广西地方标准《甘蔗梢腐病的鉴定检测方法》（征求意见稿）编制说明

广西地方标准甘蔗梢腐病的鉴定检测方法 （征求意见）编制说明一、任务来源及起草单位为推进广西农业标准化工作，根据广西农业厅有关文件精神，广西大学提出甘蔗梢腐病的鉴定检测方法地方标准，经批准立项。由广西大学农学院、广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室结合承担的国家自然科学基金“甘蔗梢腐病病原菌的致病性分化及其种属特异染色体区的基因鉴定”项目的研究成果，整理并完成此标准的起草工作。二、制定标准的必要性甘蔗(Saccharumofficinarum L.)是热带和亚热带地区重要的经济作物，也是世界上最重要的糖料作物，也是重要的工业原料。甘蔗梢腐病是甘蔗生产过程中一种常见病害，该病由串珠镰刀菌(Fusariummoniliformis)引起。1921 在印度尼西亚爪哇首次报道了该病，目前几乎所有甘蔗生产国和地区都有该病发生，造成严重的损失。在我国，甘蔗病害的基础性研究比较薄弱。尤其在甘蔗抗病育种和病害的快速诊断技术上，与先进国家相比有较大差距比。中国甘蔗种植面积大、范围广，通过对中国大陆甘蔗各产区的甘蔗梢腐病菌进行形态学和分子生物学鉴定，结合 ITS 序列聚类分析，初步鉴定中国大陆甘蔗梢腐病病原为镰刀菌（Fusarium）的两个种，F.verticillioides gx1 (Fv) 和 F.proliferatum gx2 (Fp)，其中 gx1 为优势种，主要发生在夏季，gx2 主要发生在冬季。因此，根据 gx1 和gx2 两个种的 ITS 序列易变异区设计特异引物和 Taq Man 探针，通过 qPCR 技术和常规 PCR 技术对甘蔗梢腐病的病原菌进行快速检测和准确鉴定，这也是下一步深入分析甘蔗梢腐病发生和危害的分子机制，为今后抗病育种奠定基础。三、标准编制过程3.1 前期研究通过对中国大陆甘蔗各产区（广西、云南、海南、福建、广东、浙江等）的甘蔗梢腐病调查取样及病原菌的生物学研究，对采集的所有样品进行病原菌分离纯化，经形态学鉴定和分子生物学鉴定，结合 ITS 序列的系统发育分析，初步鉴定中国大陆甘蔗梢腐病病原主要是单一种类镰刀菌 F. moniliforme，但有两种小种（ gx1 和 gx2） ，其中 gx1 为优势小种，主要在夏季发病，gx2 主要在冬季发病。3.2 组织分工任务下达后，广西大学成立了标准起草组，明确了工作指导思想，制定了工作原则，确定了起草成员和任务分工。张木清教授为项目负责人，徐世强、王继华、魏晶晶、暴怡雪、覃丽芳负责材料收集、各项技术指标的准备以及标准的编制。3.3 资料收集、技术准备起草组首先是借鉴其他标准编制的经验，组织成员对甘蔗病害鉴定检测相关的标准以及病害检测的文献进行了分析讨论，全面了解标准的编制方法以及相应的技术指标，其次是采取专家咨询、组织召开座谈会，对拟定的标准所涉及的内容、范围、适用性、前瞻性等内容进行了研讨，明确甘蔗梢腐病鉴定及检测要求的技术内容。3.4 标准的编制通过对实验结果进行总结归纳，按照 GB/T 1.12009 给出的规则进行编制，并制定征求意见稿，邀请甘蔗领域专家召开咨询会，对拟定的标准进行审查，会综合分析审查的意见，并根据修改意见对标准再次进行修订，制定出标准送审稿。四、标准主要指标的确定和依据说明4.1 甘蔗梢腐病鉴定技术4.1.1 症状特征甘蔗梢腐病主要发生在甘蔗的梢部和幼嫩叶片，感病后引起腐烂，故名梢腐病。