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第八章植物胚胎培养 1 植物的胚胎培养是指对植物的胚 子房 胚珠和胚乳等胚胎组织进行离体培养 使其发育成完整植株或者离体研究植物胚胎发生机理的生物技术 植物胚胎培养的概念 胚乳 胚 子房 胚珠 2 8 1离体胚培养8 2植物胚珠和子房培养8 3离体授粉 受精与合子培养8 4胚乳培养 3 8 1 1离体胚培养的概念离体胚培养 embryoculture 指从植物种子中分离出胚组织进行离体培养的技术 包括幼胚培养和成熟胚培养 8 1离体胚培养 花生成熟胚 幼胚 4 8 1 2成熟胚培养 matureembryoculture 是指对发育成熟种子胚的培养 成熟胚培养主要是为了打破种子的休眠 并诱导形成小植株 因此 培养基相对简单 一般只需要大量元素和糖即可 有些培养为了打破种子休眠也加入一些植物激素 水稻成熟胚培养 5 台湾红豆杉成熟胚培养 观赏与药用 紫杉醇 种子有休眠特性 6 牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony 种子有休眠特性 种皮与未完成后熟的原因 7 8 1 3幼胚培养 immatureembryoculture 是指对发育早期胚或未成熟胚的培养 即供给一定的培养条件 使幼胚逐步发育成成熟胚 并进一步发育成小植株的技术 幼胚培养要根据幼胚发育的不同阶段 选用相应的培养基 营养条件和培养条件 远缘杂交杂种胚拯救 使胚发育不全的植株获得大量的后代 8 适当时期未成熟种子 消毒 解剖 剥取完整幼胚 2 培养基常用的培养基有Cox Rijven Rappaport Ranaswamy Norstog以及MS B5 White Nitsch等培养基 碳源 蔗糖是幼胚培养基中最好的碳水化合物 不同发育时期的胚要求不同的蔗糖浓度 往往胚龄越小 糖浓度要求越高 成熟胚 2 而幼胚 4 甚至更高浓度的蔗糖 如曼陀罗的前心形期胚培养要求8 的蔗糖含量 而鱼雷期要降到1 0 0 5 1 幼胚的分离 9 氨基酸 谷氨酰胺是促进离体胚生长最有效的氨基酸 酪蛋白水解物 CH 不同物种的离体胚对CH的浓度要求不同 胚乳提取物 一般认为 八分成熟的椰乳对幼胚培养作用显著 而完全成熟的椰乳作用不明显 大麦胚乳提取物可以促进大麦胚的生长 玉米胚乳组织的提取物能促进离体玉米胚的生长 维生素 对发育初期的幼胚培养来说 则是必须的 以不加植物生长调节剂为宜 10 离体胚培养一般用固体培养基 大多数植物的离体胚在25 30 生长良好 一般离体幼胚培养前期在散射光下培养 后期则要在2000Lx光强度左右培养 4 胚乳看护培养非常幼小的杂种胚 采用看护培养 即把发育不全的杂种胚埋在从正常发育的胚珠中取出的胚乳内 培养至幼苗期 3 培养 11 黄瓜远缘杂种幼胎培养 12 1 正常胚发育离体培养的幼胚 在控制条件下 按照活体内的发育方式发育 最终发育成成熟胚 进而萌发形成小植株 这是幼胚培养胚拯救的正常发育模式 8 1 4离体幼胚培养的生长发育类型 13 植物胚胎发生过程 原胚 球形胚 心型胚 鱼雷胚 子叶胚 球形胚前期 心型胚前期 鱼雷胚 球形胚 14 A 早熟萌发离体的幼胚在培养基上不仅能越过休眠期 而且还常常终止进行此后的胚胎发育 直接长成弱小的幼苗 而且这种幼苗只具有那些当胚离体时已具有的结构 这种未完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫做早熟萌发 大麦未成熟胚离体培养中 CH能促进胚胎的继续发育 抑制早熟萌发 培养基中高浓度的蔗糖 12 18 同样能抑制荠菜胚的早熟萌发 2 异常胚发育 15 在一些植物中 植株上发育的种子并无胚根 胚芽 和子叶的分化 兰花种子球形胚是未分化的 在离体培养条件下 胚即增大形成原球茎 最后由原球茎分化出根和茎 B 胚不完全发育 兔丝子属 Guscuta 植物的成熟胚有胚芽 但没有胚根 在离体培养中很难诱导根的分化 16 离体培养的植物成熟胚和幼胚组织 在外源激素的诱导下 可发生生物钟的强行逆转 经脱分化形成愈伤组织或胚性愈伤组织 并经再分化形成完整植株 如水稻 小麦等 图8 1 C 胚脱分化和再分化 图8 1小麦幼胚体细胞无性系 左 及其再生 右 17 8 1 5影响离体幼胚培养的其它因素 幼胚的发育时期 表8 1荠菜胚胎不同发育时期对营养的需求 引自Torrey 1964 18 胚柄的作用 在培养中胚柄的存在对于幼胚的存活是一个关键因素 表8 3红花菜豆中胚柄对胚在离体条件下生长和发育的作用 