小RNA.doc

小RNA(Small RNA)可以分为下列三类:1、微RNA即MicroRNA（miRNA） 它是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA,是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。2、小干扰RNA即small interfering RNA (siRNA) 有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双股RNAsiRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达3、与piwi相互作用的RNA 即Piwi-interacting RNA (piRNA) 它是一类小型RNA分子，长度大约是29到30个核苷酸。piRNA主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物（piRC）来调控基因沉默途径。作用可以下列三方面：A、调节翻译和mRNA的稳定性B、维持生殖系和干细胞功能C、沉默转录基因过程4、较长的非编码RNA较长的非编码RNA大小约为几十到上千个核苷酸，它们广泛地参与不同的细胞生化过程。它包括已发现的核内小RNA、对snRNA或rRNA具有修饰作用的核仁小RNA、参与蛋白质合成和运输的胞质小RNA、参与RNA剪辑的催化性小RNA及其他类型的非编码RNA（tmRNA、端粒酶RNA、反义RNA）。一、微RNA又可以分为： 1. pre-miRNA 是最早采用的microRNA 约70bp含microRNA茎环结构的pre-miRNA miRNA基因在细胞核内转录成前体转录本（pri-miRNA），并被加工成前体pre-miRNA,然后转运到细胞质被加工成成熟的miRNA。 制备方式：化学合成、生物转录合成、pre-miRNA质粒表达载体、pre-miRNA病毒。 2. primiRNA a、天然primiRNA 克隆自天然文库的microRNA由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是近来被首选方法。从染色体基因文库中调取300bp1000bp完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体），以强大的CMV启动子操纵该300bp1000bp microRNA。 b、人工primiRNA 效果较pre-miRNA好， 选择一个完整的microRNA基因，克隆到质粒载体（普通载体或病毒载体）。以人工合成的约70bp含miRNA茎环结构的目标pre-RNA替代原pre-RNA，并以pol /pol III 启动子操纵该microRNA结构单元。3、pre-miRNA或pri-miRNA腺病毒：可以转染大多数绝细胞，产品质量可靠。缺点是腺病毒有一定的毒性，以往实验腺病毒毒性并未引起重视，但我们发现在microRNA实验中显得比较突出。另外，制备周期长，费用高也是不容忽视的缺点。4、慢病毒microRNA：目前最好的microRNA实验产品，缺点是慢病毒自身的不足，即制备lentivirus时，病毒的质量批间差异较大。5、AAV、或retrovirus microRNA：与腺病毒和lentivirus microRNA一样，具有病毒产品的优势与缺点。二、siRNA包括：ta-siRNA、nat-siRNA 、ra-siRNA 、vsiRNA 、 siRNA等1、 ta-siRNA：内源ta-siRNA是新近在植物中发现的依赖于miRNA、长度为21个碱基的小RNA，对植物的生长发育过程具有重要的表达调控功能。tasiRNA的生物合成需要有miRNA介导的非编码转录产物的切割。ta-siRNAs前体是某些miRNAs的靶基因endo-siRNAs目前可以分为三种类型（1）trans-acting siRNAs（ta-siRNAs），21nt,功能与miRNAs类似，与AGO1或AGO7组成RISC 复合体参与转录后调控。 （2） Natural-antisense siRNAs（nat-siRNAs），21nt和24nt, 21nt的nat-siRNAs功能与miRNAs类似，参与转录后调控。 （3）Repeat-associated siRNAs（ra-siRNAs），24nt,参与染色体水平的基因沉默、抑制转座子的转座16-18. 显然， 生命体内还存在许多具有重要功能的small RNAs. 如何鉴定与发现这些RNA是值得人们思索的重要问题。2、 nat-siRNA：由天然反义转录产物产生，这种转录产物由两个重叠 基因的汇集转录产生。3、 ra-siRNA:拟南芥中最丰富的小RNA是长度为24核苷酸的rasiRNAra-siRNAs的前体来源于repeat或TEs序列附加：1、 stRNA：小时序RNA(small temporal RNA ,stRNA)，具有和siRNA相似的结构双链小RNA，是由同一个通路产生的miRNA的亚类。与发育的时序有关，突变时会引起异时序的发育缺陷。2、 lin-4 RNAlin-14和lin-28 mRNA编码发育过程中的重要蛋白，而lin-4则对其进行负调控。lin-4 RNA与lin-14和lin-28等重要的发育调控的3UTR的特定序列同源。一旦删除这些mRNA的3UTR，会发生发育失控的表型。靶mRNA的Northern blot 分析结果表明，调控者（如lin-4，很可能包括let-7 RNA）可能稳定地与多核糖体结合，从而引起了靶mRNA在翻译水平的沉默。3、 let-7 RNAlet-7 RNA结合于lin-41（另一种重要的发育调控基因）mRNA 3UTR上并进行负调控。let-7 RNA的序列在两侧对称的哺乳动物中高度保守。2000年，Amy Pasquinelli等将lin-4和let-4称作stRNAs(small temporal RNAs),并指出，更多的stRNAs仍有待发现。4、 Dicer 与stRNA和siRNAstRNA和siRNA有共同的大小，暗示它们在介导基因沉默过程中的可能联系。遗传学的证据表明，Dicer联系着这两个过程。有两个RNase结构域，一个RNA解旋酶区和一个dsRNA结合区。Dicer可催化长dsRNA分解成2123nt的，还能将的稳定发夹结构的前体RNA分解成2123nt的stRNA。当用siRNA将Hela细胞中的Dicer消除时，会发生70nt2未加工的let-7前体RNA的积累。同样，在蠕虫中去除Dicer，会引起发育的异时性，同时也发生未加工的let-7和lin-4前体RNA的积累。5、 其他的2123nt RNA最近，在不同的生物体中，已发现90多种可能的发夹结构的RNA，其两侧序列可产生2123nt RNA。并非所有这些2123nt RNA都象lin-4和 let-7 一样时序性表达，于是只能统称为miRNAs(micro-RNAs)。也就是说，lin-4和 let-7可被称作miRNA，但因其具有表达的时序性及特殊的功能，当属于stRN