（高分子化学与物理专业论文）光化学合成纳米凝胶及其应用研究.pdf

华东师范大学硕士学位论文 摘要 本文以无毒金属离子为自组装纳米相诱导剂，使水溶性聚合物预聚物分子，在 光致抽氢剂作用下发生纳米尺度的交联反应，合成粒径小于1 2 0n m 且可控的新型 生物医用纳米水凝胶。主要研究内容如下： 论文首先选择水溶性聚乙烯亚胺( p e i ) 预聚物为高分子原料，优化筛选无毒金属 离子为诱导剂。 实验中我们选择了c u 2 + ，f e 2 + ，f e 3 + ，z n 2 + 等金属离子与p e i 络合，结 果表明无毒的f e 2 + 能与p e i 预聚物能很好的配位，并能形成粒径分布较均一的p e i 纳 米凝胶。通过调节预聚物与诱导剂的摩尔比，可以控制其粒径在3 0 8 0n m ，且该纳 米凝胶在水溶液中较稳定；研究了预聚物浓度，反应温度，反应时间等因素对合成 p e i 纳米凝胶的影响；同时我们还研究了同一金属离子，不同阴离子对制备p e i 纳米 凝胶的影响。用d l s ，a f m ，s e m ，t e m ，u v 等现代测试分析技术对其形貌和结构进行 了系统的表征，用x p s 确认为目标产物。z e t a 电位测试结果表明，所得纳米凝胶具 有较高的正电势，因此与质粒e 帆能通过静电相互作用形成纳米复合物。基因转染 实验表明，用p e i ( 2 5k ) 做阳性对照，该纳米复合物具有良好的转染效率，而且细胞 毒性较低。由于离子诱导自组装所得到的纳米凝胶，从其机理分析，其结构相对疏 松，因此我们利用光化学法合成高稳定p e i 纳米凝胶，通过选择合适的光源，光照 强度，光致抽氢剂的量，光照时间等，最终制得了粒径分布均一、大小可控且结构 相对紧密的p e i 纳米凝胶。以光化学法合成聚乙烯亚胺预聚物纳米凝胶为主要模型， 我们推广到以苯乙烯马来酸酐( s m a ) 等为预聚体，对制备其纳米凝胶进行设计与 合成，并用1 h n m r 、m 证实了其结构。 关键词：聚乙烯亚胺，离子诱导，自组装，苯乙烯马来酸酐，基因载体 华东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t n o v e ln a n o g e l sw i t hs i z eb e l o w12 0r i l li nd i a m e t e rw e r ep r e p a r e db yu s i n g p r e p o l y m e r sa n dn o n t o x i c m e t a li o ni na ne m u l s i o n f r e e a q u e o u s s o l u t i o nv i a p h o t o c r o s s - l i n k i n gm e t h o d t h er e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： t h ew a t e r - s o l u b l ep o l y e t h y l e n i m i n ef p e i ) n a n o g e l sw i t hn a r r o wp a r t i c l e ss i z e d i s t r i b u t i o n sw e r ep r e p a r e df r o mp e i p r e p o l y m e r s v af e r r o u si o n i n d u c e ds e l f - a s s e m b l y m e t h o da tr o o mt e m p e r a t u r e t h ec h e l a t i o no fp e lw i t hs o m em e t a li o n s ( c u 2 + ，f e 2 + ，f e ”， z n 2 + ) w a ss t u d i e db yd y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ( d l s ) 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ep e l w a st o t a l l yc h e l a t e dw i 廿1f e r r o u s t h en a n o g e ls i z e sc a nb ec o n t r o l l e df r o m3 0n 1t o8 0 n n li nd i a m e t e rb ya d j u s t i n gt h em o l a rr a t i o so fp r e p o l y m e r st of e r r o u si o n s ，t h en a n o g e l e x h i b i t e dag o o ds t a b i l i t yi na q u e o u sm e d i a t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so