引自Yeung等 1979 19 培养基的渗透压 在幼龄胚培养中 培养基的渗透压是控制胚生长的重要因素 母体植株上的幼龄胚是在具有较高渗透压的液体胚乳之中生长 即幼胚被一种高渗液体包围着 郭仲琛 1978 研究表明 向日葵不同发育时期的胚对蔗糖的要求有较大的差异 幼胚长度1 1 1mm 要求蔗糖浓度17 5 成熟胚要求蔗糖浓度只有0 5 20 1 胚拯救A 远缘杂交杂种胚拯救 在远缘杂交中 常因胚发育不良或胚乳不能正常发育以及胚与胚乳之间的不协调等原因 使杂种不育 如果将这类杂种的胚在适期取出 在人工合成的培养基上进行离体培养 则有可能使杂种胚继续发育 生长 从而获得杂种后代 8 1 6离体胚培养的应用 21 在普通小麦与玉米的杂交中 胚胎发生的最初几次分裂期间 父本玉米的染色体被排除 结果形成了只含有一套母本染色体的单倍体小麦胚 但受精后3 12d胚乳逐渐解体 使胚得不到营养在颖果成熟前死亡 B 单倍体胚拯救 图8 2小麦 玉米12d杂种胚拯救 22 果树早熟育种中有一个棘手的问题 就是果实的早熟往往伴随着产生没有生活力的种子 如桃与樱桃 杏等早熟品种 有很高经济价值 但其胚在母体组织内往往不能正常发育 或胚生理成熟速度慢于果实成熟速度 因此 以这些品种作母本进行杂交时 种子往往没有生活力 用一般方法很难得到杂种后代 利用离体胚培养就可以获得有活力的杂交种子或幼苗 2 核果类胚的后熟作用 23 有些植物种子休眠期很长 如鸢尾 lris 一般种子成熟后要休眠2 3年才能萌发 在培养基上几天内种子就能萌发 植物种子休眠的原因可能来自胚乳 因为离体胚如果带着胚乳培养 胚的生长就受到抑制 具有休眠特性的种子 其胚离体培养时 在培养基中加入1 2mg L的赤霉素 对打破种子休眠有显著作用 3 克服种子休眠 24 兰花 天麻等一些寄生植物或附生植物 有的胚只有6 7个细胞 在培养基上培养 胚就能生长发育成正常的植株 4 使胚发育不全的植株获得大量的后代 25 胚培养对于一些具有珠心胚的植物 如柑桔 Citrus 芒果 Mangiferaindica 紫萼等 具有特殊的意义 在柑桔杂交育种中一个问题是杂交往往得不到杂种胚 由于珠心胚的生长把合子胚挤到旁边去 5 用于某些植物杂种胚的繁殖 26 离体胚培养还可用于许多重大理论问题的研究 如胚胎发育过程 影响胚发育的各种因素 胚乳作用以及与胚发育有关的代谢和生理变化等 7 脱分化与再分化培养以幼胚或成熟胚为外植体诱导愈伤组织 建立胚性无性系 不仅可以应用于研究体细胞胚胎发生 分离原生质体 还可应用于植物体细胞遗传饰变和转基因技术的研究等 6 用于有关理论研究 27 植物胚珠结构 28 8 2 1胚珠培养 概念 在人工控制的条件下 对胚珠进行离体培养使其生长发育形成幼苗的技术 1980年成功培养了未授粉的非洲菊 烟草的胚珠 获得了单倍体植株 子房 多个胚珠 29 由于幼胚分离难度大 而胚珠分离则相对容易 在幼胚培养时常采用胚珠培养 分为两种类型 授粉胚珠培养未授粉胚珠培养 30 1 胚珠培养的意义 防止杂种胚早期败育 获得杂种植株 也为拯救心型期胚或心型期以前的胚胎提供了新的途径 授粉前胚珠培养 可作为试管受精的基础 未授粉胚珠培养 能培养获得单倍体植株 用于单倍体育种 31 2 胚珠培养方法 A 材料的选择和灭菌 未授粉胚珠 开花前1 6天 授粉胚珠 授粉后1 120天不等 较晚时期有利于胚的发育 灭菌 先对子房或外表组织消毒灭菌后 后取出胚珠培养 辣椒子房 32 B 培养基多用Nitsch White MS等基本培养基植物激素 细胞分裂素对授粉胚珠发育常有促进作用 有机物 添加有机附加物 椰汁 水解酪蛋白 可以促进授粉胚珠的发育 蔗糖浓度 4 10 33 3 胎座和子房对胚珠培养的影响 带有胎座或子房组织的胚珠相对较易培养 4 胚发育时期的影响 一般来说 合子或早期原胚期的胚珠较难剖取和培养 对培养基的成分要求也较严格 C 培养 子房培养一般温度为20 25 对光照要求不严 大多数植物子房培养早期在黑暗 弱光照条件下生长良好 34 8 2 2 子房培养 包括授粉子房和未授粉子房培养 1949年和1951年最早在黄瓜 番茄 菜豆 草莓 烟草等植物上获得成功 授粉子房培养形成成熟果实和种子 未授粉子房培养形成小的无籽果实 授粉后3d的玉米子房 其中6颗发育成种子 其余产生愈伤组织 35 1 子房培养的意义 获得杂种植株 未授粉子房培养为试管受精提供技术基础 未授粉子房培养能获得获得单倍体植株 用于单倍体育种 百合子房 36 2 子房培养的一般方法 材料制备 未传粉子房培养时 选用开花前1 5d的花蕾 培养基 