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沙眼衣原体检测新进展 杨会林 衣原体Chlamydia 一类能通过细菌滤器 专性真核细胞内寄生 有独特发育周期的微生物 体积略大于病毒 光学显微镜下可见 具有DNA RNA两种核酸 核糖体和近似细胞壁的膜 以二分裂方式进行增值 能被抗生素抑制 现归于广义的细菌范畴 沙眼衣原体C trachomatis 具有特殊发育周期 镜检可观察到两种不同形态结构 1 原体 EB 存在于细胞外 具有高度感染性2 始体 RB 存在于细胞内 繁殖型 代谢活泼 无感染性 衣原体分类 按第九版Bergey细菌学分类手册 衣原体分类上属于衣原体目 Chlamydiales 下有衣原体科 Chlamydiceae 衣原体属 Chlamydia 根据衣原体的抗原结构和DNA同源性特点 衣原体分为四个种 包括沙眼衣原体 C trachomatis 肺炎衣原体 C pneumoniae 鹦鹉热衣原体 C psittaci 和家畜衣原体 C pecorum 前三种对人致病 以沙眼衣原体 CT 常见 沙眼衣原体C trachomatis 分A B Ba C D Da E F G H I Ia J K L1 L2 L2a L3等18个血清型 不同血清型能引起不同疾病 分3个生物型 即小鼠生物型 沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿型 后两者与人类疾病相关 CT抗原结构 属特异性抗原 衣原体胞壁脂多糖 LPS 识别表位位于2 酮基 3 脱氧辛酸 KDO 三糖可与肠道菌Re突变株发生交叉反应种特异性抗原 主要外膜蛋白 MOMP 可进行补体结合试验和中和试验检测型特异性抗原 位于MOMP上 沙眼衣原体 CT 感染 感染眼结膜引起沙眼 包涵体结膜炎 沙眼衣原体是性传播疾病的主要病原体 在男性主要引起非淋菌性尿道炎或可合并附睾炎 前列腺炎 性病淋巴肉芽肿等 在女性可引起尿道炎 宫颈炎 输卵管炎 盆腔炎等 严重患者可导致不孕及异位妊娠 能通过性接触或非性接触方式感染新生儿 儿童 引起新生儿肺炎和新生儿包涵体结膜炎 给预防沙眼衣原体感染带来很大困难 沙眼衣原体 CT 感染 沙眼衣原体感染 沙眼衣原体感染 沙眼衣原体 CT 感染 常与淋病奈瑟菌混合感染 50 淋病奈瑟菌对衣原体繁殖起着激活和促进作用 衣原体感染能增加人群获得HIV的概率 最近有研究提出 CT感染能提高患癌症风险 CT感染可破坏p53蛋白 增加突变细胞存活的风险 最终引发癌症 沙眼衣原体感染流行病学 传播途径 通过性接触传播 母婴垂直传播 接触沙眼患者的毛巾 不洁洗脸水和脸盆传播 在女性宫颈炎和男性尿道感染中 临床上常表现为无症状 呈隐性感染 成为携带者 更易导致感染传播 沙眼衣原体感染流行病学 据世界卫生组织估计 每年有9200万新发的沙眼衣原体感染病例 在美国 DattaSD等调查显示 14岁 39岁的群体中 沙眼衣原体的感染率约为4 6 在欧洲 RedmondS等的一项大规模调查显示 18岁 26岁之间有过性经验的群体中 沙眼衣原体的感染率约为3 6 PetersR等统计指出 在非洲一些国家的的乡下 女性沙眼衣原体的感染率可达16 以上 沙眼衣原体感染流行病学 在中国LiCL等于2012年湖北省的一项婚前筛查报告显示 有3 6 的婚前女性感染沙眼衣原体 ChenXS等2013年一份针对女性性工作者的研究显示 在女性性工作者中 衣原体感染率高达17 3 有调查统计显示 深圳地区非淋球菌性尿道炎患者中 男性患者沙眼衣原体的检出率为30 57 女性为21 19 沙眼衣原体感染防治 沙眼衣原体对阿奇霉素 强力霉素 喹诺酮类抗生素敏感 确诊后容易治疗 防治沙眼衣原体感染和传播的主要难点在于准确 及时找到病原菌 CT标本采集及运送 标本采集 1 沙眼及包涵体结膜炎患者 擦净脓性分泌物 用拭子在结膜上穹窿或下穹窿用力涂擦 或取眼结膜刮片 2 泌尿生殖系统感染患者 男性患者用无菌棉拭子插入尿道口2cm出旋转3 5秒后取出 女性患者选取宫颈移行部位采样 3 小儿肺炎患者 用拭子在鼻咽后部或咽部采集 4 性病肉芽肿标本 采集淋巴结脓汁 标本运送 置于2SP培养基运送 2SP培养基含蔗糖 磷酸盐缓冲液 胎牛血清 抗生素等成分 标本采样后5天内检验 标本应暂存于4 沙眼衣原体的检测技术 直接涂片镜检 检测包涵体细胞培养抗原检测 直接荧光抗体测定 酶免疫测定 胶体金法抗体检测核酸检测 核酸探针检测 PCR 荧光定量PCR PCR产物直接测序 直接涂片染色镜检 