fp r e p a r i n gp e i n a n o g e l sw e r ea l s os t u d i e d ，s u c ha sp r e p o l y m e rc o n c e n t r a t i o n ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ， r e a c t i o nt i m ea n dd i f f e r e n ta n i o n s t h es t r u c t u r ea n ds h a p e so fn a n o g e l sw e r ec h a r a c t e d b y d l s ，a f m ，s e m a n d x p s 。 t h en a n o g e l ss h o w e dh i g hz e t ap o t e n t i a l s ，a n dc o u l df o r mn a n o s i z e dc o m p l e x e s w i t hp l a s m i dd n a c o m p a r e dw i t hp e l 2 5 k ，n a n o g e l se x h i b i t e dg o o dt r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c i e sa n ds i g n i f i c a n t l yl o wc y t o t o x i c i t y a b o v er e s u l t sc l e a r l yd e m o n s t r a t e dt h e a d v a n t a g e so f t h ep e in a n o g e l so v e rp e i ( 2 5 k ) ，a n dt h e i rp o t e n t i a lu s ea sg e n ec a r r i e r s b e c a u s et h es t r u c t u r eo fn a n o g e l sw a f tr e l a t i v e l yu n s t a b l e ，t h eh i 曲s t a b l en a n o g e l s w e r ep r e p a r e db yp h o t o c r o s s l i n k i n gm e t h o d a tl a s t , t h eh i g hs t a b l en a n o g e l sw i t h n a r r o wd i s t r i b u t i o n sw e r eo b t a i n e db ys e l e c t i n g p r o p e r r a d i a t i o ns o u r c e ，r a d i a t i o n i n t e n s i t y , a n dr a d i a t i o nt i m ea n ds oo n i ng e n e r a l ，t h ep e in a n o g e lp r e p a r e db y p h o t o c r o s s l i n k i n gm e t h o dw e r eu s e da sn a n o g e ls t u d y i n gm o d l e ，w ee x t e n d e dt h a tt h e c o m p o s i t ed e s i g no ft h en a n o g e lw a sf r o ms t y r e n e m a l e i ea n h y d r i d e ( s m a ) p r e p o l y m e r , w h i c ht h es t r u c t u r ew a sc o n f i m e db y1 h n m r 、i rs p e c t r u m k e yw o r d s ：n a n o g e l s ，i o n - i n d u c e ds e l f - a s s e m b l y , p o l y e t h y l e n i m i n e ，s t y r e n e - m a l e i ca n h y d r i d e ，g e n e c a r r i e r s i v 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用 本规定。 学位论文作者签名：主欠i 京文、参导师签名：等亏名 日期：碰丝：么兰 华东师范大学硕士学位论文 高分子纳米凝胶的研究进展 1 1 1 聚合物功能材料的发展 第一章绪论 高分子材料作为材料领域的_ 员，与人类文明进步息息相关。自从1 9 2 0 年， s t a u d i n g e r 首先提出高分子的概念以来，高分子作为一门学科得到了很快的发展。 