乙肝诊断治疗分子指标PPT课件.ppt

慢性乙型肝炎诊断与治疗中的分子指标 杨志军 1 乙型肝炎病毒感染的现状 全球约有3 5亿人感染乙型肝炎病毒 中国有1 2亿人感染 其中每年约有1 2 会出现肝硬化或肝癌而死亡 2 HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程 3 慢性乙肝的诊断 HBsAg持续阳性6个月以上HBV DNA高于105拷贝 毫升ALT持续升高或反复升高 4 慢性乙肝的分类 HBeAg阳性乙肝 HBsAg HBeAg阳性 HBV DNA高于105拷贝 毫升 ALT持续升高或反复升高HBeAg阴性乙肝 HBsAg anti HBe阳性 HBV DNA高于104拷贝 毫升 ALT持续升高或反复升高 5 诊断慢性乙肝的指标 生化指标 ALT免疫学指标 HBsAg 携带指标 HBeAg 活动指标 病毒学指标 HBV DNAHBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学指标 前S1可以弥补这一缺憾 提供HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学指标 6 HBV DNA检测的基本要求 虽然国内HBV DNA检测都用实时荧光PCR法 但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异 从而导致定量结果的差异 而准确的定量结果直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择HBVDNA定量试剂的溯源和标准化将是一种基本趋势 7 慢性乙肝治疗的长期目标 防止发展成为肝硬化或肝细胞癌在临床上 往往以比较现实的短期目标来代替长期目标 8 慢性乙肝治疗的短期目标 病毒抑制 表现为HBeAg血清转换和HBV DNA阴转肝损伤程度降低 表现为转氨酶恢复正常完全清除病毒 表现为HBsAg消失 HBsAb出现 血清和肝细胞中检测不到HBV DNA从目前水平来看 不可能完全清除病毒 9 治疗慢性乙肝的药物 免疫调节剂 干扰素 PEG干扰素 胸腺肽核苷类似物 拉米夫定 阿德福韦 替比夫定 恩替卡韦 泰诺福韦等 10 拉米夫定治疗与转氨酶浓度 拉米夫定治疗一年后的HBeAg阴转率和HBV DNA阴转率 ALT浓度低于2倍正常值高限 5 ALT浓度介于2 5倍正常值高限 26 ALT浓度高于5倍正常值高限 64 11 HBV DNA定量检测的临床应用 慢性乙肝诊断治疗监测和疗效评价跟踪随访预后判断 12 HBV DNA定量 慢性乙肝的诊断 HBsAg阳性六个月以上ALT持续升高或反复升高HBV DNA大于105拷贝 毫升 HBeAg阳性 或104拷贝 毫升 HBeAg阴性 13 HBV DNA定量 抗病毒治疗的条件 ALT高于2 ULN 正常值上限 HBV DNA大于105拷贝 毫升 HBeAg阳性 或104拷贝 毫升 HBeAg阴性 ATL持续正常的患者可暂不进行治疗 每隔3 6个月随访肝功能 血清病毒学标志物和进行肝细胞肝癌监测ALT水平在1 2倍ULN之间 需根据具体情况 如肝活检结果等 在告知患者治疗的利与弊 了解患者配合程度的前提下 决定是否实施治疗 无论治疗与否均应密切随访 为治疗提供更为科学的根据 14 HBV DNA定量 慢性乙肝的治疗监测 治疗前检测患者的基线水平 ALT HBV DNA 治疗开始后前三个月每月一次 以后每三个月一次检测ALT HBV DNA 对于HBeAg阳性患者 还需检测HBeAg如果治疗期间HBV DNA水平降低两个数量级 可以认为治疗有效 15 HBV DNA定量 疗效评价 1 生化学应答 完全应答 2次监测ALT均复常 间隔1个月 无应答 ALT未恢复正常 值得注意的是评价生化学应答时应排除其他药物或疾病对ALT升高或下降的影响 16 HBV DNA定量 疗效评价 2 病毒学应答 完全应答按所采用的HBVDNA检测方法说明书上提供的实验敏感性和检测范围确定 临床上一般认为采用国际公认的检测方法或敏感性相当的检测方法检测HBVDNA定量 105拷贝 毫升或斑点杂交法阴性为完全应答 部分应答为未达完全应答标准但HBVDNA载量下降大于2个对数级 无应答为未达上述标准 17 HBV