高中生物 6.2 DNA片段的扩增 PCR技术课件 中图版选修1.ppt

第二节dna片段的扩增 pcr技术 课程标准 尝试pcr技术的基本操作和应用 课标解读 1 简述pcr技术的原理和用途 2 简述pcr技术的基本操作步骤 3 进行dna片段的pcr扩增 1 解旋在 的作用下解开dna双链 2 合成引物在 的作用下 以 为模板 合成一段rna引物 pcr的原理和过程 1 dna的复制 解旋酶 rna聚合酶 dna单链 3 合成子链以 为起点 在 的作用下 以 为原料 按照 原则合成两条新的dna子链 1 pcr的定义dna体外扩增技术实际上是在体外模拟 过程 形成大量 这个反应过程称为 简称pcr 2 pcr与dna复制的不同点 2 pcr技术 rna引物 dna聚合酶 四种脱 碱基互补配对 细胞内的dna复 特异性的dna片段 聚合酶链式反应 氧核苷酸 制 1 准备 将pcr缓冲液 四种脱氧核苷酸 mg2 等成分加到一个特制的离心管中 2 高温变性 把离心管置于 的环境中 使dna碱基对之间的 断裂 形成 单链 这个过程称为高温变性 dna单链 20 30个脱氧核苷酸 反应温度的控制 3 pcr的过程 dna模板 一对引物 dna聚合酶 95 氢键 两条 3 低温复性 再将离心管置于 的环境中 使 分别结合到两条分开的模板链上 这个过程称为低温复性 4 中温延伸 最后将离心管置于 的环境中 在 的催化下 游离的脱氧核苷酸从引物的一端一个一个地连接上去 形成两条新的 这个过程称为中温延伸 在1 2h内重复 次循环 dna片段数可增至 倍 4 pcr的结果 55 一对引 72 dna 子链 25 30 106 物 聚合酶 107 为什么dna复制必须有引物 提示dna聚合酶不能从头合成dna 而只能以3 延伸dna链 故dna合成时 必须加入引物 其3 游离 以作为延长dna子链的 引子 思维激活1 1 pcr原理 pcr原理 dna分子在一定条件下可以进行半保留复制 dna的热变性原理 在80 100 的温度范围内 dna的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程称为变性 当温度缓慢下降后 两条被分离的dna链又会重新结合成双链 这个过程称为复性 1 pcr的原理 2 pcr扩增方向 3 端和5 端 为了明确地表示dna的方向 通常将dna的羟基 oh 末端称为3 端 而含磷酸基团的末端称为5 端 一个双链dna分子中含两个3 端和两个5 端 如果一条链的方向是3 5 则另一条链的方向就是5 3 这就是反向平行的含义 dna分子中相邻两个脱氧核苷酸残基通过3 5 磷酸二酯键相连 该化学键是由一分子脱氧核苷酸中3号碳原子上的羟基 oh 与相邻的另一分子脱氧核苷酸中5号碳原子上的磷酸基团脱水聚合而成 所以dna的合成方向总是从子链的5 端向3 端延伸 1 pcr的反应条件 稳定的缓冲液环境 dna模板 分别与模板dna两条模板链相结合的两种引物 四种游离的脱氧核苷酸 耐热的dna聚合酶 一般用taqdna聚合酶 能严格控制温度变化的温控设备 2 pcr过程 高温变性当温度上升到90 以上时 双链dna解聚为单链 2 pcr的过程 低温复性温度下降到55 左右 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 形成局部双链 中温延伸温度上升到72 左右 在taqdna聚合酶的作用下 以四种脱氧核苷酸为原料 根据碱基互补配对原则 从引物的5 端 3 端延伸合成与模板互补的dna链 1 pcr的每一轮循环包括高温变性 低温复性 中温延伸三步 从第二轮循环开始 每次循环的产物也作为模板参与反应 并且由引物 延伸而成的dna单链会与引物 结合 进行dna的延伸 这样 dna聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的dna序列 使这段固定长度的dna序列呈指数扩增 2 pcr一般要经历三十多次循环 处于两引物间固定长度的序列数目为230 3 pcr的结果 下列有关pcr技术的叙述不正确的是 a 聚合酶链式反应是一种体外迅速扩增dna片段的技术b 在用pcr技术扩增dna时 dna的复制过程与细胞内dna的复制类似c pcr反应只需在一定的缓冲溶液中提供dna模板以及四种脱氧核苷酸d