随着聚合方法的发现，加上有关高分子理论，物理和工程的巨大进展，导致并推动 了一场材料革命。到了七十年代，主要在提高产量、改进性能、发展工作等方面。 在高分子科学发展史上，s t a u d i n g e r 、f l o r y 、z e i g l e r 、n a t t a 和日本的白川教授等， 因为在高分子科学发展上的杰出贡献，先后获得诺贝尔奖金【1 五】。 2 1 世纪来临之际，随着生产和科技的发展，高分子科学及其相关技术面临着新 的机遇和挑战，不断对材料提出各种各样的要求，主要在以下几个研究领域：高性 能化、高功能化、复合化、精细化和智能化。这些领域在实际中已有了应用，并正 成为许多科学工作者崭新的研究课题。尤其是生物医用高分子功能材料的研究，近 年来，人们先后研究成功一些高分子功能材料，并用来修复或替代某些器官，起到 了很好的效果，这类高分子称为医用功能高分子。医用功能高分子必须具有与所修 复或代替的人体器官相似的功能【3 卅。其中，主要集中在组织功能材料和药物输送的 载体材料的研究，相信在不远的将来，这些材料将进入到我们的生活中。 1 1 2 纳米技术的发展 纳米技术是2 0 世纪8 0 年代末期诞生并迅速崛起的用原子和分子创制新物质 的技术，它以许多现代先进科学技术为基础，是现代科学( 量子力学、分子生物学等) 和现代技术( 微电子学技术、计算机技术、高分辨显微技术、核分析技术等) 结合的 产物( 5 】。纳米技术是研究尺度范围在0 1 1 0 0n l i l 之间的物质的组成，这个极其微小 的尺度，正好是原子和分子的尺寸范围，也是它们相互作用的尺度。在这样的一个 尺度空间，由于量子效应、物质的局域性及巨大的表面和界面效应，使物质的很多 性能发生质变。这些变化渗透到各个工业领域后，将引导一轮新的工业革命。纳米 华东师范大学硕士学位论文 技术所追求的最终目标，正像f e y n m a n 当年预言的那样，就是要使人类能够按照自 己的意愿任意地操纵单个原子和分子，并在对自然界物质的本质进行深入探讨和研 究的基础之上，按照人们的期望，在原子和分子的水平上设计和制造全新的物质。 纳米技术在不断渗透到现代科学技术的各个领域的同时，形成了许许多多的与纳米 技术相关的新兴学科，如纳米医学、纳米机械学、纳米化学、纳米电子学、纳米材 料学、纳米生物学等。在肿瘤临床治疗方面，利用纳米粒子的独特性质对肿瘤的早 期诊断和对是否全身转移的诊断较现有方法敏感度大大提高，以纳米材料作为药物 和基因载体克服了药物本身和病毒载体的些不足，已成为纳米生物学研究的热点 6 - s 。 1 1 3 凝胶及凝胶现象 凝胶是一种介于固体和液体之间的能够保持一定形状的物质。凝胶不但体系复 杂，而且种类很多。著名化学家l l o i d 早在二十世纪7 0 年代就曾提出：凝胶是一种 很容易被辨认出来但难以定义的物质，聚合物凝胶现象备受科学家韵关注，f l o r y 认 为聚合物网络通过聚集形成，但必须具有某种连接的结构。x i a 等将聚合物的形成 分成三种可能一 生1 9 - 1 0 。尽管在凝胶的研究过程中科学家给其下个明确的定义，但一 直到上个世纪9 0 年代，a e u e r t j - 在他的一篇论文中给出了一个较为全面的定义：凝 胶是一种包含液体，能够自我维持比较稳定的分散体系，单链或大的分子聚集体构 成了其中的连续的网络状结构【1 1 】。 由此可见，凝胶是一个具有丰富内涵和复杂定义的物质。正因为如此，给凝胶 一个十分明确的分类也很困难。a k e l l e r 根据凝胶的连接点的形成将其分为化学凝 胶和物理凝胶【1 1 】。化学凝胶就是通过化学作用形成化学键，其中的交联点就是凝胶 的连接点，化学凝胶大多是通过化学反应而得到的；物理凝胶的不同，主要通过界 面作用、缔和作用、配位作用和电荷作用等非化学键键合而形成的铰链点。物理凝 胶由于其分子间的作用力为非化学键，也就是非永久性作用，所以一般认为是可逆 的，可以通过外界的作用如温度、p h t 直、溶剂或者其他因素加以控制。但实际上， 一些物理凝胶在一定的范围内不可逆，化学凝胶一般情况下均为非可逆凝胶。另外， 按凝胶所在的介质不同，可将其分为水基聚合物凝胶和非水基聚合物凝胶；按照凝 2 华东师范大学硕士学位论文 胶粒径大小可以将凝胶分为微凝胶，粒径范围在微米级；毫微凝胶，粒径在1 0 0a m 和1 微米之间：纳米凝胶，就是粒径小于1 0 0n l t l 的凝胶。 凝胶及其现象普遍存在，尤其是在自然界中，生命有机体的大部分是由含水的 凝胶状物质组成。凝胶的结构复杂、构造独特，在生物模拟，仿生等方面的理论研 究和实际应用具有重大意义，科学家们对此领域的研究和发展日益关注1 1 2 】。目前， 凝胶材料已在吸水材料、食品工业、医用材料等应用领域进入了商业化生产阶段。 相信随着研究的不断深入、研究范围的不断扩大，凝胶材料在未来的应用前景将更 加广阔。 1 1 4 聚合物凝胶国内外研究进展 聚合物凝胶作为凝胶材料中及其重要的一员，因其特殊的结构和性能被广泛 研究。研究凝胶材料的结构、特性和生理功能，可以从研究聚合物凝胶的合成机理 和物理结构特性着手。