蛋白质复合体及蛋白质相互作用研究新策略_化学交联结合质谱分析法.doc

蛋白质复合体及蛋白质相互作用研究新策略化学交联结合质谱分析法王晓东 ，李智立(中国医学科学院基础医学研究所 ， 北京协和医学院基础学院 ， 北 京 100005)摘 要 ： 近年来化学交联法结合质谱分 析法被广泛用于蛋白质复合体结构及蛋白质相互作用的研究 。 研 究 表 明这两种方法的有机结合为研究蛋白质复合 体结构及蛋白质相互作用提供了一条新的途径 。 文章对不同类型的化学 交 联 剂 、 质 谱 分 析 中 的 Bottom-up 与 Top-down 两 种 研 究 策 略 ，以及化学交联法结合质谱分析法在蛋白质复合体 结 构 、 蛋白质相互作用研究中的应用进行 综 述 。 这两种方法的不断发展与完善 ， 将会极大促进生物大分子复合体 结构及蛋白质相互作用的研究 。关 键 词 ： 化 学 交 联 ； 质 谱 法 ； 蛋 白 质 复 合 体 ； 蛋白质相互作用 中 图 分 类 号 ： Q51引言定氨基酸侧链或官能团 ， 获得氨基酸或官能团的相0对空间距离 ，构建蛋白质的空间结构及蛋白质复合体亚基的空间排列位置5,6。在生物大分 子 中 能 与 化蛋白质结构与功能分析 、蛋白质复合体及蛋白学交联剂发生作用的 基 团 较 多 ， 如氨基酸中伯胺 、巯 基 、 羧 基 等 。 随 着 新型化学交联剂的不断合成 ，质相互作用的研究 ，一直是蛋白质组学极为重要的研究领域 。 到目前为止 ， 一些高分辨率 、 高灵敏度的研究方法已经被广泛应用于蛋白质结构与功能的 研 究 ， 如 X 射 线 衍 射 法 ( X-ray crystallography) 、交联剂的种类越来越多 。 因此，化学交联剂将成为研究蛋白质结构及其相互作用的重 要 工 具 7。 化 学交 联 法 与 质 谱 法 (mass spectrometry，MS)相 结 合核 磁 共 振 波 谱 法( nuclearmagnetic resonance已经被广泛用于研究蛋白质复合体以及蛋白质相互作用8。化 学 交 联法与质谱法的有机结合有如下优点 ：(1) 被 分 析 蛋 白 质 或 蛋 白 质 复 合 体 的 分 子 量 ( molecular weight， MW) 从理论上说是无限的 ， 如果被分析物 的 分 子 量 过 大 ， 可 以 采 用 Bottom-up 分 析 策 略9； (2)质谱分析速度十 分 迅 速 ， 可 以 极 大spectroscopy，microscopy，NMR)和 低 温 电 镜 法( cryo-electroncryoEM)1,2 等 。蛋 白 质相互作用的研 究 方 法 主 要 有 ：噬菌体展示技术 ( phagedisplay( yeasttechniques，PDT) ，酵 母 双 杂 交 系 统 two-hybrid system，Y2H) ，串 联 亲 和 纯 化 法(tandem affinity purification，TAP)，荧 光 共 振 能 量转 移FRET)( fluorescenceresonance energytransfer，缩 短 分 析 时 间10,11；(3)质谱检测灵敏度极高 ，被 分技 术 ，以及表面等离子共振技术 ( surface析的蛋白质只需飞摩尔 (femtomole)级 的 量 就 可 满plasmon resonance technology，SPR) 等 。这 些 研足 实 验 要 求11,12；(4)易于获得溶液中蛋白 质 三 维 结究手段的应用使得许多蛋白质的三维结构清楚地呈构 信 息 ， 并 可 鉴 定出蛋白质的可变结构域 1315；(5)化学交联法结合质谱 法在膜蛋白研究领域的应 现在人们眼前 ，也直观地把蛋白质复合体中的蛋白质与蛋白质相互作用呈现出来 。 