CT寄生于细胞内形成包涵体 通过碘染色或吉姆萨染色可见细胞内包涵体 直接涂片染色镜检 方法学评价 直接涂片染色镜检 操作简便 包涵体的检出对急性 严重的新生儿包涵体性结膜炎的诊断价值大 泌尿生殖道内完整细胞少 细胞内包涵体脆性较大 造成敏感性较低 细胞培养法 由于CT专性细胞内寄生 可用6 8天龄鸡胚卵黄囊及各种传代细胞培养 在适宜条件下 将含CT的标本接种于经放线菌酮处理过的单层小鼠成纤维细胞 McCoy 或人宫颈癌细胞 Hela 299 孵育后染色 镜下检测包涵体 衣原体细胞培养法 细胞培养步骤 制备致密单层细胞 以Hela 299细胞为例 六孔板每孔接种75万细胞 孵育24小时 以30ug mlDEAE 葡聚糖处理细胞30min 提高细胞膜内吞能力 弃掉DEAE 葡聚糖 换5ml未加血清的培养液 加入菌液 菌液的量要根据菌液浓度而定 过高会造成细胞病变过快 提前大量死亡 过少会造成阳性率过低 无法观察或计数 六孔板3000rpm1238g离心 通过物理作用加速促进衣原体进入细胞 有文献报道 通过离心可以提高感染效率100倍 衣原体细胞培养法 孵箱中孵育两小时 提供衣原体进一步感染的时间 也给细胞一个回复状态的时间 更换感染液 细胞培养液 1 g mL放线菌酮 48 72小时碘染色或Giemsa染色或Macchavello染色观察结果 衣原体细胞培养法 衣原体细胞培养法 特异性100 和敏感性80 90 被认为是CT检测的 金标准 分离培养操作复杂 技术要求高 所需时间长标本敏感性受标本采集 运送 保存等的影响较大各实验室技术水平不同 标准化难度大多用于科研和临床疑难病例的最终鉴定 胶体金法 胶体金法 衣原体标本预处理后与胶体金标记抗体及二抗结合优点 快速简单 半小时内出结果 易于观察判断 缺点 敏感性低 不能定量检测 不同公司试剂和同一公司试剂批间差异大 酶免疫测定 EIA 用ELISA方法 使用酶标记的单克隆或多克隆抗体检测CT的可溶性抗原 常用脂多糖 LPS 单克隆抗体或多克隆抗体进行检测 酶免疫测定 EIA 敏感性为64 98 特异性为93 98 简便 适用于自动化 适于短时间内大批量标本的检测与其它微生物感染偶有交叉反应 如金黄色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 A群 B群链球菌等 微量荧光免疫法抗体检测 检测患者血清中有无CT抗体 性病性淋巴肉芽肿 附睾炎 输卵管炎患者血清中CT水平明显升高 该方法有助于诊断 部分患者感染CT后并不产生或仅产生少量抗体 此时检测容易出现假阴性结果 检测重复性差 目前并无统一标准 不建议单独用于CT感染诊断 直接荧光抗体测定 DFA 用荧光物标记CT单克隆或多克隆抗体 多为抗沙眼衣原体MOMP单克隆抗体 与相应抗原结合反应 直接进行观察 直接荧光抗体测定 DFA 在男性和女性样本中敏感性分别为70 100 和68 100 特异性分别为87 99 和82 100 检测快速简便 不像培养法必须有活力的CT 对子宫内膜和输卵管样本 DFA法敏感性高于培养法 且适用于直肠样本 敏感性与特异性取决于单克隆或多克隆抗体 荧光容易淬灭 结果判断有主观性和经验性 不适合于大批量样本检测 核酸杂交法 用125I标记CTrDNA探针检测宫颈拭子 敏感性与特异性分别为细胞培养法的82 8 和99 4 用吖啶酯标记单链DNA探针 与标本中CTrRNA杂交 用化学发光法测定 敏感性与特异性分别为60 93 和95 8 98 8 PCR检测 提取DNA 设计引物及探针 扩增特定DNA片段1 普通PCR 易污染引起假阳性 不能定量检测 2 荧光定量PCR 全闭管扩增系统 避免污染 以参照物为标准 能对拷贝数进行定量分析 荧光定量PCR检测 PCR检测 特异性高 敏感性好 荧光定量PCR无电泳所致的交叉污染定量检测 目前有研究认为泌尿生殖系统中CT的感染量与患者的临床表现有关 CT定量检测有助于临床诊断与疗效判断 男性可以以尿标本代替传统的尿道拭子 方便收集样本 容易为患者接受 可以设计同一病原体不同DNA片段的二重PCR技术 有效检测某一目的基因发生突变的标本 可以检测不同病原体的二重PCR 如雅培公司CT NG试剂盒 较传统检测方法通量高 适用于大规模流行病学研究 EIA PCR DFA三种方法比较 PCR产物直接测序 CTMOMP基因经过PCR扩增后 再将PCR产物测序 可以完成对CT的分型检测 单血清型CT感染检测的金标准 适于单血清型CT感染分型检测及大规模流行病学调查 测序方法不适于双重或多重感染 而CT双重或多重感染率为