（化学工艺专业论文）大豆脂肪氧合酶抑制剂根皮素的合成及性能研究.pdf

摘要 摘要 本课题主要从事脂肪氧合酶( l o x ) 抑制剂根皮素的合成工艺研究及产品鉴定，同 时初步探讨根皮素等黄酮化合物结构与l o x 活性抑制关系。 以丙二酸二乙酯和对甲氧基苄氯为起始原料，摩尔比1 ：1 ，溶剂乙醇，反应温度8 0 ， 反应时间1 0 h ，得中间体对甲氧基苄基丙二酸二乙酯，得率9 3 0 8 ；上述中间体在2 0 的n a o h 溶液中1 2 0 下反应6 h ，得到对甲氧基苯基丙二酸，得率8 2 0 8 ；对甲氧基 苯基丙二酸在1 4 0 下脱羧6 h 得到对甲氧基苯丙酸，反应产率8 2 3 0 。 对甲氧基苯丙酸通过酰化、酯化反应得到三对甲氧基丙酸均三酚酯。对合成工艺采 用j 下交试验进行优化，得到的较优条件是：n ( 三酚) ：n ( 酸) = 1 ：3 2 ，反应温度7 5 ， 时间4 h ，吡啶用量1 5 m l ，收率可达9 8 4 3 ；所得三酯和间苯三酚采用a 1 c 1 3 和b f 3 e t 2 0 作催化剂，通过t l c 、熔点、紫外、红外和核磁光谱分析鉴定为目标产物根皮素，最终 产率分别为5 2 2 1 和1 3 6 4 。 从大豆中提取出大豆脂肪氧合酶，比较了水浸提，缓冲液一盐析，碱溶一酸提一二 次盐析这三种酶提取方法的效果，结果表明，直接用水浸提法得到的粗酶液由于损失少 而总酶活最高，每1 0 9 脱脂大豆粉的总酶活为7 0 3 x 1 0 7 u 。并在此基础上研究了天然抗 氧化剂和化妆品助剂黄酮类化合物( 芦丁、槲皮素、橙皮苷、异甘草素、大豆黄素、 芒柄花素、根皮素、甘草素) 对大豆脂肪氧合酶的抑制作用。结果表明：四类黄酮类化 合物对脂肪氧合酶都有不同程度的抑制作用。除了橙皮苷以外，其它几种黄酮类化合物 对脂肪氧合酶的抑制效果均随着加入量的增加而增加；除橙皮苷外，活性抑制关系为芦 丁 槲皮素 根皮素 大豆黄素 异甘草素 芒柄花素 甘草素。 关键词：根皮素，合成，抑制，脂肪氧合酶 a b s t r a c t a b s t r a c t t h i st o p i cm a i n l yw a se n g a g e di nt h es y n t h e s i so fl i p o x y g e n a s ei n h i b i t o r - p h l o r e t i n ， u s i n gt h en e wc a t a l y s t a n dt h es t r u c t u r eo ft h ei n t e r m e d i a t e3 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) p r o p i o n i e a c i d ，e s t e rw e r ea l s ob es y n t h e s i z e d t h ep r e p a r a t i o no f3 一( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) p r o p i o n i ca c i df r o mp r o p a n e d i o i ca c i dd i e t h y l e s t e ra n dt h e4 - m e t h o x yp h e n y l m e t h y lc h l o r i n eb ya l k y l a t i o n ，h y d r o l y s i s ，d e c a r b o x y l a t i o n h a sb e e ni n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o nw a s ：a l k y l a t i o n8 0 c ，10h ，h y d r o l y s i s 1 2 0 - 1 4 0 。c ，d e c a r b o x y l a t i o n1 2 0 1 4 0 。c ，a n dt h ey i l e dw a s6 2 8 8 ；t h e nt h ee s t e rw a s s y n t h e s i z e db ya c y l a t i o na n de s t e r i f i c a t i o na n dt h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o nw a s ：4h ，7 5 c ， l ，3 ，5 - t r i h y d r o x y b e n z e n e ：3 - ( 4 - m e t h o x y p h e n y l ) p r o p i o n i ca c i d ( m o o = l ：3 2 ，p y r i d i n e1 5 m l ， a n dt h ey i e l dw a s9 8 4 3 ；t h ei n t e r m e d i a t ew a si d e n t i f