海洛因滥用者唾液中毒品代谢物的SPE-GCMS—SIM分析.pdf

第 2 2卷第 4期 2 01 0 4月 化 学 研 究 与 应 用 C h e mica l Re s e a r ch a n d Ap p lica t io n Vo 1 2 2 N o 4 Ap r 2 01 0 文章编号 1 0 0 4 1 6 5 6 2 0 1 0 0 4 0 4 1 5 0 5 海洛 因滥 用者唾液 中毒 品代谢物 的 S P E G C MS S I M分析 王燕燕 孟 品佳 王彦吉 王 川 李燕京 中国人民公安大学刑事科学技术系 北京1 0 0 0 3 8 摘要 本文首先考查了不同类型不同厂家的固相萃取柱的萃取效果 采用提取效果较好的5 0 m r m L的C l e a n s cr e e n C S D A U L 0 1 混合型强阳离子固相萃取柱 对唾液中的吗啡 可待因 6 单乙酰吗啡等 3种鸦片类毒品进 行提取后 将提取液吹干 再经 MB T F A衍生化后 进行 G C M S S I M检测 以乙基吗啡为内标 3种毒品的线 性相关系数均大于0 9 9 线性范围为 l0一1 0 0 0 n g m L 相对回收率分别为 8 5 一1 1 0 9 4 一1 0 7 和7 5 9 2 相对标准偏差小于 1 0 3种毒品的检测限分别为 2 n g m L 1 n g m L和 2 n g m L 该方法灵敏度 高 重现性好 操作简便 可用于鸦片类毒品滥用者及中毒者唾液中的毒品及其代谢物的检测 关 键词 海洛 因 唾液 S P E提取 G C S I M M S检测 中图分类号 0 6 5 7 7 文献标识码 A Ana ly s is o f o pia t e s in hu m a n s a liv a b y s o lid p h a s e e x t r a c t io n a n d g a s ch r o ma t o g r a p h y ma s s s p e ct r o me t r y d e t e ct io n WA N G Y a n y a n ME N G P in j ia WA N G Y a n j i WA N G C h u a n L I Y a n j i n g D e p a r t m e n t o f F o r e n s i c S ci e n ce C h in e s e P e o p l e S P u b l i c S e cu ri t y U n i v e r s it y B e i j i n g 1 0 0 0 3 8 Ab s t r a ct I n t h is p a p e r s o n ic s o lid p h a s e e x t r a ct io n co lu mn s in d if f e r e n t t y p e s a n d f r o m d iff e r e n t ma n u f a ct u r e r s we re t e s t e d t h e b e t t e r o n e a mo n g t h e m w it h m i x e d s t r o n g ca t i o n e x ch a n g e co l u m n 5 0 11 3 Ig mL o f C le a n s cr e e n C S D A U L 0 1 w a s ch o s e n t o e x t r a ct m o r o p h i n e co d e in e a n d 6 a ce t y l mo r p h i n e wh i ch s p i k e d i n s al iv a Us in g e t h y l mo rph i n e a s a n i n t e r n a l s t a nd a r d a n d t h e 3 o p i a t e s s p i k e d in b la n k s a liv a w e r e e x t r a ct e d u s in g a s o lid p h ase ca r t ri d g e f o llo we d b y h e in g d e r iv a t iz e d wit h MB T F A a n d a n al y z ed d ir e ct ly b y G C MS in s e le ct e d io n mo d e T h e me t h o d wa s v