被害心叶呈梯形凹凸扭曲，并有纵裂，叶缘和叶尖有红或黑色的病斑，呈烧焦状态。受害严重时，生长点周围组织变软变褐，心叶坏死，形成梢腐，使整株甘蔗枯死。轻度发病的蔗梢心部叶片部分腐烂，大部分可以恢复生长，中度发病的蔗梢心叶完全腐烂，形成“死尾蔗” ，重度发病的蔗梢变褐腐烂。  A                          B图 1. 甘蔗梢腐病田间自然发病症状A:蔗梢心部叶片部分腐烂，伴有有红或黑色的病斑；B：心叶呈梯形凹凸扭曲，失绿并有纵裂。4.2.2病原特征甘蔗梢腐病病原菌在含氨苄青霉素 100 g/ml 的 PDA 培养基上菌落背面呈淡黄色，菌丝无色，分枝不规则，有的菌丝组合成孢梗束，产生两种分生孢子：大型分生孢子和小型分生孢子，大型分生孢子镰刀状，具隔膜，小型分生孢子生于分生孢子梗顶端，呈现卵型，无隔膜。图 2.光学显微镜下甘蔗梢腐病菌落、菌丝及孢子形态4.2.3  ITS 序列鉴定将各甘蔗产区分离得到的 103 个菌株用真菌通用引物 ITS1 和ITS4 进行扩增，测序所得片段长度 485bp - 603 bp，将测序所得的序列经过 Blast 比对分析，发现亲缘关系与镰刀菌属F.verticillioides、 F.proliferatum 的亲缘关系较近，连同从 GenBank 下载镰刀菌属不同种的 ITS 序列一起用于系统发育分析。通过分析发现，第一类（gx1）包括 93 个菌株序列以及F.verticillioidesNRRL22172 和 F.sacchariNRRL13999 的参考序列,第二类（gx2）包括 7 个菌株序列以及 F.proliferatum 和 F.fujikuroi 的参考序列。图 3.基于  ITS-rDNA 序列构建的系统发育树4.2.4致病性特征注射接种 7 天后出现甘蔗梢腐病症状，经过病原菌的在分离和纯化后的菌株与原菌株的病原特征一致，而对照没有出现症状。图 4.温室接种甘蔗梢腐病菌的症状。A:接种无菌水作为对照。B:叶缘和叶尖有红或黑色的病斑;C：蔗梢心部叶片部分腐烂;4.2甘蔗梢腐病菌A B C 快速检测方法根据 gx1 和 gx2 两个种的 ITS 序列易变异区设计特异引物和Taq Man 探针，通过 qPCR 技术和常规 PCR 技术对甘蔗梢腐病的病原菌进行快速检测和准确鉴定。具体结果如下：图 1. 特异引物常规 PCR 检测法对梢腐病菌的检测鉴定结果。A：gx1 的常规 PCR 引物扩增结果，片段大小 439bp；B：gx2 的常规PCR 引物扩增结果，片段大小 400bp。A B图 2. TaqMan 荧光定量 PCR 对梢腐病菌的检测鉴定结果。A：gx1 的qRT-PCR 引物和探针检测结果；B: gx2 的 qRT-PCR 引物和探针检测结果。4.3 主要参考文献目前，国内尚无甘蔗梢腐病鉴定检测方法相关的标准，并且甘蔗致病小种 gx2 也是张木清研究团队首次报道，文章 Species-Specific Detection and Identification of Fusarium Species Complex, the Causal Agent of Sugarcane PokkahBoeng in China 发表在 PLOS one（2014） 。本标准与现行法律、法规和相关标准相协调、无冲突,在制定的过程中，主要参考的标准及文献如下：SN/T 14002004,甘蔗流胶病菌检疫鉴定方法SGB/T 280672011,甘蔗黄叶病