i e db ym e l tp o i n t ，u va n di r t h e f i n a lr e a c t i o ny i e l do ff r i e sr e a r r a n g e m e n tw a s13 6 4 a n dt h ep r o d u c tw a si d e n t i f i e da s p h l o r e t i nb yr fv a l u e ，m e l tp o i n t ，u v ，i ra n d1 h - n m r i nt h i st h e s i s ，w em a i n l yd i s c u s s e dt h ee x t r a c t i o no fl i p o x y g e n a s ef r o ms o y b e a n t h e e x p e r i m e n tr e s u l t ss h o wt h a tt h et o t a le n z y m ea c t i v i t y7 0 3 x107 u 10 9 ( d e f a t t e ds o y b e a nf l o u r ) o b t a i n e db yw a t e r - l e a c h i n gi st h eh i g h e s tw i t l lc o r r e s p o n d i n gs p e c i f i ce n z y m ea c t i v i t y 9 0 2x10 3 u m l ( e n z y m ep r e p a r a t i o n ) s p e c i f i c a c t i v i t y o fl o x9 2 6 107 u g ( p o w d e r e d e n z y m e ) o b t a i n e db ya l k a l i - d i s s o l v i n ga n da c i d l e a c h i n gf o l l o w e db yt w os a l t i n g - o u ts t e p si s t h e h i g h e s t o fa 1 1 a n dt h e s o y b e a nl i p o x y g e n a s e w a sd e t e r m i n d e d b yu s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d i nt h i s p a p e r ，w ei n v e s t i g a t e dt h e e f f e c to fe i g h ts e l e c t e df l a v o n o i d s 【f l a v a n o n o l ( h e s p e r i d i na n dl i q u i r i t i g e n i n ) ；c h a l c o n e ( i s o l i q u i r i t i g e n i na n dp h l o r i z i n ) ；i s o f l a v o n e ( d a i d z e i n a n d f o r m o n o n e t i n ) ；f l a v o n o l ( q u e r c e t i n a n d r u t i n ) 】v a r i a b l e s t r u c t u r eo n l i p o x y g e n a s eu s i n gl i n o l e i ca c i da ss u b s t r a t e t h er e s u l t ss h o wt h a tf l a v o n o i d sc a ns t r o n g l y i n h i b i tt h el i p o x y g e n a s e b e s i d e sh e s p e f i d i n ，a l lo t h e rf l a v o n o i d s i n h i b i t i o na r ee n h a n c e d f o l l o w i n gw i t ht h e i rc o n t e n t s f r o mt h ee x p e r i m e n tr e s u l t s ，w ek n o wr u t i nt u r n e dt ob et h e m o s tp o t e n ti n h i b i t o ro ft h el i p o x y g e n a s e 、析t ha ni c s 0o f3 8 4x10 j 1 t g m lf o l l o w e db y q u e r c e t i n ( 8 9 2 x10 一p g m l ) ，p h l o r i t i n ( 3 18 xlo t g m l ) ，d a i d z e i n ( 6 5 7 10 l x # m l ) ， i s o l i q u i r i t i g e n l n ( 6 9 6 x10 i a g m l ) ，f o r m o n o n e t i n ( 7 39x10 吐肛g m l ) ，l i q u i r i t i g e n i na n d ( 0 4 p g m l ，a n dh e s p e r i d i n ( o 4 7 p , g m l ) h a st h eh i g h e s ti n h i b i t i o no f4 5 1 。 