a lid a t e d in t h e r a n g e 1 0 1 0 0 0 n g mL w it h t h e d r u g s p ik e d s a liv a the r e a ct o r r e s p o n d e d li n e a r l y o v e r t h e s t u d i e d r a n g e R 0 9 9 f o r t h e 3 d r u g s T h e r e la t i v e s t a n d a r d d e v ia t i o n s R S D w e re le s s th a n 1 5 t h e r e la t i v e e x t r a ct io n r e co v e ri e s w e r e v a r y in g f r o m 7 5 t o 1 1 0 a n d L OD s we r e l e s s t h a n 2 n s mL wh i ch p r o mis e d the p e r s p e c t iv e a p p lica t io n o f t h e me t h o d in d e t e ct in g t r a ce a mo u n t o f o p iu m in h u ma n s a liv a Ke y wo r d s h e r o in s a liv a s o lid p h ase e x t r a ct io n GC MS S I M d e t e ct io n 近年来 不 同于尿液 和血液 的非 传统生 物检 材 已用于药物滥用的评估 其 中唾液是唯一已 成功的用来替代血液进行 动力学和一些药物毒理 学研究的体液 其 中包括滥用 药物 的研究 j 药 物的唾液浓度与血液浓度 的比值 S P比值 相对 恒定 变异率小 对估计药物在体 内的代谢水平 具 有重要 的意义 有些报道证 明唾液还可 以替代 尿液进行药物滥用的检测 此外 相对 于其他 体液检材 唾液 的采 取不受地点 时间的 限制 易 被受检者接受 采集过程不侵犯个人 的隐私 采样 过程易于监控 可 以避免 样品的造假行 为 在公 安执法实践 中 利用 唾液作 为检材 已成 为一 种简 收稿 日期 2 0 0 9 0 6 2 9 修回 日期 2 0 0 9 0 9 0 6 基金项 目 北京教育委员会共 建项 目建设计 划 S Y S 1 0 0 4 1 0 0 4 3 6 资 助 联系人简介 王彦吉 1 9 4 8 一 男 教授 研 究方向毒物和毒 品检验 E ma i l m e n g p i n j i a 1 6 3 t o m 4 l6 化 学 研 究 与 应 用 第 2 2卷 便的 无损害的并能反映血药浓度的方法 J 海洛因是 目前我 国滥用 最普遍 的鸦片类毒 品 也是诱发一系列社会问题和引发吸毒死亡 的 主要毒品 J 根据海 洛因毒品的滥用特点 生物 检材中药物原体及体 内代谢物主要有 6 一 单乙酰吗 啡 吗啡和可待 因等 J 把这些成分从生物检材 中有效的提取出来将直接影响检测结果的准确性 和灵敏度 固相萃取法 S P E 是近年来色谱分析 中发展最快的样品前处理技术之一 与液相提取 比较 S P E的溶剂用量 少 萃取物杂质 干扰少 重 现性好 且便于实现样品前处理的 自动化 是样 品 前处理的发展方 向 文献报道的吗啡 S P E多采用 反相萃取 9 1 0 J 近几年反相萃取和阳离子交换功 能的混合柱应用增 多 目前商品化 的混合柱型有 B o n d E lu t C e r t if y I s o lu t e C o n fi r m HC X B a k e r b o n d N a r c 2 C le a n s cr e e n C S D A U等 但不 同柱 型和不 同批号柱子间吗啡 的回收率有所差别 n q 4 本文通过 G C MS方法 考查 了不 同类型不 同 厂家的固相小柱 的提取效果 并采用 C l e a n s cr e e n 公司的 C S D A U I J D 1柱对 唾液标准添加 的线性 相 对回收率 13内重复性 13间重复性 检测限 S N 3计 等分析指标进 行 了考查 建立 了唾液 中 吗啡 6 一 单乙酰吗啡 和可待因等鸦片类毒品的固 相萃取 G C MS检测 方法 该方法适用于鸦 片类 毒品滥用 者 唾 液 中毒 品及 代谢 物 的分析 效 果 良好 1 实验部分 1 1 仪器及测试条件 安捷伦 7 8 9 0 A G C 5 