近几年，科学家对智能水凝胶与纳米凝胶的自组装与超分子 结构等方面的前沿基础研究已经蓬勃展开，该领域的研究已成为高分子与其他学科 交叉研究的最为活跃的方向之一。 19 9 2 年著名凝胶专家，m i t 的t a n a k a 在n a t u r e 上发表了一篇关于聚酰胺凝胶具 有收缩功能所形成图案化现象，并指出温度和溶剂等外界因素的改变会引起凝胶体 系的连续和非连续的体系相转变，凝胶表面的图案化产生正式这种相转变所致 1 3 q 5 。美国的胡志兵教授等先后在s c i e n c e 、n a t u r e 上发表文章，介绍了聚异丙基丙 烯酰胺( p n i p a m ) 与对丙酮浓度敏感的聚丙烯酰胺凝胶加以巧妙的结合，合成一种形 状记忆凝胶与智能凝胶手【1 6 1 。1 9 9 8 年他们又提出一种新思蹦1 7 ，】：利用聚异丙基丙 烯酰胺对外界环境的敏感性来控制凝胶表面的图案化的形成。s a u n d e r s 等对最近几 年微凝胶的研究作了较为全面的概述【1 8 】，其中详细介绍了合成、应用，尤其是生物 医学应用微凝胶粒子的特性和相关表征等。x w h 等【”】在他们的一篇文章中系统研 究了微凝胶的形成过程动力学，而m c p h e e 等【19 】则全面的研究了微凝胶在合成过程中 粒径与乳化剂的关系，得到了与x w u 相似的结果。k i m i n t a 教授等【2 0 】研究了热敏微 凝胶在温度变化过程中体积变化等相关流体性质，当温度从6 5 c 降到2 5 时，它 的体积最大可以增大1 0 0 0 倍左右，相关粘度等也随之发生变化。s u z u k i 掣1 3 在n a t u r e 3 华东师范大学硕士学位论文 上发表一篇关于光响应凝胶的合成思路及光响应特性研究论文，这种微凝胶对特定 波长的光( 4 8 8n m ) 敏感a 光响应单体吸收光能并将光转化为热能，由此导致微凝胶 的体积转变。j u o d k a z i s 等【2 l 】研究了直接利用激光就可以使凝胶的体积发生变化，并 预言这种凝胶将在电子行业、复杂环境下的机械操作等方面具有潜在的应用价值。 c h e n 等瞄】系统研究了不同水凝胶对温度、化学环境、电场等的刺激响应性，并综述 了各种响应凝胶的应用方向。国内姚康德教授等【2 3 】以f l o 科理论探讨了智能水凝胶的 刺激响应性，并采用天然高分子如壳聚糖等合成一些新型的智能水凝胶。卓仁喜等 【2 4 】综述了水凝胶的制备及其在固定化酶、免疫检测和药物控释等生物材料领域的应 用。何庆等【2 5 】系统介绍了响应性凝胶的种类、结构、特点和响应机理。以及响应性 凝胶在药物控释上的应用。李方等【2 6 】介绍了壳聚糖基智能凝胶材料及其在药物载体 和基因治疗方面的应用。 随着研究的深入，科学家们对凝胶、特别是微凝胶的研究逐步涉及到微观结构、 体积相转变过程以及有关合成机理等方面。香港中文大学的吴奇教授等 2 7 - 2 9 】利用光 散射和小角度中子散射技术系统地研究了智能纳米凝胶的合成、微凝胶在变化过程 中的流体力学性质、单链高分子及微凝胶在溶液中分子聚集态，以及在外界条件变 化时聚集态变化过程。l i n 等【捌研究了干燥方法对凝胶粒子大小，相转变过程和凝 胶中子形态学等方面的影响。他们通过快速冷冻、慢速冷冻和真空干燥三种方法研 究发现，不同的方法会影响微凝胶的相变体积、粒径的大小和形态，但不会影响其 最低临界溶解温度。l e e 等【3 l 】利用中子散射和反射技术研究了聚合物微凝胶与其表 面的乳化剂之间的相互作用，揭示了微凝胶的稳定性、相转变及其过程、凝胶的形 成和单分散性等都与聚合物表面的乳化剂有关。g r o w t h e r 等【3 2 1 运用小角度中子散 射技术研究微凝胶粒子在最低临界溶解温度附近的溶胀和收缩过程，以及该过程中 微凝胶的体积等各种性质的变化。中国科学院上海应用物理研究所王文峰等【3 3 j 用原 子力显微镜首次观察了纳米凝胶的微观型貌，并研究了微凝胶在体积相转变过程中 的微观结构上的变化。 总之，由于微凝胶在生物医学、材料学、基因工程等方面具有很广阔的应用前 景，科学家对凝胶材料的研究不断深入，研究方法和理论也在不断发展，而且人们 对智能化、结构可控、体系组成简单、粒径较小的凝胶研究兴趣日益增强。 4 华东师范大学硕士学位论文 1 1 5 聚合物纳米凝胶的制备方法 为了获得粒径分布均匀的纳米凝胶，科学家们采用了许多制备纳米凝胶的方 法。如：嵌段共聚物的选择溶剂法；溶剂挥发、萃取法；微乳液聚合法；辐射沉淀 聚合法；高分子稀溶液辐射法，自组装方法，原子转移自由基聚合的方法等1 3 4 - 3 9 1 。 其中，用得比较多的方法即是以水溶性烯烃类不饱和化合物为单体，在表面活性剂、 引发剂等助剂存在下，通过乳液聚合等方法得到，这种方法得到的纳米凝胶粒径一 般在2 0 0n l t l 以上，粒径分布较宽 4 0 4 1 1 。d e s i m o n e 等以丙烯酸酯类为单体和交联剂， 改用反相乳液聚合工艺，得到了粒径分布均匀，且粒径在4 0 2 0 0n m 可控的聚阳离 子基因载体纳米凝胶【4 2 1 。