k e yw o r d s ：p h l o r e t i n ，s y n t h e s i s ，i n h i b i t i o n ，l i p o x y g e n a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：期：1 8 1 牛2 芗 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：二孕叠阻导师签名：_ 三囊三班 日 期：力崂。禾侈 第一章综述 1 1 引言 第一章综述 在中国宏观经济快速发展的环境下，化妆品及美容行业在中国得到迅速发展，近年 来一直保持着快速增长，2 0 0 5 年，全国化妆品行业实现年销售额约9 6 0 亿元【，2 0 0 6 年度 中国日用化工市场研究报告显示，去年中国r 化市场规模达1 3 7 3 亿元，比上年增长1 3 。 预计2 0 0 7 年，中国化妆品销售额年平均增长速度将达到1 5 左右。2 0 1 0 年，中国化妆品 年销售总额将达至u 4 0 0 0 亿左右。绿色消费，回归自然，各种植物添加剂或者以天然物质 的提取成分替代化台物，将给化妆品的研究、生产、销售带来新的活力。2 0 0 7 年将是绿 色化妆品包括中草药化妆品迅速拓展市场、占领更大市场份额的一年。绿色消费、生物 美容、植物护肤天人合一，回归自然，将形成护肤消费的一种新理念，形成新的消费热 点【2 】o 功能性化妆品已被证实能有效抗氧化、增强细胞新陈代谢、保湿、嫩化皮肤、祛斑、 防晒等功效，而且安全无副作用。这些物质的研制、生产及其应用研究采用了许多高新 技术，如医学、生物工程学等。因此，现代化妆品已不再是简单的轻工业和精细化工产 品，而是兼容了生理学、医学、药学、生物工程学的科技成果。现代功能性化妆品的出 现标志着化妆品已进入一个全新的时代，预示了化妆品行业具有更加广阔的市场前景【3 】。 社会各方面的发展和进步伴随着中老年人口的快速递增，这预示着未来若干年内与 增龄相关的皮肤问题会越来越多，皮肤老化现象也会越来越普遍。因此，皮肤的老化作 为人类衰老的一种外部特征和表现已经成为美容界关注的焦点，延缓皮肤老化的研究仍 将是人类社会永恒的主题之一，也是未来世界美容及化妆品发展潮流中的主流之一【4 j 。 如前所述，二氢查尔酮是一类典型的植物雌性激素，并具有抗癌，抗菌，抗氧化等 生物活性【5 j ，作为化妆品助剂很好地迎合了“天然抗衰老 化妆品的发展趋势。根皮素 作为二氢查尔酮化合物中的典型代表，在医药上的研究和应用非常早且很广泛，而目前 已把它们应用到了化妆品中( 主要是发达国家) 。由于其毒性极低，对皮肤无副作用， 因而具有很大的开发价值。 国内外早已从植物中提取分离出了根皮素，用化学方法合成这种化合物的研究并不 是很多。但是目前相关的提取、合成及应用的研究仍一直在进行之中并呈上升趋势。 由于根皮素在各种水果的皮( 如苹果皮) 、花红( 一种小节果品种) 根中的含量很 低，提取成本很高，目前市场上销售的都是提取物，价格为1 0 0 0 0 元公斤左右。 由于脂肪氧合酶在植物的生长发育中起着促进成熟与衰老的作用，且人体中也有脂 肪氧合酶的存在，大量研究表明，l o x 与人和动物组织中脂肪氧合酶有类似的催化活 性。b e l m a n 6 发现花生四烯酸因脂肪氧化酶的酶健氧化作用，所生成的活性氧及其代谢 产物对机体可造成损伤并产生致癌作用，因此凡能阻止花生四烯酸氧化的抗氧化剂也具 有抗癌、防癌的作用，这是因为哺乳脂肪动物所含的氧合酶其结构和对花生四烯酸的作 用机理，与植物中的大豆脂肪氧合酶相似。由此可知，借助于天然抗氧化剂对大豆脂肪 江南大学硕：f ：学位论文 氧合酶活性是否产生抑制作用，也可作为体外筛选天然抗肿瘤活性物质的一种有效方 法。更有研究表明，l o x 还是影响人体脱发的酶之一，对其抑制可达到防脱发的目的1 7 j ， 因此，其天然抑制剂在化妆品方面也有很好的应用前景。 本文正是在上述背景下，并参考了大量的中外文学术书籍及刊物并经过对国内外市 场进行调查论证后确立的。通过化学合成脂肪氧合酶抑制剂根皮素，并测定它对大豆脂 肪氧合酶的抑制效果，同时选取其他七种黄酮类化合物进行共同研究对比，初步探讨天 然黄酮类化合物结构对l o x 抑制活性的关系，为其在化妆品中实现工业化应用做前期 研究。 1 2 脂肪氧合酶 脂肪氧合酶( 1 i p o x y g e n a s e ，e c l 1 3 i l 1 2 ) 属氧化还原酶，通称脂氧酶( l o x ) 。