基因工程的操作程序PPT课件.ppt

复习回顾 1 基因工程又称为 基因工程的原理是 2 基因工程中用到的工具中 分子手术刀 是 来源是 其作用是 体现了酶的什么特性 作用部位是什么键 3 限制酶切割之后的结果是产生 从中轴线两侧切割得到的是什么末端 从中轴线处切开呢 4 获得目的基因需要切几个切口 产生几个黏性末端 切割质粒呢 5 分子缝合针 是 根据什么分为两大类 哪两大类 这两类酶的区别是 6 DNA连接酶连接的是 DNA聚合酶连接的是 7 DNA连接酶作用于什么键 1 8 载体主要有哪几类 其中 最常用的是 它的本质是 9 载体必须具备的四个条件是 10 写出限制酶切割后的黏性末端 2 基因工程的基本操作程序 3 原核细胞的基因结构 补充内容 非编码区 非编码区 编码区 编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点 启动子 终止子 不编码蛋白质 编码蛋白质 连续不间断 编码区 非编码区 原核细胞的基因结构 调控遗传信息表达 上游有启动子 下游有终止子 4 真核细胞的基因结构 补充内容 编码区 与RNA聚合酶结合位点 内含子 外显子 启动子 终止子 编码区上游 编码区下游 真核细胞的基因结构 编码区 非编码区 外显子 能编码蛋白质的序列内含子 不能编码蛋白质的序列 有调控作用 上游有启动子 下游有终止子 非编码序列 包括非编码区和内含子 5 基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤 1 目的基因的获取 2 基因表达载体的构建 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 问题1 6 一 目的基因的获取 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因 还有植物的抗病 抗病毒 抗细菌 基因 种子贮藏蛋白的基因 以及人的胰岛素基因 干扰素基因等 1 目的基因主要是指 编码蛋白质的基因 目的基因指的是 也可以是具有调控作用的因子 7 获取目的基因的常用方法有哪些 1 从基因文库中获取目的基因2 利用PCR技术扩增目的基因3 人工合成目的基因 反转录法 化学合成法 8 一 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断 导入到受体菌的群体中储存 各个受体菌分别含有这种生物的不同基因 称为基因文库 1 基因文库概念 2 基因文库类型 包含一种生物的所有基因 包含一种生物的一部分基因 9 一 从基因文库中获取目的基因 3 基因组文库的构建 提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶 一定大小的DNA片段 将DNA片段与载体连接 导入受体菌中储存 基因组文库 10 4 cDNA文库的构建 提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA 单链DNA 双链cDNA片段 重组载体 与载体连接 cDNA文库 反 逆 转录酶 DNA聚合酶 导入受体菌中储存 11 两种基因文库的主要区别如下表 课本P10 总结 12 1 概念 PCR全称为 是一项在生物 复制 的核酸合成技术 3 条件 2 原理 多聚酶链式反应 体外 特定DNA片段 DNA双链复制 二 利用PCR技术扩增目的基因 模板 目的基因 原料 脱氧核苷酸 引物 一小段单链DNA 耐高温的DNA聚合酶 Taq酶 温度控制 4 操作前提 一段已知目的基因的核苷酸序列 以便合成引物 13 6 结果 5 扩增形式 指数形式 2n 在短时间内大量扩增目的基因 7 过程 a 变性 90 95 双链DNA模板在热作用下 断裂 形成 b 复性 55 60 系统温度降低 引物与DNA模板结合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 从引物开始进行碱基互补配对 合成与模板互补的 氢键 单链DNA 双链 DNA链 14 15 二 利用PCR技术扩增目的基因动画演示 16 三 人工合成目的基因 反转录法 以目的基因转录成的信使RNA为模板 反转录成互补的单链DNA 然后在酶的作用下合成双链DNA 从而获得所需的基因 17 化学合成法 DNA合成仪 推测 推测 合成 前提 基因比较小 核苷酸序列已知 蛋白质的氨基酸顺序 mRNA核苷酸序列 基因DNA的核苷酸序列 目的基因 18 问题4 3 如果不知道目的基因的核苷酸序列 可采用 获取目的基因的三种方法应用 1 如果有目的基因的核苷酸序列 而且基因比较大 可采用 2 如果知道目的基因的序列 而且基因比较小 可采用 PCR技术扩增 化学合成法 从基因文库获取的方法 19 复习回顾 1 基因工程的基本操作程序的四个步骤是 核心是 2 目的基因指的是什么基因 3 获取目的基因常用的三种方法是 其中人工合成法又包括哪两种 4 基因文库包括哪两类 5 PCR的原理是 PCR全称是 PCR扩增过程中的解旋方式是 PCR需要的条件有 6 基因表达载体的构建的目的是 7 一个基因表达载体的组成包括哪几部分 8 标记基因的作用是 9 启动子 终止子的位置 作用 起始密码子 