DNA定量 疗效评价 3 血清免疫学应答 完全应答为HBeAg 抗HBe血清转换 部分应答为HBeAg阴转但未出现抗HBe 无应答为未达上述标准 18 HBV DNA定量 综合疗效评价 1 完全应答为疗程结束时 生化学 病毒学和血清免疫学所有指标均达到完全应答 19 HBV DNA定量 综合疗效评价 2 部分应答为疗程结束时 生化学 病毒学和血清免疫学指标介于完全应答和无应答之间 20 HBV DNA定量 综合疗效评价 3 无应答为疗程结束时 生化学 病毒学和血清免疫学指标均为无应答HBeAg阴性伴HBVDNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者不进行血清免疫学应答评价 但应进行生化学和病毒学指标的疗效评价 21 HBV DNA定量 何时可以停药 1 治疗前HBeAg阳性的患者 治疗1年时综合疗效达到完全应答者建议至少继续用药6个月 期间每3个月1次复查ALT HBVDNA HBeAg 抗HBe 仍持续完全应答者可停药观察 22 HBV DNA定量 何时可以停药 2 治疗前HBeAg阳性的患者 治疗1年时综合疗效达到部分应答者建议继续用药直至达到完全应答后 再继续用药至少6个月 期间每3个月1次复查ALT HBVDNA HBeAg 抗HBe 仍持续完全应答者可停药观察 23 HBV DNA定量 何时可以停药 3 治疗前HBeAg阳性患者治疗1年时综合疗效仍无应答可停药观察 或改用其他有效的抗病毒药治疗 对于有肝脏组织学检查等其它临床指征显示病情进展合并肝功能失代偿或肝硬化的病人 不宜轻易停药 并应加强对症保肝治疗 24 HBV DNA定量 何时可以停药 4 HBeAg阴性伴HBVDNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者 综合疗效完全应答者疗程至少2年 对于完成1年治疗仍无应答者可改用或加用其他有效治疗方案 25 HBV DNA定量 治疗后的随访 无论有否治疗应答 都应对患者定期随访 建议停药后的前3个月每月1次 以后每3 6个月1次检测ALT AST HBV血清标志物和HBVDNA 以及临床表现和不良反应 随访至少6 12个月 如病情有变化 可随时随访 26 HBV拉米夫定耐药 虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著 但长期使用拉米夫定会出现耐药现象使用一年 二年 三年 四年的耐药比率为 15 32 38 56 67 一旦出现拉米夫定耐药突变 YMDD变异 大多数患者会在2 4个月之内出现HBV DNA和ALT反弹 27 YMDD变异检测 采用实时荧光定量PCR方法 不仅能够检测出现的突变类型 YVDD或YIDD 而且能够确定突变株所占比例 对及时调整治疗方案具有非常重要的意义能够准确稳定的检测到1 的突变株 能够更早发现耐药突变 尽早调整治疗方案 28 HBV拉米夫定耐药突变检测试剂原理 HBV检测I突变检测V突变检测 29 YMDD的定量检测 采用选择性引物 基于TaqMan实时PCR技术 在三个平行反应中分别扩增总HBV C管 YIDD I管 YVDD V管 根据管间Ct值差异计算突变毒株在病毒群体中的比例 30 2019 12 27 31 YMDD的定量检测 32 YMDD的定量检测 33 YMDD的定量检测 34 YMDD的定量检测 35 YMDD的定量检测 36 与其它方法的比较 Comparisonofresultsobtainedbysequencing pyrosequencingandreal timePCRTypesSequencingpyrosequencingreal timePCRrtM20425 36 24 35 23 33 rtM204I26 38 24 35 21 30 rtM204V18 26 19 27 20 29 rtM204I rtM204V02 3 5 8 37 YMDD变异定性判断的临界值 定性判断 Ct 3 5 此时病毒群体中突变株比例大于10 与测序法比较 15例标本结果完全符合 38 YMDD变异定性判断的临界值 39 什么时候开始检测YMDD变异 拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况治疗时间HBVDNA大于104copies