l o x 报道始见于1 9 3 2 年【8 】，来源于植物中的大豆，而动物中l o x 的报道却是在四十多年后 的1 9 7 5 年吲。l o x 广泛存在在动植物中，在大豆中含量最高，占大豆种子蛋白的1 2 【1 0 】， 其结构中含有非血红素铁，可专一催化含顺，顺一1 ，4 一戊二烯结构的不饱和脂肪酸( 或 酯) 形成氢过氧化物。在植物中脂肪氧合酶的底物主要是亚油酸( l i n o l e i e a e i d ) 和亚麻酸 ( l i o n l e n i c a c i d ) ，而在动物体内脂肪氧合酶的底物主要是花生四烯酸( a r a c h i d o n i c a c i d ) 。 动物体内l o x 虽然发现较晚，但其生理功能现已基本确定，其代谢产物主要参与炎 症反应重要调节分子如白三烯( l e u k o t r i e n e ) 、l i p o x i n s 和前列腺素( p r o s t a g l a n d i n ) 的形成 】。近年来，随着现代分子生物学技术的不断发展，植物l o x 生理功能研究进展也很快。 根据现有报道植物l o x 的可能生理功能包括：( 1 ) 为植物激素茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j a ) 及其甲酯和愈创激素提供合成的前体物质。( 2 ) 其代谢产物作为抗菌或抗虫性物质。( 3 ) 其代谢产物中含有活性氧和氧自由基，对细胞膜具有破坏作用，参与植物的衰老和抗病 性过敏坏死反应。 1 2 1 脂肪氧合酶的结构 研究表明，大_ f a j 旨肪氧合酶( l o x ) 含8 3 9 个氨基酸，是一个单链肽蛋白，整体结构 分为2 个部分：一个是n 末端的与l 条a 螺旋组成的部分；另一个是包含2 2 条0 【螺 旋和8 条p 折叠股的主要区域。植物l o x 的相对分子质量为9 0 x 1 0 3 、一1 0 0 x 1 0 3 ，动物 l o x 缺乏植物l o x 的n 末端序列，其相对分子质量为6 5 x 1 0 3 7 5 x 1 0 3 。在空间结构 上，l o x 的主要区域以一条长的0 【螺旋为中心，其他结构环绕在其周围。非血红素铁 原子靠近酶中心位置，其附近有一个特殊的三圈兀螺旋，并以配位键与3 个组氨酸侧链 和羧基末端的c 0 0 一结合，从而形成酶活力中心的主要组成部分。 1 2 2 脂肪氧合酶的氧化途径 脂肪氧合酶途径，简称l o x 途径，是脂肪酸氧化的途径之一。高等植物的脂肪酸氧 化途径有4 条，即a 氧化、b 氧化、c 氧化、l o x 途径。l o x 途径是指多不饱和脂肪酸在 有氧条件下经脂氧合酶催化生成氢过氧化物，再经一系列不同的酶的作用最终生成具有 一定生理功能的化合物。在高等植物体内l o x 途径多以十八碳酸为初始底物，因此又称 2 第一章综述 十八碳酸途径，动物体内则以花生四烯酸为初始底物故称二十碳酸途径。由于l o x 途径 的初始底物脂肪酸来自经脂肪酶或水解酶水解的甘油酯。因此，广义上的l o x 途径还包 括甘油酯的水解过程，而狭义上的l o x 途径则是从脂肪酸氧化开始的【1 2 l 。 1 2 3 大豆脂氧合酶的生化特性 现在对大豆l o x 研究最清楚，就目前所知，大豆种子中的l o x 具有3 种同工酶类型， 即l o x l 、l o x 2 、l o x 3 。6 0 年前，a n d r e h o u 首先发现大豆豆腥味的产生是由于多元不 饱和脂肪酸的酶促氧化所致，其中关键酶为l o x 。由于l o x 在催化反应中，不仅生成具 有共轭双键的过氧化氢物，还继续分解产生醛、酮等具有挥发性物质，使豆制品产生腥 味。通过对分离得到的大豆子叶l o x 的研究，发现每个l o x 是一条mr 为9 6 0 0 0 左右的多 肽，每个多肽中含一个铁原子。有实验证明，大豆子叶的l o x 处于静止、无活性状态时， 铁以f e 态存在；当加入底物后，l o x 中的f e 处于f e ( a ) 态，使l o x 具有催化活性。大 豆种子中的l o x 都是球形、水溶性蛋白。l o x l 、l o x 2 、l o x 3 的等电点分别为5 6 5 、5 8 5 、 6 1 5 。3 种同工酶的生化特性是：l o x l 的反应最适p h 值在9 0 处，l o x 2 在p h 6 5 处， l o x 3 在p h 7 0 处。l o x l 对带电脂肪酸有明显的选择性，与亚油酸的反应产物几乎全 是1 3 氢过氧亚油酸( 9 5 ) l o x 对中性脂肪酸表现更强的活性，与亚油酸的反应惑物为 9 氢过氧亚油酸、1 3 氢过氧亚油酸二者各占一半；l o x 3 与亚油酸的反应产物为9 氢过 氧亚油酸( 6 5 ) 、1 3 - 氢过氧亚油酸( 3 5 ) 。除催化原初反应外，l o x 还催化次级反应 而形成脂肪酸的二聚苯和羰基二烯酸，类胡萝卜素的漂白即是由l o x 次级反应实现的。 目前，对植物l o x 同工酶的生物化学和分子生物学特性已有了大体了解，但对l o x 的 分子结构还需作进一步的研究。j 大豆脂肪氧合酶与人和动物组织中脂氧合酶有类似的催化活性。