子房培养常用的培养基有MS Whiter Nitsch等 碳源主要是蔗糖和葡萄糖 浓度为2 5 B族维生素 椰子乳和其它一些天然提取物对子房发育成果实或种子都有良好的促进作用 培养基中附加一定的赤霉素 生长素和细胞分裂素 可使离体子房发育的果实增大 培养 子房培养一般温度为20 25 对光照要求不严 大多数植物子房培养早期在黑暗 弱光照条件下生长良好 37 3 附属花器对子房培养的作用 花被在果实和胚胎发育中成起着重要的作用 双子叶植物各种花的萼片 对培养子房的生长显示了有利的影响 4 胚囊的发育时期对子房培养的作用 从研究较多的大麦和水稻来看 在胚囊发育的各个时期都可以诱导 而以接近成熟的胚囊易于诱导成功 38 两种途径 直接成苗的发育途径 在离体培养条件下 合子胚在胚珠内继续发育至成熟 最终成熟胚在胚珠内萌发 形成小植株 脱分化和再分化途径 离体子房或胚珠内的幼胚等组织脱分化 产生愈伤组织 经诱导后 愈伤组织形成体细胞胚或经器官发生 再形成小植株 8 2 3离体子房和胚珠的发育 39 Fig1MorphologicalaspectsofsomaticembryogenesisinovarycultureofCocosnuciferaL aCallusderivedfromovaryexplantsafter10weeksofcultureinitiation bar 4mm bEmbryogenicstructures Es developedfromcalliaftersub culturingintosomaticembryoinductionmedium bar 5mm cDevelopingshootsingerminationmedium dAcompleteplantletwithroots Rt 椰子的子房培养 40 通过雌配子体的离体培养 可以诱导胚囊细胞发育成单倍体胚 把这种通过未授粉胚珠或子房的离体培养进行单倍体胚胎发育的过程叫雌核发育 gynogenesis 目前已有包括甜菜 小麦 水稻 烟草和玉米等多种农作物可以通过雌核发育途径产生单倍体 8 2 4未授粉胚珠和子房培养 41 愈伤组织和胚状体形成 愈伤组织再分化 胚状体直接成苗 胚状体 愈伤组织 分化成苗 试管苗的移栽单倍体加倍鉴定为单倍体的植株 利用秋水仙素加倍 在固体培养基中附加0 01 秋水仙素处理1 2d 在液体培养基中附加0 3 秋水仙素 在25 下振荡培养5 6h 或用0 2 0 4 秋水仙碱液滴注移栽成活后试管苗生长点 在盆栽条件下处理3 4d 1 离体未授粉胚珠和子房的发育 42 Fig2Plantregenerationinunfertilizedovulecultureofgentian 龙胆草 aUnfertilizedovulesinanovary bOvulesculturedon1 2NLNsolidmedium cELSsemergedfromovulesafter50daysofculture dAmagnifiedELSincplate e fAplantletregeneratedfromELS gAregeneratedplantofG scabrastrain17 260growninsoil hSomaticchromosomesofthehaploid 2n x 13 regeneratedfromG scabrastrain17 260 Thebarsina d e 500 m b c f 10mm g 50mm h 20 m 未受精子房内的胚珠 43 植物未授粉胚珠或子房离体培养时 由于培养物既包含有孢子体组织 如珠心 珠被 子房壁等 又包含有配子体细胞 如卵细胞 助细胞 反足细胞等 因而在培养过程中 既可以产生单倍体愈伤组织或胚状体 也可能产生二倍体愈伤组织或胚状体 或二者同时产生 2 单倍体植株的起源 对于某些雄核组织培养反应迟钝或雄核败育的物种来说 雌核发育途径是一个重要的创制单倍体的手段 44 克服远缘杂交中杂种早亡用于试管授粉创造雌核发育的单倍体获得大量的体细胞胚 葡萄的末受精胚珠培养中都得到了来源于珠心细胞的体细胞胚状体 柑桔末受精胚珠来源的体细胞胚状体 这种胚状体可用于脱毒苗的快速繁殖 繁育无核植物的珠心苗 通过末受精胚珠的离体培养 是获得无核柑桔珠心苗的有效方法 8 2 5胚珠 子房培养的应用 45 柑橘上珠心苗的作用 与营养系相比 实生群体常具有变异普遍 变异性状多而且变异幅度大的特点 对多胚性的柑橘进行实生选种 有可能获得 利用有性系变异选育出优良的自然杂种 例如温州蜜柑 葡萄柚 日本夏橙等都源出于自然杂种 