ml例数YMDD变异例数 6个月61 17 6 12个月2614 54 12 24个月3826 68 24 36个月3838 100 各组之间两两比较均有显著差异 P 0 05 40 YMDD变异株的动态变化 41 YMDD变异株的动态变化 42 YMDD检测试剂 应用方法 对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测治疗前检测一次 约有10 20 的人在治疗前就有YMDD变异 治疗开始后第七个月开始 每三个月检测一次拉米夫定耐药 替比夫定耐药 YIDD 恩替卡韦治疗YMDD变异患者存在耐药高风险 43 慢性乙肝的基因分型 乙肝病毒分八个基因型 根据基因组序列的差异可以分为A H八种亚型 我国以B型 41 和C型 53 为主不同基因型病毒感染的病程和后果不同 C型对肝的损伤比B型严重 基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化不同的基因型对药物的应答也不一样 基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高 44 HBV基因分型PCR检测试剂 运用多重 多色实时PCR技术 分别对乙肝病毒 HBV 各种基因型序列进行分析根据国内HBV基因型的特点 设计能检测HBVA D四种基因型特异性引物及探针研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒 HBV 基因分型多重 多色实时PCR检测试剂盒 45 HBV基因分型 结果判断方法 46 HBV基因分型 分型识别率 分型识别率 12 22 35 97 47 HBV基因分型 分型灵敏度 1 HBVB型血清样本灵敏度约在2 103IU ml 48 HBV基因分型 分型灵敏度 2 HBVC型血清样本灵敏度约在1 103IU ml 49 共价闭合环状DNA cccDNA 检测 HBVcccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板只有彻底清除了cccDNA 乙肝的治疗才能算真正有效HBVcccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标 50 HBVcccDNAPCR检测试剂 运用实时PCR技术 根据乙肝病毒共价闭合环状DNA cccDNA 和双链松弛环状DNA rcDNA 分子结构上的差异 即rcDNA负链上的缺口和正链的不完整性 设计一对特异性cccDNA的引物 分别杂交于1500和2100邻近区域 以EcoRI切点为物理起始原点 同时设计一条杂交于负链3 端近缺口处检测探针 研制开发具有自主知识产权的HBVcccDNA实时PCR检测试剂盒 51 HBVcccDNA检测试剂原理 rcDNA不能被扩增无荧光信号 cccDNA能被扩增检测到荧光信号 52 阿德福韦治疗乙型肝炎 阿德福韦为5 单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物 可明显抑制HBVDNA复制HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者 1 2 3年时的耐药发生率分别为0 1 6 3 1 HBeAg阴性者1 2 3年的耐药发生率分别为0 3 0 5 9 11 53 阿德福韦耐药突变位点 rtN236T rtA181V T 54 恩替卡韦治疗乙型肝炎 拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至30倍 发生YMDD变异患者治疗1年时对恩替卡韦耐药发生率为5 8 并出现相关的位点变异 55 恩替卡韦耐药突变位点 如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和 或rtM204V I rtT184 rtS202和 或rtM250等位点变异将造成对恩替卡韦耐药 56 HBV耐药与分型同时检测 57 HBV耐药与分型同时检测 58 1896突变的诊疗意义 G1896A点突变 形成终止密码子 TAG 不表达HBeAg 由于e抗原不能合成 血清中检测不到HBe