设想若抑制其恬性 则可延缓衰老，也可以说有抗皱的功效。由于只有当脂肪氧合酶分子中的铁离子为三价 时，脂肪氧合酶才有活性。如果找到一种铁离子络合剂则可以抑制脂肪氧合酶的活性。 目前文献报道已经找出多种铁离子络合剂，如茶多酚、槲皮素、e g c g 、芦丁、g s h 、 d t y 、棉子酚及b h a 等。而黄酮化合物对脂肪氧合酶的系统抑制研究尚不深入， m o d e s t o 1 3 l 曾用电化学方法研究了槲皮素、紫杉叶素等四种黄酮化合物对大豆脂肪氧合 酶的抑制作用，国内笔者只见徐向群【1 4 】和谢笔钧【1 5 】等测定了茶叶组分和茶儿茶素、茶黄 素对l o x 活性抑制的作用。 据报道l o x 中的铁存于酶的内部，在酶不发生结构上改变的情况下，一般化学试剂 很难接近铁离子而发生反应，而酶蛋白发生空间结构变化后，分子中的铁离子将充分暴 露，在此基础上铁离子络合剂就比较容易接近铁离子，这样双重的破坏作用就可能提高 抑制效果。 1 3 黄酮类化合物 1 3 1 天然抗氧化剂简介 由于氧自由基和氧化反应的普遍存在，由氧自由基和氧化反应引起的负面影响已经 江南人学硕上学位论文 引起人们的高度重视。瘁灭生物体内的过多氧自由基，阻断由氧化反应引起的食品氧化 腐败，可以通过添加抗氧化剂来实现。因此，抗氧化剂的研究和开发已成为近年来生物、 医药、食品、化妆品和饲料界非常令人关注的一个研究领域。 抗氧化剂是指能够清除氧自由基，抑制或清除以及减缓氧化反应的一类物质。在生 物体中各类抗氧化剂主要由以下作用机制单个或联合发生作用而起到抗氧化效果：( 1 ) 减少氧化底物中的局部氧浓度；( 2 ) 消除启动脂质过氧化的引发剂；( 3 ) 结合金属离 子，使其不能启动脂质过氧化的羟基自由基或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化 氢；( 4 ) 将脂质过氧化物分解为非自由基产物；( 5 ) 阻断脂质过氧化的反应链，即脂 质过氧化的中间自由基，如脂自由基、脂氧自由基和脂过氧自由基。 按照抗氧化剂的来源可将其分为天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂。天然抗氧化剂 有时也称为生物抗氧化剂，主要是指生物体内合成的具有抗氧化作用或诱导抗氧化剂产 生的一类物质。生物体可以是植物、动物，也可以是微生物。如植物体内的多酚类物质、 黄酮类物质等，微生物细胞产生的类胡萝卜素、维生素类物质等【l6 1 。 天然抗氧化成分的来源包括：某些草本植物、香辛料、茶叶、油料种子、果蔬、酶 及蛋白质水解物等。大部分的天然抗氧剂的化学成分与化学合成的抗氧化剂，如b i - i a 、 b h t 的结构有相似之处，如含有芳香环结构且至少含有一个羟基，有些则表现有还原性 或螯合金属离子的能力i l 。 目前日本已列入批准允许使用的品种有：葵花、曲霉、丁香、米糠、茶叶、芝麻酚、 生育酚、银杏叶、水芹、向日葵子和迷迭香提取物等。我国8 0 年代以来对天然抗氧化剂 的研究不断发展，取得了一定成绩。随着人们生活水平提高后对健康、长寿的新需求， 天然抗氧化剂以其安全、无毒等优点而越来越受到消费者的信赖和欢迎。 1 3 2 黄酮类化合物的抗氧化性和雌激素活性 1 3 2 1 概述 黄酮类化合物( f l a v o n o i d e s ) 是指存在于天然界的，具有2 苯基色原酮( f l a v o n e ) 结构的一类化合物【9 】。黄酮类化合物中仅有羟基存在的称为苷元，化合物连接有糖基的 称为黄酮苷。 黄酮类化合物是在植物中分布最广泛的一类物质，几乎每种植物体内都有，它们常 以游离态或与糖结合成苷的形式存在，它们对植物的生长、发育、开花、结果以及抵御 异物的入侵起着重要的作用。由于其分布广泛且部分化合物在植物的含量较高，而且多 数化合物易以结晶的形式获得，所以它们是较早被人们发现的一类天然产物。黄酮类化 合物广泛存在于植物界一尤其在双子叶植物中更为常见，低等植物中却很少见。含黄酮 类化合物的中草药很多，它们分布在植物的各个部分，在花、叶、果、心材中较多。 1 3 2 2 基本结构和分类 黄酮类化合物的结构如下： 4 第一章综述 o 2 一苯基色原酮色原酮 o 天然黄酮类化合物母核上常有o h 、o c h 3 等取代基。黄酮类化合物的结构类型 较多，如：黄酮类化合物中仅存在羟基的为苷元，化合物连接有糖基的称为黄酮苷，但 基本都以c 6 c 3 c 6 为主骨架，不同之处有中间三个碳原子的不同氢化程度，苯取代 的位置以及y 一吡啶环的开环等等的异构变化。化妆品中用入的黄酮类化合物主要为以 下类型：黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮、双黄酮、黄烷醇、异黄酮、 花色素等。在植物体中往往与糖苷结合成苷的状态。 1 3 2 3 黄酮类化合物的清除自由基和抗氧化作用 黄酮类化合物抗油脂过氧化的活性在2 0 世纪6 0 年代就已经被证实，由于许多黄酮化 合物都有3 一羟基4 - 一羰基、5 一羟基4 一羰基或连二酚羟基的结构，这样的结构可以 通过与金属离子相鳌和而具有显著的抗氧化性，所以认为它是作为一级抗氧化剂而起作 用的。