pcr一般经历三十多次循环 每次循环分为变性 复性 延伸 巩固1 解析pcr是聚合酶链式反应的简称 是一种体外迅速扩增dna片段的技术 在用pcr技术扩增dna时 dna的复制过程与细胞内dna的复制类似 也需要提供模板 母链 酶 原料 能量等条件 pcr一般要经历三十多次循环 每次循环可分为变性 复性和延伸三步 答案c 先用 在 中依次加入各组分 耐高温的 脱氧核苷酸贮备液 第一次循环 预变性5min 复性1min 延伸1min 重复30次 变性30s 复性30s 延伸1min 最后一次循环 延伸7min 反应产物在 保存 pcr技术的实验操作 1 pcr扩增前的准备 2 pcr扩增循环 微量取样器 微量离心管 模板 dna聚合酶 pcr缓冲液 引物 dna 95 55 72 95 55 72 72 4 pcr操作中模板dna是否需解旋 需要解旋酶吗 提示pcr操作中 模板dna仍需解旋 但该解旋过程不是解旋酶催化的结果 而是利用dna热变性的原理 在80 100 温度范围内 dna双螺旋结构将解体 双链分开 以此达到解旋的目的 思维激活2 1 pcr扩增前的准备 移液 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 模板dna 耐高温dna聚合酶 脱氧核苷酸贮备液 pcr缓冲液 引物 混合 盖严离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 使反应液混合均匀 离心 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 目的是使反应液集中在离心管底部 反应 将离心管放入pcr仪中 设置程序进行反应 pcr仪自动化程度较高 参照下表设计程序即可 2 pcr热循环程序的设置 若无pcr仪 可用恒温水浴锅代替 三个恒温水浴锅的温度分别为94 55 和72 然后按照上表要求 在三个水浴锅中来回转移pcr反应的微量离心管 1 检测pcr扩增效果的原因 3 检测pcr扩增效果 理论上dna扩增呈指数增长 即一条dna片段循环n次后的数目为2n 但实际可能会有诸多因素影响dna含量 所以需要对dna含量进行测定 2 原理dna在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与dna的含量有关 可以利用dna这一特点进行dna含量的测定 3 检测过程 10倍稀释 10 lpcr反应液 加入90 l蒸馏水 即将样品进行10倍稀释 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 测定 取dna稀释液加入到厚度为1cm的比色杯中 测定260nm处的光吸收值 有关下列操作过程的叙述 错误的是 a pcr实验中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌b pcr所用的缓冲液和酶应分装成小份 并在 20 储存c pcr所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后 迅速融化d 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头都必须更换 巩固2 解析为了防止外源dna等因素的污染 pcr实验中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 所用的缓冲液及酶应分装成小份保存 并使用一次性枪头 即a b d正确 在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化 而不能迅速融化 即c错误 答案c 美国科学家穆里斯发明了pcr技术 pcr技术是一种dna分子 复印机 它可以在数小时内将一个dna分子复制出1千亿个 解决了检测样本扩增的难题 在人类基因组计划实施中 rcr技术使每个核苷酸的识别成本降低至5 10美元 穆里斯因发明pcr技术而荣获了诺贝尔奖 1 dna复制时需要大量的 作原料 在dna聚合酶的催化下以解旋后的单链为 进行生物合成 例1 示例一pcr的原理 2 在dna分子解旋时必须加热 普通的酶容易 莫里斯从温泉中找到了耐95 高温的 