镁离子浓度对细胞融合效果的影响.doc

本科毕业论文 题 目 镁离子浓度对细胞融合效果的影响 学 院 生命科学学院 专 业 生物技术 毕业届别 2012届 姓 名 张菲菲 指导教师 杨杰 职 称 讲师 目 录摘要1关键词1Abstract 1Keywords 1前言11材料与法21.1 实验材料21.1.1 试剂21.1.2 仪器21.2 实验方法 31.2.1 细胞的采取及细胞悬液的制备31.2.2 50%PEG的制31.2.3 细胞融合 31.2.4 细胞融合率的计算方法 31.2.5 细胞融合过程 32 结果32.1 鸡血细胞融合的过程的观察 42.2 在适宜条件下，不同镁离子浓度对应不同细胞融合效率 43讨论和分析5 参考文献5致谢6Mg2+ 浓度对细胞融合效果的影响张菲菲（甘肃农业大学生命科学学院生物制品专业，甘肃兰州，730070）摘要：细胞融合是细胞生物学领域近30年来得到迅速发展的一项新兴技术手段，因其操作简便、人工可控等优点在研究核质互作、肿瘤发生、疫苗研发和培育新型生物品种等方面均有广泛应用。其中，利用聚乙二醇（PEG）进行化学融合是细胞融合中最为常用且简便的技术手段。本文旨在为了更全面了解 PEG 法诱导的化学细胞融合，通过优化融合条件以提高化学细胞融合效率。以鸡红细胞为材料,以PEG(Mw= 6000)为诱导剂，研究Hanks溶液中不同的镁离子浓度相对应的细胞融合率，确定细胞融合率适宜的镁离子浓度范围。通过实验确定镁离子浓度在1030 mmol/L范围类细胞融合率最大。关键词：Mg2+；细胞融合；鸡血红细胞The Effect of Mg2+Concentration on Cell FusionZhangfeifei(College of life Science and Technology,Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)Abstract: Objective:cell fusion is the field of cell biology for nearly 30 years to get the rapid development of an emerging technology, because of its simple operation, the advantages of artificial controlled study Cytoplasmic, tumor, vaccine development and nurturing of new biological varieties terms are widely used. Among them, the use of polyethylene glycol (PEG) chemically fused cell fusion is the most commonly used and simple techniques. This article is intended for a more comprehensive understanding of PEG induced by chemical cell fusion, fusion by optimizing the conditions in order to improve the efficiency of chemical cell fusion. Methods: chicken erythrocytes as materials, PEG (Mw = 6000) as inducer, research Hanks solution in different concentration of magnesium ions corresponding cell fusion rate, determine the appropriate cell fusion rate of magnesium ion concentration range. The results show: the magnesium concentration in 10 30 mmol / L range largest class of cell fusion rate Key words: Mg2+;ell fusion;Red blood cell前言细胞工程是四大生物工程之一，细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术的不断改进一方面表现在融合剂上，另一方面体现在新方法上再者体现在融合对象的不断扩展上1。