2 0 世纪8 0 年代以来，对黄酮类化合物的研究逐渐转向其对活性氧自由基的清除及 老年病的防治功效上。最近就有报道称，黄酮类化合物( 黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷 酮醇、异黄酮和异黄酮醇等) 以及黄酮类化合物的前体物( 酚酸和儿茶酸等) ，作为一 类天然抗氧化剂在不久的将来可能最有希望在商业上得到开发利用1 1 引。 1 3 2 4 黄酮类化合物在化妆品中的应用 黄酮类化合物的清除自由基和抗氧化作用是其许多生理活性的基础。许多病理现 象，衰老，突变、炎症等都与氧自由基有关，黄酮类化合物的抗自由基作用，与脂肪氧 合酶中的金属离子螯合，从而与酶活性被抑制有关。 社会各方面的发展和进步伴随着中老年人口的快速递增，这预示着未来若干年内与 增龄相关的皮肤问题会越来越多，皮肤老化现象也会越来越普遍。因此，皮肤的老化作 为人类衰老的一种外部特征和表现已经成为美容界关注的焦点，延缓皮肤老化的研究仍 将是人类社会永恒的主题之一，也是未来世界美容及化妆品发展潮流中的主流之一。2 0 世纪，皮肤学、药理学、生理学、生物学等渗透到化妆品科学中，高安全性并具有一定 生理功能的化妆品逐步被消费者接受。2 1 世纪的化妆品是2 0 世纪的延伸，将进入化妆 品与使用化妆品的人类相互融合的人类科学阶段，将融和近代多学科的高科技成果，而 顺应世界化妆品的发展潮流，天然安全的功能型化妆品也将成为我国化妆品的发展主 题。天然黄酮类化合物由于具有一级抗氧化性和“绿色 无毒，对人体无害而应用于高 档化妆品中，主要应用于美白、祛斑、抗衰老、防脱发、抑菌、防晒等方面。应用于美 白、祛斑、抗衰老、防脱发主要由于它们的鳌合作用，能与人体内的一些酶的活性中心 的金属鳌合，或者清除反应中产生的自由基中间产物从而使酶无法发挥作用。 江南大学硕：i ：学位论文 1 4 根皮素 ， 根皮素为二氢查尔酮类化合物，存在于植物中，具有弱的雌激素样活性。根皮素是 存在于苹果、梨等水果及多种蔬菜汁液中的天然活性物质，只因在这些植物中的根茎或 根皮中含量较为集中而得名【1 9 】。 根皮素属于二氢查尔酮类化合物，由于二氢查尔酮类化合物具有独特的生物活性， 国外的研究者对这一类化合物也非常关注，很早就开始研究它们在医疗保健和食品添加 剂使用方面作用，并通过研究化合物结构与疗效之间的关系来研制开发新的药物，而研 究其在生物体内的作用机理和代谢过程也在进行之中。 1 4 1 根皮素在医疗保健中的应用 ( 1 ) 抗突变作用 根皮素能激活蜂窝蛋白激酶，对细胞无序增生有疗效，是食品中的抗诱变因子，可 用于皮肤癌及其他肿瘤的治疗口0 1 。张凯2 1 1 等人研究了根皮素的抗肿瘤活性，发现对谷胱 甘肽s 一转移酶( g s t ) 有一定的抑制作用。g s t 是在人体解毒过程中有重要作用的多功能 酶，可催化外源亲电性物质与谷胱甘肽发生亲核性作用，某些肿瘤细胞中含有的g s t 活 性很高，使具有亲电作用的抗肿瘤药的药效降低2 2 】。 ( 2 ) 抗氧化作用【2 3 】 根皮素有极强的抗氧性，对油脂的抗氧化浓度在1 0 3 0 p p m 之间【2 4 】，可清除皮肤 内的自由基，而自由基是由氧化反应产生的对身体有害的物质，与人体退化性疾病有关； 外用能阻止糖类成分进入表皮细胞，从而抑制皮腺的过度分泌，治疗分泌旺盛型粉刺； 另外还有抗糖尿病、抗帕金森病等作用。 1 4 2 根皮素在化妆品中的应用 国内外研究表明，根皮素能抑制黑色素细胞，对各种皮肤色斑有作用，与同类天然 成分熊果苷、曲酸相比，同等浓度的根皮素的酪氨酸酶抑制效果最好，并且当与熊果苷 和曲酸复配时，可以大大提高产品对酪氨酸酶的抑制效果，使抑制率达到1 0 0 乜6 1 。 在这里简单介绍一些国外最新发表的几篇添加了根皮素的功能型美容化妆品极其 功效的专利。 ( 1 ) 皮肤美白 研究表明，根皮素具有抑制黑色素细胞活性，对各种皮肤色斑有淡化作用2 5 1 。其对 于酪氨酸酶的抑制率优于熊果苷，等同于曲酸，但没有曲酸的副作用，是一种非常安全 有效的祛斑美白剂【2 6 】。 ( 2 ) 皮肤保湿 根皮素具有非常好的保湿作用，能吸收本身重量的4 5 倍水分。 ( 3 ) 皮肤促渗剂 根皮素是一种非常安全有效的透皮促渗剂，能促进配方中其他功能因子的吸收利 用，使其发挥出更好的功效。 6 第一苹综述 ( 4 ) 防脱发 d u r a n t o n 口3 等人的研究表明，大豆脂肪氧合酶抑制剂可以抑制毛发过早进入衰老而 脱落，而我们的研究又表明根皮素具有良好的l o x 抑制效果，因此，根皮素又是一个良 好的防脱发剂。 1 5 结论和立题依据 功能性化妆品主要是添加能够有效防止外界有害物质侵蚀的保护物，如各种植物和 生物活性剂化妆品、胶原蛋白、透明质酸、泛醇、天然保湿因子( n m f ) 、维生素( e 、 c 、a ) 、海藻提取物、动物腺和血清提取物、( 脂苷和神经酰胺) 等各种植物提取物和 生物制剂的应用。已被证实能有效抗氧化、增强细胞新陈代谢、保湿、嫩化皮肤、祛斑、 防晒等功效，而且极其安全无副作用。这些物质的研制、生产及其应用研究采用了许多 如医学、生物工程学等高新技术。