9 7 5 C MS联用仪 色谱柱为 H P S M S 3 0 m x 0 2 5 m m x 0 2 5 m 起 始 柱 温 为 1 5 0 保持 1 rain 然后以 2 0 o C m in升至 2 5 0 保 持 2 5 rai n 再 以 3 0 c m in 升 至 2 8 0 o C 保 持 3 ra in H e为载气 流速 3 m L mi n 不分流进样 质谱电离电压7 0 e V 溶剂延迟时间 3 m i n 全扫描 质谱范嗣4 5 5 5 0 a m u S I M检测 中 选择的定性 监测离子为吗啡 m z 3 6 4 m z 4 7 7 可待因 m Z 3 9 5 6 单 乙酰吗啡 m z 3 6 4 m z 4 2 3 乙基 吗啡 m z 2 9 6 m z 4 0 9 定量离 子吗啡和 6 一 单乙 酰吗啡均为 m z 3 6 4 可待因为 m z 3 9 5 乙基 吗啡为 m z 2 9 6 1 2 标准品与试剂 吗啡盐酸盐 可待因盐酸盐 6 单 乙酰吗啡盐 酸盐标准品购于公安部物证鉴定 中心 N 甲基 双 三氟乙酰胺 MB T F A 购于 A cr o s O r g a n i cs 公司 固相萃取柱 为 C le a n s cr e e n的 C S D AU L O 1 S U P E L C O的 C 8 S C X S T Y R E S C R E E N的 S S D B X混 合型强阳离子柱 C l e a n e 的 S C X强阳离子交换 柱 Wa t e r s O A S I S的 H L B亲水性 和疏水性单体聚 合混合柱 填料量 柱管体积 为 5 0 m g mL 其他 试剂均为分析纯 标准储备液 的配制 准确称取标准品海洛因 吗啡 可待因 乙酰可待因 6 单乙酰吗啡 用甲醇 溶解配制成以游离碱计算的 l m r m L的标准品储 备液 置于 2 0 冷冻室中保存 备用 缓冲液的配制 分别配制 0 1 m o l L的磷酸氢 二钠 和磷酸二氢钠溶液 将 2者按适 当比例混合 或添加磷酸 配成 p H 2 4和 6的 0 1 m o l L磷酸 盐缓 冲液 I 3 检材 处 理 唾液样 品的采集 采集无吸毒史学生 志愿者 空白唾液样本约 2 0 mL 漱 口后 1 5 rai n 收集 口内 自然流出或经舌在 口内搅动后流 出的混合唾液 每次收集的唾液约 0 5 m L 以 2 0 0 0 3 0 0 0 r p m离 心 5 1 0 ra in 小心吸取上清液 密封后置于冰箱 中冷藏保存 备用 唾液样品的制备 分别 向若 干样品瓶 中加人 1 m L 唾液 根据实验需要分别添加不同浓度的吗 啡 可待因和 6 一 单 乙酰吗啡制成 添加鸦 片类毒品 的唾液样本 唾液检材的提取 取空 白及 已制备唾液样本 1 mL 至 1 5 mL塑料离心试管中 加入 0 1 g内标 物 乙基吗啡 1 0 0 L浓度为 l I g m L的溶液 及 0 1 mo l L的磷 酸盐缓 冲液 3 mL 涡旋 混匀 以 4 0 0 0 n n p离心 5 m in后 移取上层清液于固相萃取 柱上样 基于阳离子交换 的 S P E柱提取 过程为 分别 用甲醇和 0 1 m o l L的磷 酸缓 冲液 活化 然后 以 1 mL m in 流速 将 处 理 过 的 样 品 上 柱 真 空 抽 l m in 再分别用 去离子水 0 1 m o l L H C I 和甲醇 淋洗 之后真空压力下抽干 1 m in 最后用二氯 甲 异丙醇 氢氧化铵 体积 比 8 0 2 0 5 混合液洗 提 J U 将 洗提液置空气流下挥干后 用 8 0 L 乙酸乙酯溶解 将2 0 0 L内插管放人 自动进样瓶 中 转移乙酸乙酯溶解液于其中 加入 2 O L MB T F A 混合 后置 6 0 烘箱 中加热 3 0 mi n进行 衍生 化 然后 自动抽取 1 L进行 G C MS分析 亲水性和疏水性单体聚合混合柱提取过程为 分别以 2 m L甲醇和蒸馏水 活化 S P E小柱 然后将 处理过的样品上柱 后分别用 2 m L含 5 甲醇的水 溶液 和 2 mL含 2 0 N H 4 O H 的 水 溶 液 含 2 M e O H 进行淋洗 之后真空下抽 干 2 0 mi n 最后用 第 4期 王燕燕等 海洛 因滥用者唾液中毒品代谢物的 S P E G C MS S I M分析4 1 7 2 m L 含 2 C H C O O H Me O H洗提 将洗提液 吹干后用 8 O 乙酸乙酯溶解 后续同上所述 1 4 工作 曲线及方法的稳定性和再现性 定量线性是分别在 数份 1 