所谓细胞融合(cell fusion)，就是在自发或人工诱导的条件下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞2。基本过程主要包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。细胞融合在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等；在动物方面重要应用就是制备单克隆抗体。单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点，因此探究影响细胞融合的因素也已越来越重要。细胞融合依据融合过程采用的助融剂的不同可分为：（1）病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒；（2）学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇；（3）电场诱导的细胞融合,此外还有激光诱导的细胞融合3。其中 PEG 介导细胞融合法是动物细胞融合最简单最常用的方法，具有操作简便，不需复杂仪器，容易获得融合，并且融合效果好等优点而被广泛应用。PEG细胞融合法也有很多影响因素：如PEG分子量与浓度，PEG的PH值，融合时的温度和PEG的处理时间4等等。然而，目前关于PEG法诱导细胞融合的影响因素的研究还不够全面，关于配方优化的详细报道也不多，需要我们来做更多的实验来研究。从离子浓度展开研究是提供细胞融合改进方案的新思路，具有很重要的意义。为此我们以鸡红血细胞为材料，探讨了Mg2+浓度对细胞融合的影响，以期确定获得较高细胞融合率的各项指标的数据范围，进一步扩宽PEG诱导细胞融合的应用范围。1材料与方法 1.1 实验材料1.1.1 试剂公鸡静脉血，柠檬酸钠，PEG（MW=6,000），MgSO4（国药集团），0.85 %生理盐水，Hanks溶液，Janus green B 染液（Solarbio 公司）。Hanks 缓冲液配方： 甲液：NaCl 80.0 g ，KCl 4.0 g，MgSO47H2O 1.0 g，MgCl26H2O 1.0 g，蒸馏水400.0 mL，CaCl2（无水）1.4g，蒸馏水 50.0 mL将两种液体混合后，加水至 500.0 mL，滤纸过滤，储存于4.0 ； 乙液：Na2HPO412H2O 0.03g，KH2PO40.6 g，葡萄糖 10.0g，蒸馏水水400.0 mL，滤纸过滤，加入 0.5 % 酚红 40.0 mL，加水至 500.0 mL，储存于4.0 。 甲乙液各1 份，蒸馏水18 份，用 5.6 %NaHCO3调节 pH至 7.40。 1.1.2仪器 电子天平，恒温水浴锅，血球计数板，低速离心机，光学显微镜，试管架，注射器，载玻片，离心管。1.2实验方法1.2.1红细胞的采取及细胞悬液的制备用灭菌的注射器吸入38 g/L的柠檬酸钠2ml，从用75%酒精消过毒的鸡翼静脉处采取静脉血转入事先装有38g/L的柠檬酸钠的烧杯中使柠檬酸钠与血液的体积比为1：4，放入4冰箱中保存，可使用3到4天。1.2.2 50%PEG的配制用MgSO4调节Hanks 溶液 Mg2+离子浓度分别为：10 mmol/L，20 mmol/L，30 mmol/L，40 mmol/L，50 mmol/L，60 mmol/L，70 mmol/L，80mmol/L，90mmol/L；Hanks 原液作为CK对照管；共10种只有Mg2+含量不同的 Hanks缓冲液。称取 1.0 g PEG （MW=6,000）放入试管内，在酒精灯上融化，迅速加入 1.0 mL 预热的 Hanks 缓冲液混匀制成 50 % PEG 溶液，放入 37 水浴中待用。1.2.3细胞融合 取新鲜鸡血，1000rpm离心5min，去上清液后加入 0.85 %生理盐水，用血球板计数法和梯度稀释方法调节细胞浓度为 2.7105/ml；将鸡红细胞悬液 1.0 mL放入离心管中，分别加入5 mL上述10种 Hanks缓冲液液混匀，然后以1000 rpm离心5 min，弃上清，将细胞团块弹散。然后分别滴加10种 50%PEG的细胞融合液 1.0mL，混匀，37水浴中静置 30 min 进行融合。融合完成后，缓慢滴加 5.0mL 相应 Hanks 缓冲液以终止 PEG 的作用，在37水浴内静置5分钟。