因此，现代化妆品已不再是简单的轻工业和精细化工 产品，而是兼容了生理学、医学、药学、生物工程学的科技成果。这种利用多学科高新 技术研制的天然功能性化妆品代表着化妆品的发展方向，是当今最新的化妆品。 传统上，只在化妆品配方中加入少量植物性药物来防止那些可能发生的配方问题。 新技术已露端倪，已经可以获得高浓度或化学纯的植物性药物，既可满足配方中少量使 用的要求，又能显著提高化妆品的效力。例如可以从s a b i n s a 得到仅含1 迷迭香酸但有 1 0 含量的迷迭香提取物，其相当于仅有0 1 迷迭香酸( 9 0 纯) 的配方的抗氧化剂活 性。这些抗氧化剂已经得到公众的认可。 人之所以会逐渐衰老，其原因之一就是机体在进行一系列氧化代谢的同时，不断的 产生自由基，过剩的自由基可作用于血液、细胞、组织灯脂类物质，使其变成脂质过氧 化物，这些过氧化物沉积在细胞壁上，是细胞壁散失功能，造成细胞活力下降，组织器 官功能衰退，机体进入衰老状态。黄酮类化合物在抗氧化反应中能消除链引发阶段的自 由基，也能直接捕获自由基反应链中的自由基，通过酚羟基阻断自由基链反应。脂肪氧 合酶参与机体内脂肪酸的氧化过程，其代谢产物中含有活性氧和氧自由基，对细胞膜具 有破坏作用，抑制其活性就可以达到延缓衰老的目的。 鉴于以上所述，本文将在提取脂肪氧合酶的基础上，选择几种化合物对其性质做相 应的研究，并尝试人工合成根皮素。通过根皮素本身具有的良好的药理性能来更加广泛 的提升功能性化妆品在日常生活中的地位，为化妆品中原料的功能筛选提供理论依据。 同时，选用了八种典型的黄酮类化合物，测定它们对大豆脂肪氧合酶的抑制作用效 果，对结果进行比较研究，可以初步探讨黄酮类化合物对大豆脂肪氧合酶抑制效果的活 性一结构关系，为进一步开发与利用黄酮类化合物提供新的资料。 江南人学硕：上学位论文 第二章根皮素的合成 根皮素( p h l o r e t i n ) 是一种二氢查尔酮化合物。根皮素是国外新近研究开发出来的 一种新型天然皮肤美白剂，主要分布于苹果、梨等多汁水果的果皮及根皮。能抑制皮脂 腺的过度分泌，用于治疗分泌旺盛型粉刺；能抑制黑色素细胞活性，对各种皮肤色斑有 作用。与同类天然成分熊果苷和曲酸相比，同等浓度的根皮素对酪氨酸酶的抑制作用要 好于它们，并且当其与熊果苷和或曲酸进行复配时，能大大提高产品对酪氨酸酶的抑制 率，使抑制率达到1 0 0 。因此，开发根皮素具有很好的市场前景，但其在花红根中的 含量很低，提取成本很高，市场上销售的都是提取物，价格为1 0 0 0 0 元公斤左右。在合 成方面，局限于实验室制备以研究其药效，还没有将其工业化。 根皮素可从石柯属植物( l i t h o c a r p u sl i t s e i f o l i u s ) 中提取。取其叶用甲醇热回流，提 取液滤清后浓缩至一干糖浆状物，然后加水使溶解，用正丁醇作两相萃取数回，合并正 丁醇，减压除去溶剂后为根皮素粗制品，与之伴存的为另一种查尔酮化合物( t r i l o b a t i n ) ， 它的药效与根皮素相同。 根皮素有抗肿瘤活性1 2 ，亦可用于皮肤癌的治疗；可阻止葡萄糖进入表皮的皮脂 细胞，如用1 2 的根皮素的醇溶液( 丙二醇：乙醇：聚乙二醇2 0 0 = 5 5 ：1 0 ：2 5 ) 擦拭几分 钟，皮脂的分泌可减少9 0 ，适合用于治疗因皮脂腺分泌过多引起的痤疮；根皮素对人 体磷酸化酶、脱氢酶系统有阻碍作用，在面部用品中使用可抑制黑色素的形成，减淡茶 褐色、灰色瑕斑和雀斑的色泽：有明显的抗氧化性。 文献和专利报道的合成根皮素的路线有：v i d a v a l u rs i d d a i a h 等人用间苯三酚和对羟 基苯丙酸在b f 3 e t 2 0 为催化剂的条件下合成，产率为3 0 1 2 8 1 ；具体合成路线如下： 0 i t o h 鲤3z 堡0 p 本实验室贾爱群等问苯三酚和茴香醛为起始原料，经酰化反应，缩合反应，酯化反 应，加氢还原反应和f r i e s 重排反应制得根皮素，总产率为1 2 6 4 t 2 9 】。 上述两条合成路线都存在不足之处，前者反应原料简单便宜，但副反应多，羟基需 要保护；后者路线较长，所用原料毒性太强，不利于后续根皮素在临床及化妆品中应用， 且后者反应路线涉及到加氢，设备投资高，危险性大。 本论文参考前人的研究成果，从价廉的化工原料出发，参考相关文献资料，对根皮 素进行全合成。 五 2 1 合成路线设计 邺。驴：嚣：酱即。口c 骺： 8 第二章根皮素的合成 哪。寸c ( 要竺 ( 3 ) h 3 c 等h ，c 。叫。h 曷鉴1 一 o h 羔kh 3 c o 飞_ 人 c i _ 亨 、 c 掌v o ho h + h 舯o c o 吨三麓_ 邺。g 削- 0 段。