mL空 白唾液 中添 加 5个不同浓度的标准品溶液和相同浓度的 内标 溶液 以待测 物的峰面积 和内标 的峰面积 比值 与 唾液中待测物 的浓度绘 制工作 曲线 得到线性方 程 线性方程的实验点范围即为线性范围 在线性范围内的低 中 高 3个浓度点分别制 备 5个平行样 品进行分 析 以待测物与 内标 的峰 面积比值的平均值除待测物与内标峰面积 比值 的 标准偏差 计算 日内变 异系数 R S D 为相对标 准偏差 相对 回收率是 以添加生物样本 中待测物峰面 积与内标峰面积的比值除以相 同浓度下的标 准品 和内标峰面积的 比值 绝对 回收率是 以生物样本 中待测物峰面积除以相同浓度 下的标准品的峰面 积 检测限 L O D 为待测物的信号与噪音信号的 比值 S NI 3时唾液中的待测物浓度 2 结果与讨论 2 1 固相萃取柱的选择 取空白唾液 1 mL 分别加入吗啡 6 一 单乙酰吗 啡 可待 因标准品溶液 制成浓度为 1 0 0 n g mL的 唾液 分别加入 1 0 0 n g mL的内标 乙基 吗啡标 准 溶 液 分 别 考 查 了 S U P E L C O 的 C 8 S C X 柱 C le a n s cr e e n C S D A U柱 S T Y R E S C R E E N 的 S S D B X 柱 C le a n e a的 S C X柱和 Wa t e r s O A S I S的 HL B柱 等不同厂家不同类型萃取柱的提取效果 规格均 为填料量 柱管体积 5 0 mg m E 其 中前 三种 为 混合阳离子交换柱 第 四种为阳离子交换柱 第四 种为亲水性和疏水性单体 聚合混合柱 提取过程 同 1 3所述 经过检 测 不 同萃取柱 提取待测物 回收率及重复性如表 1所示 衷 l 唾 液中鸦 片类毒品不 同固相柱提取 的稳定性和绝对回收率 T a b le 1 Re p r o d u cib ilit y a n d a b s o lu t e r e la t iv e r e co v e r y o f o p ia t e s in s a liv a e x t r a ct e d b y d iff e r e n t S P E 由表 1可知 基于 同一原理提 取的固相柱其 填料和其他键合基团对提取效果 没太大影响 因 此前三种固相柱 回收率和重复性差别不大 以 C S D A U柱稍好 且杂质干扰较少 尤其对 内标的提取 效果较好 对于 S C X柱 回收率最高但杂质 干扰较 严重 且重复性稍差 对 于 H L B回收率很差 可能 与提取时抽 干步骤要 求严格有 关 而且 提取过程 较繁琐 此外 还考查 了 S T Y R E S C R E E N的 H 2 P 柱 其作用机理同 HL B柱 效果也极差 因此选用 C le a n s cr e e n C S D A U柱作 为唾液 中上 述毒 品前处 理的萃取柱 并进行 了方法学考查 2 2 空 白唾液添加鸦片类毒品的分析 取空白唾液 1 m L 分别加入吗啡 6 一 单 乙酰吗 啡 可待 因标 准品溶 液 制成 含毒 品浓度 分别 为 l0 5 0 1 0 0 5 0 0和 1 0 0 0 n g m L的唾液 分别加入 1 0 0 n g mL的内标乙基 吗啡标准溶液 按 照样 品 制备处理方法提取和检测 以待测物与内标物的峰面积 比和唾液 中的待 4 1 8 化 学 研 究 与 应 用 第2 2卷 测物浓度 n g mL 作线性方程 以大于噪音响应 3 倍 的待测物最小浓度作为检测限 L O D 以线性 考查的最低浓度作为定量限 L O Q 结果见表 2 在其线性范围内选择低 中 高 3个 浓度 点 分别为 1 0 1 0 0和 1 0 0 0 n g m L 制备每一个浓度点 的 3个平行添加 唾液样 本 按照样品的处理方法 提取 衍生化和测试 计算 日内重现性 日间重现 性和相对回收率 结果见表 3 表 2 唾液中鸦片类毒品S P E分离 G C M S检测的线性方程及 L O D和 L O Q值 T a b le 2 L O D s L O Q s a n d L i n e a r e q u a t i o n s o f o p i a t e s i n s a li v a e x t r a ct e d b y S P E a n d d e t e ct ed b y G C M S An a l y s e s S p ik e d d r u g in b l o o d Re p e a t a b il it y R e la ti v e r e