但在这种乳化体系中制备的纳米凝胶，其型貌均为规则的 球形，所用单体只能为不饱和烯类单体，且制备过程中需使用大量的引发剂和表面 活性剂，这些有毒化学物质在反应完成后很难去除干净，有毒残留物的存在严重影 响纳米凝胶的生物相容性。波兰u l a n s k i 的研究小组发展了一种用脉冲高能量电子 作用于水溶性高分子的极稀溶液制备聚合物纳米凝胶的方法【4 3 4 5 1 。他们将脉冲高能 量电子作用于水溶液高分子的极稀溶液，使水辐射产生大量的羟基自由基，羟基自 由基抽去高分子链上的氢，使高分子链瞬间产生大量的自由基。由于高分子溶液的 浓度极稀，主要发生高分子链内的自由基相互偶合而形成纳米尺度的凝胶。这种方 法的优点在于：制备过程中不需使用有毒的单体、引发剂、有机溶剂和表面活性剂 等化学物质，所得到纳米凝胶非常纯净，适合用作生物医用材料；而且，可通过调 节所用水溶性高分子的分子量及分子量分布来调控纳米凝胶的粒径和粒径分布。但 这种方法所采用的脉冲高能量电子难以获得，所得到的纳米凝胶固含量极低，制备 效率低，制备成本较高。 1 2 纳米凝胶在医用载体上的应用 1 2 1 基因载体 基因治疗是一种治疗人类疾病的新方法，是指通过操作遗传物质来干预疾病的 发生、发展和进程，包括替代或纠正人体自身基因结构或功能的错乱，杀死病变的 细胞或增强机体清除病变的能力等，从而达到治疗疾病的目的生物医学高技术 华东师范大学硕士学位论文 f 柑7 】。基因治疗的兴起和发展为人类多种疾病，如a i d s 等的治疗带来了新的希望。 目前基因治疗研究已经广泛应用于遗传病、肿瘤和病毒性疾病，并且取得了一定的 成功，成为生命科学领域的二个研究热点( 4 8 - 5 0 】。然而，世界范围内，基因治疗的临 床实验研究结果尚不令人满意。其中，载体问题，以及与载体相关的免疫反应、细 胞毒性与安全性等问题是基因治疗研究领域亟待解决的最关键问题之一。 目前应用较多的基因治疗载体一般分为病毒载体和非病毒载体两种。病毒载体 主要有逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒 5 l 】等。这些病毒都有各自的特 点，如逆转录病毒只感染那些正在分裂的细胞中，对那些不在分裂期的细胞无感染 性；腺病毒比较容易引起免疫反应等病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有 的感染和寄生特性，已被广泛应用，现有约8 5 的基因治疗临床项目是采用病毒载 体。但是目前研究和应用的载体仍存在许多不足，主要体现在免疫原性高、毒性大、 目的基因容量小，靶向特异性差、制备复杂及成本较高等 5 2 - 5 3 】。非病毒载体因生物 安全性好、低免疫原性，外源基因整合率低、携带基因类型大小不受限制等优点， 越来越受到人们的重视【5 4 1 。常见的非病毒载体主要包括裸d n a ，脂质体，阳离子高 聚物等。 1 2 1 1 裸d n a 将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖其他物质的介导， 是最简单的非病毒载体系统。1 9 9 0 年，w o i f f 首次报道了直接注射质粒d n a 到骨骼 肌肉中，可检测到d n a 的明显表达【5 5 】。此后，有人将裸d n a 作为疫苗注射注射入 动物肌肉组织，通过基因编码产生特异抗原，从而诱导出保护性免疫反应，即为目 前使用的d n a 疫苗 5 6 - 5 8 】。电穿：孑l ( e l e c t r o p o r a t i o n ) 技术和微粒子轰击法的出现，大大 提高了裸e i n a 的转染效率【5 9 1 。最近，y o s h i a k i 等鳓使用高频、低强度的超声波转染 荧光素酶质粒e l n a 到培养的人血管平滑肌细胞和内皮细胞，结果显示，在这两种细 胞的荧光素酶活性显著增加，同样用超声法把抗原癌基因( p 5 3 ) 质粒d n a 转染到勉 颈动脉一治疗血管损伤后再狭窄，结果表明p 5 3 蛋白显著增加，且没有明显的不良 反应。 6 华东师范大学硕士学位论文 1 2 1 2 脂质体 脂质体是2 0 世纪6 0 年代英国学者b a n 曲a m 等将磷脂分散在水中进行电镜观察 时发现并命名的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每一层均为脂质双分子层， 由于它的结构具有类似于生物膜，故又称为人工生物膜。早在1 9 8 7 年，f e i g n e r 首 次报道了利用脂质体可以体外转染培养细胞，二十多年的研究已使该体系取得了重 大进展【6 1 - 6 2 。一般而言，脂质体的内径为0 0 2 5 0 1 微米，而基因d n a 的长径为 2 0 微米。因此，仅少数受损的d n a 质粒才能被包裹，为了提高脂质体的包封率， 人们发展了不同类型的脂质体。 阳离子脂质体是目前最常用的脂质体，阳离子脂质体分子结构上除了胺基基团 外还具有输水基团，如脂肪酸、烷基或胆固醇片段。这种结构使得脂质体能以双分 子膜微泡的形式溶于水中。分子中的氨基是转染所必需的，增加分子中氨基基团的 数量以及氨基与输水基团间距离能增加转染效率【6 “5 1 。 