(全)微生物综合实验2012.11.doc

微生物学综合实验一、大肠菌群(M.R.N.)的测定1、目的和要求 （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 （2）学习并掌握大肠菌群的检验的原理和方法，以判别食品的卫生质量 2、原理 大肠菌群系指一群能在37经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 三步法：（1）发酵乳糖，产酸产气初发酵实验；（2）初发酵阳性管通过伊红美蓝平板进行分离；（3）复发酵对分离菌作证实实验食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（themostprobablenumber-简称MPN）表示。 最近似数（mostprobablenumber-简称MPN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。3、材料 3.1样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 3.2菌种 大肠埃希氏菌（Escherichiacoli） 产气肠杆菌（Enterobacteriaaerogenes） 3.3培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管（单料或双料）、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、无菌生理盐水（9ML/试管，225ML/250ML三角瓶，内含适量玻璃珠）、75%酒精棉球等3.4其它 恒温箱、恒温水浴、药物天平、无菌培养皿、无菌吸管（1ML、10ML）、无菌不锈钢勺、无菌称量纸、匀质器、载玻片等 4、流程 样品（无菌称量25g）稀释温热的225ml灭菌生理盐水锥形瓶；再作1：10稀释度（即取1ml第一次稀释后的样品，加入到装9ml重量盐水的试管中）；再做1：100稀释度接种 （各取1ml接种）（选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管）培养（242h，361）初发酵结果：若不产气，即为大肠杆菌阴性，报告大肠杆菌阴性。若产气，划线伊红美蓝平板（18-24h，361）培养分离结果：用革兰氏染色：若为G+阳性，报告大肠杆菌阴性；若革兰氏染色G-阴性无芽孢杆菌，接种（复发酵）乳糖发酵管（242h，361）培养结果：产气，报告大肠杆菌阳性；不产气，报告大肠杆菌阴性。5、步骤 取样及稀释，做成1:10、1：100的均匀稀释液为检样。同一稀释度接种3个乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照。 以无菌操作取检样25g（或25ml），放于225ml灭菌生理盐水的灭菌广口瓶（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振荡或研磨制成1：10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以800010000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml,沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内(注意吸管尖端不要触及吸管内液面),振摇试管混合均匀,制成1:100的稀释液。另取1.0ml灭菌吸管,按上操作顺序,制成10倍递增的稀释液,如此每递增稀释一次即换用1支1.0ml吸管。5.1乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。接种量在1ml以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1ml及1ml以下者,用单料乳糖胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐发酵管对照。置361温箱内,培养242小时,如所有发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则与对照的混合菌种一起按下列程序进行。 5.2分离培养 将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养1824小时后取出,观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。 5.3证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌落12个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置361温箱培养242小时,观察产气情况,凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。5.4报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 6、结果 6.1试验结果表 接种量管号发酵反应结果有无典型菌落革兰氏染色结果复发酵反应结果最后结论 +或-1ml1230.1ml1230.01ml123注：填写初发酵与复发酵结果应以下列符号表示。“-”表示不产酸也不产气，培养基为紫色；“+”表示只产酸而不产气，培养基变黄色；“”表示产酸又产气，培养基变黄，并有气泡。6.2结果报告 根据证实大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表(见附录)报告每100ml(克)大肠菌群的最可能数. 7、思考 1大肠菌群检验中为什麽首先要用乳糖胆盐发酵管？胆盐能抑制革兰氏阳性菌等杂菌生长.