co v e r y n g mL l 5 R S D 6 一 单乙酰吗啡的相对回收率较其他两种药物偏低 这应该与它的水解有关 而吗啡的相对 回收率则 会偏高 2 3 嫌疑吸毒者唾液样本的分析 用建立的提取和检测方法 对可疑吸毒者 的 唾液进行检测 取 空 白唾液经 S P E提 取后 G C MS S I M检测见图 1 取 可疑吸毒者 唾液 0 5 mL 取样器每次所取量 北京市法医物证鉴定中心提 供 添加 内标 乙基 吗啡 1 0 0 n g 按 1 3的方 法提 取和 G C MS S I M检测 结果如图 2 5 0 0 i I O n 3 6 4 O 0 0 0 0 0 一 一 一 一 0 一 一 一 一 一 r 一 一 一 一 一 一 一 一 一 r r 一 5 00 5 5 0 6 o 0 6 5 0 7 1 O 7 5 0 8 0 O 8 5 0 9 0O 9 5 0 1 0 o o l0 5 O 5 0 0 l0 11 3 9 5 O 0 O o 0 1 5 0 一一 一 一 一 一 一 5 O O 5 5 O 6 0 0 6 5 0 7 o 0 7 5 O 8 O O 8 5 0 9 砌9 5 0 l0 0 O l0 5 0 5 0 0 I o n 2 9 6 0 O 0 0 0 s o o 一 一i一 一 0 一 如 一 1 L 0 一 一 一一 T 一一 一 1 T 一一 5 0 0 5 5 0 6 0 0 6 5 0 7 0 0 7 5 0 8o o 8 5 0 9 o o 9 5 0 l00 O J 0 5 0 Time mi n 图 1 空白唾液 固相提 取 C C MS S I M 色谱 图 F i g 1 C h r o ma t o g r a ms o f b la n k s a li v a d e t ec t e d b y GC MS S I M a f t e r S P E a n d a e y l a t e d 第4期 王燕燕等 海洛因滥用者唾液 中毒品代谢物的 S P E G C M S S I M分析4 1 9 5 肿 5 5 O 6 0 6 5 0 7 0 7 5 O 8 0 0 8 5 0 9 O 0 9 5 O 1 0 x lO 5 0 1 l O 0 T im min 图2 嫌疑吸毒者唾液固相提取 G C MS S I M 色谱 图 F i g 2 Ch r o ma t o g r a ms o f h e r o i n u s e r s s a li v a d e t e ct e d b y G C JMS S I M a f t e r S P E a n d a cy l a t e d 1 吗啡 2 可待因 3 乙基吗啡 4 6 单乙酰吗啡 通过特征离子及保 留时间对照确定唾液中检 出吗啡 可待 因和 6 单乙酰吗啡 将它们的积分峰 面积与内标峰面积比值代人其 各 自标准线 性方程 得出该唾液样 本 中吗啡 的含量为 5 4 3 n g m L 可 待因为 3 8 n g mL 6 单 乙酰 吗啡为 8 9 n g m L 由计算含量可知该 唾液毒 品含量少 可待因和 6 参考文献 1 P i ch in i S A h ie r i I Z u cca r o P e t a1 D r u g mo n i t o rin g i n n o n co n v e n t i o n a l b io l o g i c fl u i d s a n d ma t rice s J c 2 n Ph a mm o k in e t 1 9 9 6 3 0 2 1 l 2 2 8 2 D rumm e r O H R e v i e w p h a r m a co k i n e t i cs o f i l li cit d r u g s i n o r a l flu i d J F o r e n s i c 2 o o 5 1 5 0 l3 3 1 4 2 3 I v e n s A T h e r o le o f s a li v a in d rug m o n i t o rin g J A n n a l s o ft h e N e w Y o r k A ca d e m y of S ci e n ce s 1 9 9 3 6 9 4 1 8 6 9O 4 B e n n e t t G A D a v i e s E T h o ma s P I s o r a l flu i d a n a l y s i s a s a ccu r a t e a s ur ina