利用珠心系中发生的变异选育出新的优良品种 品系 例如四川的锦橙 先锋橙 利用珠心胚实生苗的生理复壮作用选育出该品种的新生系 例如美国从华盛顿脐橙 伏令夏橙 柠檬中选育出的新生系均比老系表现树势旺盛 丰产稳产 适应性增强 而又保持原品种的优良品质 46 植物离体授粉 pollinationinvitro 指在离体条件下对雌蕊的柱头 带胎座的胚珠和单个胚珠进行人工授粉和完成受精并形成种子过程 离体受精 fertilizationinvitro 指游离的植物精细胞和卵细胞融合形成合子 进一步培养使其形成完整植株的技术 离体授粉 受精也叫植物试管受精 test tubefertilization 合子培养是指对离体受精合子或分离的自然受精合子的离体培养 并使其进一步发育成植株的过程 8 3离体授粉 受精与合子培养 47 8 3 1植物离体授粉 1 离体授粉类型 离体柱头授粉离体子房授粉离体胚珠授粉 可以克服远缘杂交中的不亲和性 特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉 能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍 48 2 离体授粉的程序 1 确定开花 花药开裂及授粉时间2 去雄后将花蕾套袋隔离3 制备无菌子房或胚珠4 制备无菌花粉5 胚珠或子房的试管内授粉 49 3 离体授粉的方法 花粉的收集 将要开花的幼穗或花蕾 经过常规消毒后在无菌条件下让花药自然开裂 子房或胚珠的剥离 开花前1d将雌穗或花蕾取下 经过表面常规消毒后 剥取完整子房或胚珠 接种 50 授粉 一是先将子房接入培养基 后用毛笔粘取刚撒落的新鲜花粉 涂在雌蕊的柱头上 另一种方法是在子房剥离后 可直接用子房的柱头直接粘取花粉或用毛笔在管外子房柱头上涂上花粉后再接入培养基中培养 培养基多为Nitsch 1951 在进行子房培养时所用的无机盐 此外加上蔗糖和维生素 4 5 培养近乎黑暗中或散光条件下 25 28 51 Fig 1 ReproductivestructuresofA mearnsii a Racemecomprisingmultipleinflorescences b stigmasextendedovernumerousanthers c diploid 2n andtetraploid 4n polyads and d ananthercomprisedoftwolocules eachcontainingfourpolyads 52 Fig 2 Invitro laboratory andinvivo field crosspollinations a Inflorescencesattheyellowbudstageareplacedontoagar b andallowedtoopenovernight c Invitrocrosspollinations d Inflorescencestobeusedaspollendonorsareplacedinadesiccatortohelpreleasethepolyadsfromtheanthers e Baggedinflorescences invivo flowersreadytobecrossed f Fixingofinflorescences48hafterthesecondcrosspollination 53 Fig 3 ReproductiveorgansofA mearnsii a Stigmawithasinglepolyadattached b Stigmawithmultiplepolyadsattached c Pollentubesgerminatingoutofthepolyadanddownthestyle fluorescentmicroscopy d Pollentubesenteringtheovary e Pollentubesenteringindividualovules f Pistil 54 克服远缘杂交不孕克服自交不亲和性在诱导单倍体植株上的应用用于花粉生理和受精生理的研究 4 离体授粉 受精与合子培养的应用 Hess 1974 等试图通过花药培养来得到锦花沟酸浆 MimulusLuteus 的单倍体 结果失败了 但是 当他们将雌蕊除去子房壁 在暴露的胚珠上用远缘物种蓝猪耳 Toreniafournieri 花粉作离体传粉 结果在1 的胚珠中获得了单倍体植株 55 植物胚乳组织培养 endospermculture 是