阳离子脂质体可以通过静脉注射全身应用，但是基因表达很短暂，高峰出现在 给药4 2 4h ，且一周内就消失，原因在于复合物颗粒易被从血浆中清除。人们对阳 离子脂质体进行一些修饰，如接入p e g 脂，能增加l i p o p l e x e s 的循环时间；或将电 中性的脂质如d o p e 接到阳离子脂质体上能提高体外转染效率，其机制可能是 d o p e 能协助l i p o p l e x e s 从内吞中逃逸，免遭酶降解。 1 2 1 3 阳离子高聚物 与病毒载体相比，阳离子多聚物载体具有一些优点，如属于非生物材料，没有 免疫原性；无遗传毒性与明显细胞毒性，在转染浓度范围内不会导致细胞的转化与 细胞死亡。根据多聚物的生物特性，可将阳离子多聚物分成人工合成型和生物型。 常见的人工合成型阳离子多聚型载体有多聚左旋赖氨酸 l l ) 【6 5 。6 7 】，聚酰胺胺星状 树突体( p a m a md e n d r i m e r s ) 6 s - 6 9 】和聚乙烯亚胺( p e i ) 等；天然生物型阳离子多聚物 基因载体主要有壳聚糖及其衍生物和明胶等，这里主要讨论聚乙烯亚胺( p e i ) 。 聚乙烯亚胺 聚乙烯亚胺( p e d 是所有阳离子多聚物中最常用的基因载体，主要有线性及支化 两种结构形式( 如图1 1 ) 。作为基因载体，与聚l 赖氨酸不同的是这种支化或线形p e i 7 华东师范大学硕士学位论文 阳离子聚合物由于其自身内吞缓冲特性，在不需要内吞泡或溶酶体溶解剂的情况下。 显示更好的基因转染效率【7 0 1 。p e i d n a 复合物也需要带正电荷才能与靶细胞表面通 过静电作用继而被胞吞。一般胞吞后3 0 分钟后复合物就进入细胞核，开始转录， 胞内转位及进入细胞核的机理尚不清楚，而且很有可能不同类型的细胞其具体机理 也不同【7 l 】。有研究表明，d n a 进入靶细胞并不一定需要复合物解离阎。 c h 3 一c h 2 - n h - - c h t c h 2 - n h - n c h 2 - c h 2 一n h 2 l i n e r p e i n n 够 絮n 霄h h 2 h 2 n 广洲7 h 峄h 图1 1 线型和支链型p e i 的结构示意图 影响p e i 转染效率的参数很多，主要包括：p e i 的分子量【7 3 7 4 、p e i d n a 复合物 中的n p 【碉、形状与粒径【7 6 】、溶液中离子强度及d n a 浓度等【明。体外实验已经证明 p e i 是一种有效且通用的基因载体，但仍有很多不足之处，主要体现为：p e u d n a 复 合物缺乏特异靶向性，经静脉应用时首先在肺内细胞处沉积、聚集；血浆调理作用 及吞噬细胞使带正电荷的复合物在循环中很快被清除；对细胞有一定的毒性等。 为使p e i 得到更好的应用必须对p e i 进行各种修饰，以期能增加靶向性、延长循环时 间及减轻细胞毒性。近年来，用于对p e i 进行修饰的物质主要有：聚乙二醇( p e g ) 、 壳聚糖等i t s - s o l ；k a l a 型阳离子多肽 8 1 】；半乳糖，叶酸等陷8 3 】；一些靶向配体包括 转铁蛋白、表皮增长因子、抗体等。总之，以p e i 为模板详细研究载体的化学结构 与生物相容性、转染活性之间的关系，有助于设计新的高效低毒的基因转染载体 s 4 - s t 。 8 华东师范大学硕士学位论文 1 2 2 药物载体 药物控制释放方法是从2 0 世纪6 0 年代开始发展起来的，经过半个多世纪的时 间，药物控制释放无论是从方法上还是剂型上都得到了很大发展。尤其是近十年来， 随着各种科学技术的发展，药物控释呈现更为迅猛的发展势头，且其成为国际范围 内研究最热的领域之一【8 8 9 1 。 药物控制释放是指以一定材料包埋药物或其它生物活性剂，以使药物长效释 放，或延长药物在体内循环时间，或使药物响应刺激信号释放。不管是哪种释放， 其目的都是为了提高疗效，同时减少药物服用量过大或过小所引起的副作用。另外， 通过控制药物释放还可将人体药物浓度维持在一个适宜的浓度范围，减少病人服药 次数，并达到最佳疗效嗍。一些研究已经报道【9 l - 9 3 1 ，纳米离子缓释抗肿瘤药物延 长了药物在肿瘤内的存留时间，减慢了肿瘤的生长，与游离药物相比延长了药物在 肿瘤内的存留时间。由于肿瘤细胞有较强的吞噬能力，肿瘤组织血管的通透性也较 大，所以静脉途径给予的纳米粒子可在肿瘤内输送，从而可提高疗效，减少给药剂 量和毒性反应。体内外实验均证明，把亲脂性免疫调节剂胞壁酰二肽及其胆固醇包 裹到纳米胶囊中，其抗转移瘤作用比游离态药物更有效f 9 4 1 。例如，阿霉素a 的聚a - 氰基丙烯酸异丁酯纳米粒子的体内外抗肝细胞瘤效果均明显优于游离的阿霉素 a 9 5 9 6 。 总之，相对于传统给药方式，药物控制释放方法有利于提高药物疗效，降低毒 副作用，可减轻病人多次用药的痛苦，对于提高临床用药水平具有重大意义【97 1 。但 目前，药物控释的研究还不十分成熟，仍然普遍存在着载药量低，载药种类少，药 物控制释放速度还不能完全掌控等特点，且距临床给药还有一段距离。