ly s is in de t e ct in g drug u s e in a t r e a t me nt s e t t in g J D r u gA l co h o l D e p e n d 2 0 0 3 7 2 2 6 5 2 6 9 5 D a m s R C h o o R E I m h e r t W E e t a1 O r a l f lu id a s a l l a h e r n a t iv e ma t ri x t o mo n it o r o p ia t e a n d co ca in e u s e in s u b s t a n ce a b u s e t r e a t m e n t p a t ie n t s J D r u g a n d A l co h o l D e p e n d e nc e 2 0 0 7 8 7 2 3 2 5 8 2 6 7 6 N a v a r ro M P i cl fin i S F a r r e M e t a1 U s e f u l n e s s o f s a li v a f 0 r me a s u r e me n t o f 3 4 me t h y le n e d io x y me t h a mp h e t a min e a n d it s me t a b o lit e s C o r r e la t io n wit h p lasma d rug co n e cn t r a t io n s a n d e ff e ct o f s al iv a r y p H J C li n i ca l C h e m i s t r y 2 0 o 1 4 7 1 7 8 8 1 7 9 5 i 7 B u s h D M T h e U S M a n d a t o r y G u id e l in e s f o r F e d e r a l W o r k p la ce Dr u g T e s t in g P r o g r a ms cu r r e n t s t a t u s a n d f u t u r e co n s i d e r a t i o n s I J 1 F o r e n s i c Sc i e m T e ln t e r n a t i o h a 1 2 o o 7 1 7 4 2 ll1 1 l9 B 沈敏 体内滥 用药物分析 M 北京 法律 出版杜 2 0 o 3 1 0 5 1 0 7 9 M o e ll e r M R Mu e l le r C T h e d e t e ct i o n o f 6 mo n o a ce t y 1 单乙酰吗啡 已经超 出最小 定量限 故定 量不 是非 常准确 且其峰形较小 根据海洛因的代谢原理 检出 6 一 单乙酰吗啡说明该吸毒者滥用海洛因 该 方法灵敏 稳定 可用于海洛因滥用者唾液及其他 生物检材的检验 mo r p h in e in u ri n e s e ru m a n d h a ir b y GUMS a n d R I A J F o r e n s i c S ci e nc e I n t e r n a t i o n a l 1 9 9 5 7 0 1 2 5 1 3 3 1 O Q i n g C h e n g Me n g S o le d e d C e p e d a M T o m K 姗 e r e t a J Hig h p e r f o r ma nce liq uid chr o ma t o g r a p hic d e t e r mina t io n o f mo rph in e a n d it s 3 a n d 6 g lu cu ron id e me t a b o lit e s b y t w o s t e p s o li d p h a s e e x t r a ct io n j J o u r n al of C h r o ma t o g r a p h y B 2 0 0 0 7 4 2 1 5 1 2 3 l1 E li s a b e t h J R o o k Mi ch e l J X Hi l le b r a n d H i l d e R o s in g e t a 1 T h e q u a n t it a t iv e a n a ly s is o f h e r o in me t h a d o n e a n