以 1000rpm，离心 5 min，弃上清，保留下液。1.2.4细胞融合率的计算方法随机计数显微镜几个视野内1000个细胞,分别计数其中已发生融合的细胞核、未融合细胞核数,计算融合细胞核数占细胞核总数之百分比即融合率5,6,7。其公式如下:融合率=融合细胞核数/总细胞核数 100%1.2.5细胞融合过程 取细胞悬液12滴依次制成临时制片，以Janus green B 染色3min，在普通光学显微镜下观察细胞融合的过程8。2结果2.1鸡血细胞融合的过程的观察通常细胞膜有内外两层，细胞融合首先发生在外层，然后再到内层，由此就出现了两种融合通道，细胞体内物质通过这两种通道转移。在照片中的细胞形态是呈现有一个共同的膜包被，通过染液染色后，可以很清楚的看到两个或多个细胞核存在于一个细胞类的现象，通过图1可以看到不同实验组融合结果的显微镜照片。另外，可以看到在镁离子浓度在80 mmol/L的时候，通过观察，细胞皱缩，细胞质也出现着色，出现死亡的现象。2.2在适宜条件下，不同镁离子细胞浓度对应不同细胞融合速率通过显微镜的观察，我们可以清清楚楚的看到染色后细胞融合的现象，并且它们融合个数依次减小，通过可以图1看到。由表1可知，可以确定在镁离子浓度在10 mmol/L30 mmol/L范围类细胞融合效率最大，融合效果最好。表1不同Mg2+浓度对细胞融合效果的影响Table1:The effect of Mg2+concentration on cell fusionMg2+mmol/LCk102030405060708090融合率%15222017974211 图1细胞融合镜检，放大倍数100Fig1: Microscopy of Cell fusion，Magnification 100Note: A. Hanks (CK)；B. 10 mmol/L Mg2+；C. 20 mmol/L Mg2+；D. 50 mmol/L Mg2+；E. 80 mmol/L Mg2+ 3讨论和分析 细胞融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径，这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。聚乙二醇(PEG)是目前应用最为广泛的细胞融合诱导物,其诱导细胞融合的效果稳定，它的作用机理是对水有极高的亲和性，可与水分子借氢键结合，在高浓度（50%）PEG溶液中自由水消失，导致细胞脱水发生质膜结构的变化，从而引起细胞脱水9。活细胞是一个完整的渗透系统，当细胞处于不同浓度的溶液中时,必定会发生不同的变化，因此我们通过PEG介导的细胞融合，改变其镁离子浓度来更好的完善细胞融合效率。在实验中，我们可以观察和CK组对照，镁离子浓度越大，细胞融合的也越来也少，呈梯度变化，并且在10 mmol/L30 mmol/L范围类，细胞融合最多，且数量最大。由于Mg2+浓度对于细胞融合效果的影响目前尚未有报道，关于 Ca2+浓度对于细胞融合的影响，刘哲等证实50 mmoL/L的 Ca2+浓度可以有效促进细胞融合，并在实验中指出 100 mmol /L的 Ca2+会导致细胞破裂，我们在实验中发现 Mg2+的浓度为80 mmol /L时细胞表现为皱缩变形，死亡数量增加，表现为细胞质Janus greenB 染液着色10。综合分析，PEG法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器设备、操作方便等优点，被普遍用于生物、遗传、医药等研究领域11,12。因此，对PEG介导细胞融合的最适条件探究显得尤为必要。镁离子浓度对细胞融合能产生影响，在实验中我们需要调节镁离子浓度为10 mmol/L30 mmol/L范围类，可以促进细胞的融合。另外，细胞融合的影响因素还有很多，如PH、温度、葡萄糖、稀释的细胞浓度等。鲁云风等13对于蟾蜍的实验发现，蟾蜍血红细胞最适融合温度与鸡血红细胞最适融合温度的不同可能是分别为冷血动物和恒温动物导致的。随着科技的发展，细胞融合会有更大的突破，更大的应用，未来科学家会将细胞融合的效率会提高的更好，研究更彻底，使其日益完善，为社会做出贡献。PEG介导的细胞融合会更好，毕竟PEG法以便宜的价格和高的细胞融合率被广泛应用。因此，PEG化学融合法也在未来不断被涉及其他方面的研究，更好的提高细胞融合率，也是细胞融合发展的一个新方向，一个为社会更好的研究。参考文献1罗立新.细胞融合技术与应用M.