解决了酶重复使用的难题 使链式反应成为可能 每次循环可分为 三步 思维导图 深度剖析dna复制的模板是dna分子的每一条链 并以脱氧核苷酸为原料 在dna聚合酶的作用下进行复制 由于在体外打开双螺旋结构 需要加热处理 因此 选用的dna聚合酶必须能耐高温 答案 1 脱氧核苷酸模板 2 变性 失活 taqdna聚合酶高温变性低温复性中温延伸 方法技巧pcr技术特点 pcr不需要解旋酶 而生物体内dna复制时需要解旋酶 pcr需要耐热的dna聚合酶即taqdna聚合酶 而生物体内dna聚合酶在高温时会变性 pcr一般需经三十多次循环 而生物体内dna复制需要生物体自身的控制 使用pcr仪具体实验操作顺序应为 设计好pcr仪的循环程序 按配方准备好各组分 用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 进行pcr反应 离心使反应液集中在离心管底部a b c d 思维导图 例2 示例二pcr技术实验操作 深度剖析pcr反应的操作步骤一般分为准备 包括配制配方及将各配方放于实验台上 移液 混合 离心 反应 因pcr仪是一种自动控制温度的仪器 设计好循环程序就可以进行反应了 答案c 方法技巧pcr技术操作注意事项 为避免外源dna等因素的污染 pcr实验中使用的微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌 在微量离心管中添加反应成分时 每吸取一种试剂后 移液器上的枪头必须更换 所有的成分都加入后 盖严离心管的盖子 用手指轻轻弹击管的侧壁 混匀后离心处理 使反应液集中在离心管底部 pcr实验中应注意各种反应成分的用量 用量不当 漏加成分 pcr程序设置不当等 均有可能导致dna片段扩增的失败 pcr扩增的是位于两种引物之间的dna片段 合理设计引物是pcr成功的关键 科学猜想 推测与科学实验是进行科学发现的孪生兄弟 二者往往密不可分 dna复制方式的发现就是如此 探究dna复制的方式 技法必备 dna分子双螺旋结构模型提出之后 人们又去探究dna是如何传递遗传信息的 当时推测可能有如图a所示的三种方式 1958年 meslson和stah1用密度梯度离心的方法 追踪由15n标记的dna亲本链的去向 实验过程是 在氮源为14n的培养基上生长的大肠杆菌 其dna分子均为14n dna 对照 在氮源为15n dna的培养基上生长的大肠杆菌 其dna均为15n dna 亲代 将亲代大肠杆菌转移到含14n的培养基上 再连续繁殖两代 子代 和子代 后离心得到如图b所示的结果 能力展示 图a 图b 请依据上述材料回答下面的问题 1 如果与对照相比 子代 离心后能分辨出轻和重两条密度带 则说明dna传递遗传信息的方式是 如果子代 离心后只有1条中等密度带 则可以排除dna传递遗传信息的方式是 如果子代 离心后只有1条中等密度带 再继续做子代 的dna密度鉴定 若子代 离心后能分出中 轻两条密度带 则可以确定dna传递遗传信息的方式是 若子代 离心后不能分出中 轻两条密度带 则可以确定dna传递遗传信息的方式有 的可能 2 他们观测的实验数据如下 梯度离心dna浮力密度 g ml 表 分析实验数据可知 实验结果与当初推测的dna三种可能复制方式中的 方式相吻合 答案 1 全保留复制全保留复制 半保留复制 分散复制 2 半保留复制 标准的pcr过程一般分为变性 复性 延伸三大步 这三大步需要的温度依次是 a 95 55 72 b 72 55 95 c 55 95 72 d 80 55 72 1 解析当温度上升到90 90 96 以上时 双链dna解聚为单链 称之为变性 当温度下降到50 40 60 左右时 两种引物通过碱基互补配对与两条单链dna结合 当温度上升到72 70 75 时 溶液中的四种脱氧核苷酸在taqdna聚合酶的作用下 根据碱基互补配对原则合成新的dna 称为延伸 答案a 长春模拟 下列关于pcr的描述中 正确的是 pcr是一种酶促反应 引物决定了扩增的特异性 扩增dna利用了热变性的原理 扩增的对象是氨基酸序列a b c d 解析pcr是一种体外迅速扩增dna片段的技术 在高温条件下 把dna的双链打开 缓慢冷却后 又重新结合 需要耐高温dna聚合酶 同时 还需要引物 从引物的3 端连接脱氧核苷酸 答案d 2 右图是pcr技术示意图