在初发酵，培养基已经加入胆盐抑制革兰氏阳性菌生长，并在EMB培养基上进行分离培养，因此复发酵培养时无需乳糖发酵管，以免大肠菌肠受到抑制。 2作空白对照实验的目的？ 3为什么大肠菌群的检验要经过复发酵才能证实？ 4复发酵时为什么使用乳糖发酵管但不需加胆盐？1g检样中最近似值(MPN)表(补充件)使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.00lg。大肠菌群MPN检索表阳性管数MPN95%可信限1ml（g）30.1ml（g）30.01ml（g）3100 ml（g）下限上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150510200210111111110123701101501901030230360111122220123110150200240303601111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000 注：本表采用3个稀释度0.1g(mL)、0.0lg(mL)和0.001g(mL)，每个稀释度接种3管。表内所列检样量如改用1g(mL)、0.10(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。查表注意:在MPN检索表第一栏阳性管数下面列出的1ml(g),系指原样品的1ml(g)数,并非样品稀释后的1ml(g)数,对固体样品更应注意.如固体样品1g经10倍稀释后,虽加入1ml量,但实际其中只含有0.1g样品,故应按0.1g计,不应按1ml计.方法举例:若1g检样量的3管中经发酵证实其中有2管产气,而含0.1g检样量的3管中证实其中有1管产气,含0.01g检样量的3管中证实均不产气,则根据”2、1、0”查表，得MPN=150，可报告100ml（g）检样中大肠菌群的MPN值为150。二、酸乳中乳酸菌的分离及酸乳的制作（一）酸乳中乳酸菌的分离测定1、实验目的1）了解酸乳中乳酸菌分离原理2）学习并掌握酸乳中乳酸菌菌数的检测方法。2、原理活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。3、材料31、培养基MRS培养基，改良CHALMERS培养基，M17培养基。32、仪器和器具无菌移液管（25ml,1ml），无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管），无菌培养皿，旋涡均匀器。恒温培养箱。4、流程酸奶稀释制平板培养检查计数5、方法51、样品稀释先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。52、制平板选用23个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至46左右的MRS或改良CHALMERS培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。53、培养和计数将平皿倒置于40恒温箱内培养2448h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30300个菌落平皿进行计算。6、结果61、指示剂显色反应乳酸菌的菌落很小，13mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。62、镜检形态必要时，可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。63、参照比较据介绍，改良CHALMERS培养基的检出率较MRS培养基高，M17培养基较适合于乳球菌的培养，在检测时可同时使用多个培养基作比较。7、思考1、为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培养基？2、培养基中为什么要加CaCO3？取市场销售的新鲜的酸奶，分别用接种针接入BCG牛培养基琼脂平板上，40培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。选取乳酸菌典型菌落转致脱脂乳试管中，40培养824h若牛乳出现凝固，无气泡，显酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色显阳性，则可将其连续传代3次，最终选择出在36h能凝固的牛乳管，作菌种待用。附加：1BCG牛乳培养基配方及灭菌（A）液：脱脂奶粉10克，水50ml，加入1.6%溴甲酚绿乙醇溶液1ml，80灭菌20min。（B）液：酵母膏1克，水50克，琼脂2克，pH6.8，121灭菌2.min。按照配方正确称取所需药品放于烧杯中，在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解，用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照，加琼脂溶化，加热过程要不断搅拌，可适当补水。琼脂完全溶解后倒入250mL的锥形瓶中，用纱布包扎好（注意不要污染纱布）再用牛皮纸包扎，贴上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。在高压锅中，在1kg/cm2压力下维持30min。（二）酸乳的制作酸乳的种类很多，原料配合多种多样，可分为凝固型和搅拌型酸乳两类，目前各地生产的多数属凝固型酸乳。1、原料配合原料配方一配方二脱脂乳10001000脱脂乳粉25-35甜脱脂炼乳100蔗糖80-11040-60发酵剂20-2520-25香料适量适量组织稳定剂适量适量流程：菌种纯培养母发酵剂工作发酵剂原料配合搅拌杀菌均喷冷却 添加发酵剂（1）凝固型、（2）搅拌型（1） 凝固型装瓶保温发酵冷却入库制成（销售）（2） 搅拌型罐发酵冷却加果汁搅拌包装冷却入库制成（销售）2、混合料的加工处理按配方配合混料，进行搅拌均匀，置于消毒锅杀菌待温度达80-85时保温30mi