筛加入与否及加入时间对反应的 影响。实验结果如图2 1 2 所示： 璩拍m 挖加8 6 4 2 0 毋咖锕甚1日i程薛 第二章脂肪酶c a n d i d aa n t a r c t i cb 催化合成碳酸甘油酯 1 0 0 盖8 0 缸 搴 士6 0 撄 血 4 0 2 0 0 51 01 52 02 5 反应时间h 4 0 木 谕3 0 钿 篁 士2 0 船 番 1 0 o 051 01 52 02 5 反应时间h 0 5l u1 5z 0z 5u5l o 1 5 z uz 5 反应时间h反应时间h 加酶后1h 加入分子筛，口无分子筛，加酶后直接加入分子筛 加水量：8 ；6 0o c ；3 8 8 9w g 碳酸二甲酯；栉( 甘油) ：疗( 碳酸二甲酯) = l ：1 ；0 0 5g 甘油m l 四氢呋喃； p h 7 图2 1 2 不同分子筛加入方式下各物质的归一化含量 f i g 2 - 12 t h ee f f e c to fd i f f e r e n ta d d e dw a yo fz e o l i t e so nt h ec o m p o s i t i o no ft h er e a c t i o nm i x t u r e 与原实验条件，即加酶后1h 加入分子筛相比，无分子筛及直接加入分子筛两种实 验条件的反应转化率均有较大幅度的降低，在反应开始后o 5h 内转化率基本为0 。结果 表明，直接加入分子筛比无分子筛对反应的影响更大。不加入分子筛则不能及时移除反 应生成的甲醇，无法让平衡持续向生成产物的方向移动；而直接加入分子筛则相当于在 反应开始时剥夺了体系的一部分水，使体系初始含水量低于酶的必须水量，并且降低了 分子筛吸收甲醇的容量。这两种实验条件均不利于反应的进行。 2 4 本章小结 本章将对以c a l b 催化甘油和碳酸二甲酯在四氢呋喃中反应合成碳酸甘油酯的反 应进程进行了初步探讨，并且对各种反应条件，包括初始加水量、反应温度、加酶量、 底物摩尔比、底物浓度、体系p h 值、分子筛等进行单因素分析