盆v r i e s 珊ho o q 2 2 试剂及仪器 主要试剂 丙二酸二乙酯 对甲氧基苄氯 三氟化硼乙醚溶液 间苯三酚 硝基苯 氮气 四氯化碳 吡啶 无水三氯化铝 分析纯 工业级 分析纯 工业级( 含水2 ) 分析纯 工业级 分析纯 分析纯 分析纯 薄膜层析用聚酰胺薄膜 主要仪器 g s l 2 _ 2 电子恒速搅拌器 j a 10 0 3 电子天平 r 2 0 1 旋转蒸馏仪 w r s 一1 a 数字熔点仪 f t l a 2 0 0 0 - - 10 4 型红外光谱仪 t u 1 9 0 1 双光束紫外可见分光光度剂 2 3 对甲氧基苯丙酸的合成 o h 素 中国医药集团上海化学试剂公司 江苏丹阳海峰化工有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 北京维达化工有限公司 上海化学试剂有限公司 中国华晶电子集团动力工厂 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海金山区兴塔华工厂 台州市路桥四青生化材料厂 上海医械专机厂 上海精密科学仪器有限公司 上海申科机械研究所 上海精密科学仪器有限公司 加拿大b o m e n 北京普析通用仪器有限公司 由于丙二酸二乙酯分子中活泼亚甲基上的氢原子易被其它基团所取代，可以进行烷 基化、羟烷基化和酰胺化等多种取代反应，进而合成许多产物。所以，丙二酸二乙酯是 一种极为重要的精细有机化工原料，广泛应用于医药、染料和香料等工业。由于丙二酸 二乙酯特殊的结构，丙二酸二乙酯的碳负离子易于形成，相邻的两个羰基吸电子基团使 9 江南大学硕十学位论文 中间的亚甲基酸性增强，亚甲基上的氢可被金属钠取代，而酯基本身不稳定，易于脱羧， 水解后生成丙二酸这一步合成中利用乙醇钠的乙醇溶液来活化丙二酸二乙酯分子中活 泼亚甲基上的氢原子，然后经过水解、脱羧得到对甲氧基苯丙酸。 2 3 1 反应方程式 驴口筘箸o 篙等邺。妒h 辜要：兰； o o 。 邺。c p h ：要：兰：告邺。h 2 3 2 实验步骤 2 5 0 m l 三颈圆底烧瓶上接带有干燥管的球形冷凝管，量取8 0 m l 乙醇倒入2 5 0 m l 三颈圆底烧瓶中，快速称取2 6 5 9 ( 0 1 1 3 m 0 1 ) 钠块放入乙醇中制取乙醇钠。在8 0 。c 下 边搅拌边缓慢滴加1 9 1 3g ( 0 1 1 9 m 0 1 ) 丙二酸二乙酯至三颈圆底烧瓶中，控制滴加速度， 用l h 滴完。滴完后再在8 0 。c 下继续搅拌半小时。然后快速量取1 8 0 1 9 ( 0 11 5 m 0 1 ) 对 甲氧基苄氯，在8 0 。c 下边搅拌缓慢滴加到混合物中。滴加完毕后用t l c 跟踪反应( v 石油醚：v 乙醚= 1 ：l 作展开剂，对甲氧基苄氯r f = o 6 6 ，产物r f = o 5 5 ) ，反应结束后， 常温搅拌过夜。把混合物倒入圆底烧瓶中，减压蒸馏除去混合物中的乙醇。在1 2 0 下， 把减压蒸馏后的混合物滴加到8 0 m l 2 0 的n a o h 溶液中，用4 5 m i n 滴完，除去反应中 产生的乙醇。反应过程中用t l c 跟踪反应( v 石油醚：v 乙醚= 1 ：l 作展开剂) 直到酯 点消失，6 小时后停止反应，冷却过夜。在冰浴体系中滴加浓盐酸至混合溶液中，直至 p h 为酸性，析出大量固体。抽滤得固体，在1 4 0 。c 酸性条件下脱羧，直至无c 0 2 放出。 所得粗产品用5 0 乙醇水溶液重结晶，得到对甲氧基苯丙酸。 2 3 3 实验优化 为了找到合成中间体对甲氧基苯丙酸的最佳条件，对反应的许多条件如对甲氧基苄 氯与丙二酸二乙酯的物料比，都进行了探索和尝试。其中滴加丙二酸二乙酯的速度，滴 加对甲氧基苄氯时的反应温度，反应完毕后是否除尽混合物中的乙醇，在n a o h 中水解 的温度，脱羧的适合温度等反应条件都进行了大量的摸索和尝试。 ( 1 ) 取代反应温度 表1 取代反应温度对反应的影响 t a b 1i n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r et ot h es u b s t i t u t i o nr e a c t i o n 注：反应其他条件：n ( 丙二酸二乙酯) ：n ( 对甲氧基苄氯) = l ：1 ；阴性为t l c 只有苄氯点，阳性为 l o 第二二章根皮素的合成 注：反应其他条件：n a o h 浓度= 2 0 ； ( 3 ) 脱羧反应的温度 表3 脱羧反应温度因素优化表 t a b 3i n f l u e n c eo ft e m p e r a t u r et ot h ed e c a r b o x y l a t i o n 注：反应物为水解所得的二酸，特征反应阴性表明无c 0 2 气体放出，阳性为有c 0 2 放出； 对以上的各个条件进行试验，分别摸索最适合的条件。并结合在实验中的一些操作 经验，进行了最佳实验验证，最终对甲氧基苯丙酸的得率为6 2 8 8 。 2 3 4 产品的鉴定与性能测试 ( 一) 熔点产品： 通过对所得产物的熔点分析，实验得对甲氧基苯丙酸的熔程范围为1 0 2 2 一 1 0 2 6 。与文献值1 0 0 一1 0 4 相符。 ( 二) 红外分析( k b r 压片) ( 产品的红外测试结果见附图1 ) 与文献图谱基本一致( 文献图谱见附图2 ) 1 3 0 1 表4 目标产物红外解析 t a b 4a n a l y s i so ft h ep r o d u c ti n f r a r e ds p e c t r u m ( 三) t l c 检识 反应过程中，采用湿法