因此，在药 物控制释放领域还有巨大的研究和发展空间，相信未来的发展前景会越来越好。 1 3 研究课题的提出 聚合物纳米凝胶作为药物或基因转导载体用途的生物医用纳米材料，首先关注 的问题是应用的纳米载体是否能够产生纳米效应，即纳米凝胶是否具有合适的纳米 尺度的粒径大小和分布。通常，粒径小于1 0a m 的粒子在人体中通过溢出作用和新 陈代谢作用很快就被除去。粒径大于2 0 0n m 的粒子则易被脾胀所捕获，由于机械过 9 华东师范大学硕士学位论文 滤作用，最终被吞噬细胞除去，在体内的循环时间也不太长【】。介于两者之间的粒 径范围，1 0 7 0 纳米粒径的粒子能迅速穿透人体组织中的小血管，而被特定的器官 迅速吸收而形成最有效的分布，可以理想的应用与局部注射，而稍微大些的粒子， 粒径范围在7 0 2 0 0n l n ，则显示出最长的体内循环时间。考虑到粒径小于1 0 0a m 的粒子可被细胞泡囊所捕获【9 9 1 咧，所以，作为药物或者基因载体的纳米凝胶的理想 范围在1 0 1 0 0 曲边间；最后，应该考虑到聚合物纳米凝胶合成成本是否适中，制 备工艺是否容易放大，制各过程是否简单和绿色环保，尽量避免使用各种有毒的表 面活性剂及易挥发的有机溶剂，保证得到的聚合物纳米凝胶能够安全价廉的作为生 物医用材料来使用。 为获得理想的纳米凝胶，科学家们发展了许多制备纳米凝胶的方法。这些方法 有各自的优点，也取得了很好的成果，得到了各种粒径的纳米凝胶。但正如前所述， 它们也有各自的缺点。 研究表明：高聚物在金属离子诱导下可自组装成分型纳米相结构【1 0 1 1 ，这种结 构很松散，不稳定，且粒径大于2 0 0n n l ，不适合药物或基因载体用途。若以分子量 低额聚合物为原料，加入适当的金属离子，预期也能得到自组装的纳米相结构，这 种结构在抽氢剂作用下发生分子链间的交联反应，预期可得到一种结构稳定，粒径 较小的新型树枝状纳米凝胶。基于上述思想，本文尝试以聚乙烯亚胺预聚物为原料， 无毒金属离子为自组装纳米相诱导剂，在水溶液体系中成功制得了粒径在8 0d a t i 以 下，粒径分布均匀的聚乙烯亚胺预聚物纳米凝胶，并通过透射电镜、原子力显微镜、 x 光电子能谱仪等进行了表征。同时通过选择合适的紫外光致抽氢剂等实验条件， 得到了粒径在1 0 0n l n 左右高稳定的纳米凝胶。另外，制备了以苯乙烯。马来酸酐 ( s m a ) 为基体的纳米凝胶的合成部分，并用i r 、1 虾保对其结构进行了表征。 其原理是，聚乙烯亚胺、s m a 衍生物等水溶性聚合物均含有n 、o 等含有孤对 电子的杂原子，与有空d 轨道的金属离子有很强的配位能力，在其诱导下，聚合物 预聚物预期可组装成结构相对松散的纳米相结构，因此，有空d 轨道的，毒性小的 金属离子可作为光化学合成聚合物预聚物纳米凝胶的纳米相诱导剂。另外，基于抽 氢剂光化学反应的“开关效应”，可通过光照时间的控制来调控凝胶的粒径大小。 在合成p e i 纳米凝胶的过程中，我们通过选在合适的金属离子诱导剂，得到了 1 0 华东师范大学硕士学位论文 粒径可控的纳米凝胶：在光照条件下，通过调节光照强度，光照时间等实验条件， 成功制得了高稳定p e i 纳米凝胶，其粒径分布偏差可控制在5 1 0n m 之内。 参考文献： 【l 】k w ：m a t t i s o n ，yw a n g ，k g r y m o n p r e ，e ta l ，m i c r o m o ls y m p , 1 9 9 9 ，1 4 0 ：5 3 【2 】潘祖仁，高分子化学，第二版，北京，化学工业出版社，2 0 0 1 ，p 9 1 5 1 6 【3 】h k a w a g u c h i ，p r o g p o l y m t2 0 0 0 ，2 5 ：1 17 5 【4 】刘国军，王国昌，海外高分子科学的新进展，化学工业出版社，1 9 9 7 【5 】j c h r i s t o p h e rl ，a e l a r a ，k k j e n n a h ，gn r a t p h ，m w g e o r g e ，c h e m r e v 2 0 0 5 ，1 0 5 ：1 1 4 【6 张立德，牟季美，纳米材料和纳米结构，科学出版社，2 0 0 1 【7 】蔡伟平，张立德，物理，1 9 9 7 ，1 6 ，4 ：2 1 3 【8 】t h h e n n i n g ，f s a l a m a s c i e n c e ，19 9 8 ，2 8 2 ：2 2 0 4 【9 】9r p e l t o n ，a d v i nc d 舭a n d i n t e r & 2 0 0 0 ，8 5 ：1 0 【1 0 】yn x i a , b g a t e s ，yyy m ，yl u ，a d v a n c e d m a t e r i a l s ，2 0 0 0 ，1 2 ：7 0 8 【1 1 】a k e l l e r , f a r a d a yd i s c u s s ，1 9 9 5 ，1 0 1 ：l 【1 2 】b r s a u n d e r sa n db v m c e n t ，a d v i nc