实验酶切胶回收和连接ppt课件.ppt

限制性内切核酸酶消化DNA 从琼脂糖凝胶中回收DNA及载体与目的基因的连接 1 掌握限制性内切酶特异性切割DNA的原理与方法掌握DNA片段从琼脂糖凝胶中回收的原理与方法掌握如何构建体外重组DNA分子及DNA的连接方法 实验目的 2 限制性内切核酸酶消化DNA 限制性内切核酸酶 restrictionenzyme 是一类识别DNA上特意核苷酸序列并产生切割反应的内切核酸酶 endonuclease 的总称 在基因操作中 这些酶作为 剪刀 对DNA起剪切作用 是分子生物学研究中不可缺少的酶之一 3 限制性内切酶能识别 结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列 并在该序列内部水解核苷酸之间的3 5 磷酸二酯键 切断DNA双链结构 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4 6个核苷酸 具有回文结构 双链DNA中含有的二个结构相同 方向相反的序列称为反向重复序列 特征 限制性内切核酸酶消化产生的DNA末段分为5 粘性末端 平末端 3 粘性末端三大类 末端的5 端为磷酸基团 P 3 端为羟基基团 OH 这些末端结构可能影响其它酶 如连接酶 的反应效率 应特别注意 原理 4 在我们今天的实验中 用到两种限制性酶分别是Hind 和EcoR 这两种酶切割后产生的片段都具有粘性末端 可以保证酶切产物与载体正确的连接 5 酶切体系 10 M 2mlHind 1mlEcoR 1mlddH2O 6ml质粒 10ml总体积 20ml 将酶切体系按顺序加好后放入已预热的37 C的水浴锅中 使反应体系在这个温度下进行酶切 酶切2h后加2ml10 loadingbuffer终止酶切反应 取全部的样品用于胶回收 6 试验中用到的两种酶的缓冲液 Hind EcoR MBufferHBuffer对于Hind 来说 在含有MBuffer时的酶切效率最高 而对于EcoR 来说 在HBuffer里面的酶切效率高 但在两者同时进行酶切时 在MBuffer里时的效率最高 因此本实验中我们用MBuffer来进行Hind 和EcoR 的双酶切 7 从琼脂糖凝胶中回收DNA 在酶切的过程中 除产生我们所需要的目的片段外 还会产生一些小片段 这些小片段可能会与载体连接 从而产生干扰 去除这些小片段的最好的方法就是进行琼脂糖凝胶电泳 8 琼脂糖凝胶回收 原理 不同分子量的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳动速度不一样而分离 通过回收可用于后续实验 NaI存在条件下 加热至55 含有DNA片段的琼脂糖凝胶就会融化 然后可利用硅胶树脂吸附DNA分子 从而得到纯净的DNA片段 硅胶树脂在高盐离子浓度下可以高效专一的吸附DNA 通过离心可将DNA片段沉淀下来 在碱性低盐浓度下其与DNA的结合能力会急剧降低 使用弱碱溶液如TE pH8 0 等可以从硅胶离心柱洗脱得到纯净的DNA片段 9 1 取一干净的1 5ml的离心管 称重 标记 2 紫外下用干净的手术刀切下含有目的片段的DNA凝胶 放入已称重的离心管中 称重 3 按每100mg琼脂糖凝胶加入400mlbindingsolution的量添加solution至装有凝胶的离心管中 50 60 放5 10min融胶 4 将以上溶液转移至Genclean柱中 室温放置2min 6000rpm室温离心1min 将离心下来的液体倒回Genclean柱中再重复离心一次 弃收集管中的废液 操作步骤 10 5 往上述管中加入500mlwashsolution 12000rpm 1min 弃废液 6 重复步骤5一次 7 将Genclean柱放回收集管中 12000rpm 1min 彻底去除washsolution 8 将Genclean柱放到一干净的1 5ml的离心管中 加入30mlElutionbuffer 37 放置2min 12000rpm 1min 所得液体即目的片段 9 取5ml目的片段 加入1ml6 loadingbuffer 电泳鉴定 剩余液体可直接用于后续试验或 20 保存 11 注意事项 电泳所用的胶的浓度为1 胶经冻融后 孔径较大 利于挤压 溴化乙锭染色后的DNA易受紫外光破坏 故尽量放置于暗室 切带时应使用长波长紫外灯 切胶时间尽量短 在切胶时 要注意尽量沿目的片段的边缘切下 使其所带的琼脂糖尽量少 这样琼脂糖不会影响后面的提纯 12 DNA的重组连接 原理 DNA重组连接是通过将已经切开的载体和外源DNA 通过DNA连接酶催化两双链DNA片段组邻的5 端磷酸与3 端羟基之间形成磷酸酯键 从而形成新的DNA 本实验利用T4DNA连接酶 有Mg2 ATP存在的连接体系中 将载体pUC18与目的基因连接起来 13 连接体系 DNA 7ml载体 1mlT4Buffer