终止密码子呢 20 二 基因表达载体的构建 基因工程的核心 1 目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在 并且可以遗传给下一代 同时使目的基因能够表达和发挥作用 21 启动子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片断 RNA聚合酶识别和结合的部位 启动转录终止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断 能终止mRNA的转录 与终止密码子区别 标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因 从而将有目的基因的细胞筛选出来 23 3 基因表达载体的构建过程 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口四个黏性末端 DNA连接酶 重组DNA分子 重组质粒 同一种 一个切口两个黏性末端 24 三 将目的基因导入受体细胞 25 4 目的基因导入受体细胞的方法 26 1 将目的基因导入植物细胞的方法 1 农杆菌转化法 农杆菌特点 易感染双子叶植物和裸子植物 对大多数单子叶植物没有感染能力 原理 Ti质粒上的T DNA可以转移到受体细胞 并整合到受体细胞染色体的DNA上 27 三 目的基因导入受体细胞 构建基因表达载体 转入 农杆菌 植物细胞 导入 稳定维持和表达 过程 28 2 基因枪法 目的基因导入单子叶植物细胞 29 基因枪法 30 3 花粉管通道法 将目的基因导入植物细胞 操作方法 在植物花受粉后 花粉形成花粉管还末愈合前期 剪去柱头 然后 滴入DNA 含的基因 使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 特点 十分简便经济 例 转基因抗虫棉 我国 31 4 将目的基因导入动物细胞 方法 显微注射法 目的基因表达载体提纯取卵 受精卵 显微注射受精卵新性状动物 为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞 全能性受限制 32 5 将目的基因导入微生物细胞 微生物作受体细胞优点 繁殖快 多为单细胞 遗传物质相对少 常用菌 大肠杆菌 常用法 Ca2 处理获得感受态细胞 改变细胞壁的通透性 过程 Ca2 处理大肠杆菌 感受态细胞 感受态细胞吸收DNA 表达载体与感受态细胞混合 33 导入过程完成后 全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少 且有的会摄入载体 载体 目的基因 目的基因类型 目的基因进入受体细胞后 是否都能稳定维持和表达 不一定 需要检测 问题4 问题5 34 检查是否成功 分子水平 个体水平 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 工具 方法 工具 方法 工具 DNA分子杂交 DNA探针 分子杂交 DNA探针 抗原 抗体杂交 抗体 四 目的基因的检测与鉴定 方法 接种实验 35 转基因生物的DNA 探针 15N 15N 14N 14N 1 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 基因探针 放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段 方法 DNA分子杂交技术 变性 变性 36 知识延伸 DNA分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则 把互补的双链DNA解开 把单股的DNA小片段用同位素 荧光分子或化学发光催化剂等进行标记 之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交 从而检出所要查明的DNA或基因 37 变性 方法 分子杂交技术 2 检测目的基因是否转录出了mRNA 探针 15N 15N 转基因生物的mRNA 14N 14N 38 提取 3 检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法 抗原 抗体杂交 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 39 4 除上述分子检测外 有时还需进行个体生物学水平的鉴定 如抗性特性 40 检查是否成功 分子水平 个体水平 检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 检测目的基因是否转录出了mRNA 检测目的基因是否翻译成蛋白质 抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等 方法 工具 方法 工具 方法 工具 DNA分子杂交 DNA探针 分子杂交 DNA探针 抗原 抗体杂交 抗体 四 目的基因的检测与鉴定 方法 接种实验 41 归纳 基因工程的基本操作程序 获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因 启动子 终止子 标记基因将目的