北京:化学工业出版社,2003:1-12李小玉,胡火珍,张建国.用鸡红细胞取代 Hela 细胞进行细胞融合的实验研究J. 四川解剖学杂志, 2002, 10(3): 132-1333赵彦禹,张艳华,冯照军.鸡红细胞融合最适条件的探讨J.生物磁学, 2006, 6 (1): 43-444仇燕,李朝炜,苗芳. 聚乙二醇诱导鸡红细胞融合条件的优化J.生物技术, 2011, 21(3): 50-535李玲,李雪峰.细胞生物学实验M.一版.湖南科学技术出版社,2003:114-1166王金发,何炎明细胞生物学实验教程北京：科学出版社2011:150-1527李玟.细胞融合实验方法的改进J .汕头大学医学院学报第18卷第3期8耿欣莲,丁克忠,全允栩,韩昭雪,邱山聚乙二醇(PEG)诱导鸡红血细胞和小白鼠腹水型肝癌细胞融合技术的初步探讨J兰州大学学报(自然科学版)1982:18(3):81-809 Kugler A, Stuhler G, Walden P. Rrgression of human metastatictenal cellcarcinoma after vaccinated with tumor cell-dendritic cellhybridsJ. Nat Med, 2000, 6: 33210.杨明轩,游孟昊,王美文,黄文君等葡萄糖浓度对细胞融合效果的影响J现代生物医学进展 2014,17:00911Steubing RW,Cheng S，Numajir I Y，et al Laser Induced Cell Fusion in Combination With Optical TweezersJ.TheLaser Cell Fusion Trap Cytometry，1991，12: 505 -51012鲁云风,杨柯金,杨建伟等. 蟾蜍红细胞融合条件的正交设计优化J. 生物技术，2009，19(6)：44-45致谢 转眼间，我已在甘肃农业大学度度过了四个年头。四年，一段不短的时间，四年的光阴让我成长，让我从青涩走向成熟。特别是，在大四时，让我的人生有了不同的轨迹。在这宝贵的四年生活中，首先我要感谢我的老师杨杰。“授人以鱼，不如授之以渔”，杨老师正是这样以言传身教来教导着我们。毕业论文的每一个过程都凝结着杨老师的心血，论文的每一步，都离不开老师悉心的指导，杨老师对我的影响是巨大而深刻的，这种影响不是一朝的迸发，而是日积月累的渗透，在这点滴汇聚中使我逐渐形成正确、成熟的人生观、价值观。为此，我常常庆幸于我的幸运有这样的导师是我学生生涯的一大幸事！遗憾的是，毕业在即，能够在杨老师身边学习的日子已屈指可数，多么希望时间可以再多些，日子可以再长些，让我可以有更多的时间、更多的机会向杨老师再多学一点。但我知道，我人生的角色该转换了，我该走出校园了，在这转变发生之前我有杨老师给我的如此多的指导，就将使我在面对以后的工作和生活有可以借鉴的资本。在此，我要真诚的说声：“谢谢您，杨老师！”。“君子和而不同”，我们正是如此！愿我们以后的人生都可以充实、多彩与快乐！感谢我的舍友，谢谢你们给予我的帮助！感谢我的朋友，感谢你们在我失意时给我鼓励，在失落时给我支持，感谢你们和我一路走来，让我在此过程中倍感温暖！感谢我的家人：我的父母、姐姐和弟弟。没有你们，就不会有今天的我！我一直感恩，感恩于我可以拥有一个如此温馨的家庭，让我所有的一切都可以在你们这里得到理解与支持，得到谅解和分担。我爱你们，爱我们的家！一个人的成长绝不是一件孤立的事，没有别人的支持与帮助绝不可能办到。我感谢可以有这样一个空间，让我对所有给予我关心、帮助的人说声“谢谢”！今后，我会继续努力，好好工作！好好学习！好好生活！ 张菲菲2012年5月袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇羅膃蚈螂羁膂莈蚅袇膁蒀袀螃膀薂蚃肂腿节衿羈腿莄蚂袄芈蒇袇螀芇蕿蚀聿芆艿蒃肅芅蒁螈羁芄薃薁袆芃芃螆螂芃莅蕿肁节蒈螅羇莁薀薈袃莀艿螃蝿荿莂薆膈莈薄袁肄莇蚆蚄羀莇莆袀袆羃蒈蚂螂羂薁袈肀肁芀蚁羆肁莃袆袂肀薅虿袈聿蚇蒂膇肈莇螇肃肇葿薀罿肆薂螆袅肅芁薈螁膅莃螄聿膄蒆薇袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇羁蒂蚃衿膆莈蚂羁罿芄螁蚁膄膀螁螃羇葿螀袅膃蒅蝿肈羆莁螈螇芁芇莄袀肄膃莄羂艿蒂莃蚂肂莈蒂螄芈芄蒁袆肀膀蒀罿袃薈葿螈聿蒄葿袁羁莀蒈羃膇芆蒇蚃羀膂蒆螅膅蒁薅袇羈莇薄罿膄芃薃虿羆艿薃袁节膅薂羄肅蒃薁蚃芀荿薀螆肃芅蕿袈芈膁蚈羀肁蒀蚇蚀袄莆蚇螂肀莂蚆羅袂芈蚅蚄膈膄蚄螇