d 舰a n d i n t e r & t1 9 9 9 ，8 0 ：3 【1 3 】s a t s u s h i ，t t a n a k a ，n a t u r e , 1 9 9 0 ，3 4 6 ：3 4 5 【1 4 】e s m a t s u o ，t t a n a k a ，n a t u r e , 19 9 2 ，3 5 8 ：2 8 2 【15 】a m a m a d a ，t t a n a k a ，d k u n g w a t c h a k u n ，m a c r o m o l e c u l e s , 19 9 0 ，2 3 ：15 17 【1 6 】z b h u ，y y c h e n ，c j w a n g ，e ta l ，n a t u r e , 1 9 9 8 ，3 9 3 ：1 4 9 【1 7 】z b h u ，x i a o m i n gz h a n g ，y o n gl i ，s c i e n c e , 1 9 9 5 ，2 6 8 ：5 2 5 【1 8 】b r s a u n d e r sa n db v m c e n t ，a d v nc o l l i a n d i n t e r 2 0 0 0 ，2 3 ：l 1 9 】wm p h e e ，k c t a m ，r p e l t o n ，d c o i l a n d i n t e r s c i , 1 9 9 3 ，1 5 6 ：2 4 2 0 】d m k i m i n t a ，p f l u c k h a m ，s l e n o n ，p o l y m e r , 1 9 9 5 ，3 6 ：5 8 2 7 21 】s j u b d k a z i s ，n m u k a i ，rw a k a k i ，e ta l ，n a t u r e , 2 0 0 0 ，4 0 8 ：17 8 【2 2 】qh c h e l a ，s a h u f f m a n ，n a t u r e , 19 9 5 ，3 7 3 ：4 9 【2 3 】姚康德，彭涛，高伟，高分子学报，1 9 9 7 ，2 ：1 0 3 华东师范大学硕士学位论文 【2 4 】卓仁喜，张先正，高分子学报，1 9 9 8 ，1 ：1 【2 5 】何庆，盛京，功能高分子学报，1 9 9 7 ，1 0 ：1 1 8 2 6 李方，赵峰，尹玉姬等，化学通报，2 0 0 0 ，3 ：1 2 9 【2 7 】c w u , s z h o u ，zp o l y m p h y s , 1 9 9 6 ，3 4 ：1 5 7 9 【2 8 】c w u ，s z h o u ，s j i n g ，d i e a n g m a k r o c h e m i n e , 1 9 9 9 ，2 4 9 ：1 2 3 2 9 】x h w a n g ，x p q i u ，c h iw u ，m a c r o m o l e c u l e s , 19 9 8 ，31 ：2 9 7 2 【3 0 】s yl i n ，k s c h e n ，l c h u ，p o l y m e r , 19 9 9 ，4 0 ：6 3 0 7 3 1 】a k l e e ，m m h i r v e ，m vb a d i g e r ，r a m a s h e l k a r , m a c r o m o l e c u l e s , 1 9 9 7 ，3 0 ： 1 5 7 【3 2 】h m c r o w t h e r , b r s a u n d e r s ，s j m e a r s ，e ta l ，c o l l i d sa n ds u r f a c e s , 19 9 9 ，15 2 ： 3 2 7 【3 3 】王文峰等，硕士论文，中国科学院上海应用物理研究所，2 0 0 2 【3 4 s c a m m a s ，k s u z u k i ，c s o n e ，ys a k u r a i zc o n t r o lr e l e a s e 1 9 9 7 ，4 8 ：1 5 7 【3 5 j c l e r o u x ，e r o u x ，d l g a r r e c j o u r a lo f c o n t r o l l e d r e l e a s e 2 0 0 1 ，7 2 ：7 1 【3 6 】s v i n o g r a d o v , e b a 仃a k o v a ，a k a b a n o v c o l l o i da n ds u r f a c e sb ? b i o i n t e r f a c e s 1 9 9 9 ，1 6 ：2 9 1 【3 7 】t r i l e y , t g o v e n d e r , s s t o l n i k , c d x i o n g c o l l o i da n ds u r f a c e sb ? b i o i n t e r