除此之外 ， 近年来出现了一种可以获得蛋白质结构信息以及蛋白质相 互作用信息的新方法化 学 交 联 (cross-linking)收 稿 日 期 ： 2008-11-29基 金 项 目 ： 863 计 划 (2006AA02Z154)， 国 家 自 然 科 学 基 金 (20675088)通 讯 作 者 ： 李 智 立 ， 电 话 ： (010)65296475，E-mail： 法 3,4，即在蛋白质样品中加入适量的化学交联剂 (chemical cross-linker) ，质之间发生交联反应 ，使蛋白质内部或不同蛋白 实现对蛋白质中各个氨基酸侧链或官能团空间位置的定位 ，应用现代质谱法鉴用与其他传统方法相比有其独特的优势16。反 应 原 理 见 图 1A。 早 在 30 多 年 前 ，Bragg 等 17,18研 究 发 现酯 是 一 种 同 基 双 功 能 试 剂 NHS化学交联剂的分类(homobifuctional agent)，具 有 胺类反应活性和强交 1联 能 力 。 NHS 酯 通过与亲核物质相互作用释放 NHS 或者 sulfo-NHS 基团， 进而与伯氨或仲氨反应在过去的二十几年里 ，化学交联剂种类增长十产生稳定的酰胺或亚酰胺键 。如 NHS 与 蛋 白 质 中分迅速 ， 出现了大量具有不同臂长 、 不同反应活性N 末 端 残 基 或 赖 氨 酸 侧 链 的 - 氨基基团的反应 (图 1A)。 Staros19通 过 对 NHS 酯 与 膜 蛋 白 交 联 反 应 的 研 究 表 明 ， 在 生 理 pH 条 件 下 ( pH=7.0 7.5) ， NHS 酯的胺类反应活性随 pH 值的升高而增强 。的化学交联剂 。 大致可分为 ： 胺类交联剂 、联剂和光敏交联剂三种类型 。巯基交胺类交联剂N- 羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 ( N-hydroxysuccinimide，1.1酯是一种目前应用非常 广泛的酰化试剂 ，其NHS)OSO3NaOO Oote(A) NH2NOHNNRRONaO3SHOOOO(B)NN RRSHSoteOO苓N茌NN UV lightN NH2(C)NNRRRRNotnHRHUV lightRNote n NH2(D)R NNHR2 R1HOOOCPrR1 UV lightPr(E)CHR2Fig.1Reaction mechanisms of the most commonly used reagents for cross-linking of proteins.(A) NHS esters (amine-reactive) 24; (B) Maleimides (sulfhydryl-reactive) 24; (C) Aryl azides(photoreative)24,25; (D) Diazirines (photoreactive)26; (E) Benzophenones (photoreactive)27,28Swaim等20通 过 对 另 一种既具有胺类反应活性 又具有交联活性的同基双功能试剂 3,3-dithiobis外， 研究还发现 DTSSP 中的 NHS 基团除了可以与 赖 氨 酸 残 基 、 丝 氨 酸 残 基 及 N 末 端 反 应 外 ，还 可sulfosuccinimidyl propionate( DTSSP)的 研 究 证以与酪氨酸残基以及缓冲液中的铵 离 子 反 应 。Leavell 等 21 的 研 究 表 明 ， 不 同 pH 条 件 下 NHS 基 团可以选择性地与赖氨酸残基的伯氨或酪氨酸残基实 ： 利 用 NHS 酯的交联反应进行结构研究时 ， 丝氨酸残基的羟基也可与 NHS 酯发生交联反应 。此 otein otein Protein Pri Prei ProteinPrin Protein ProteinPrin的 羟 基 反 应 ， 产生稳定的产物 。 在 酸 性 条 件 下(pH= 6.0)， NHS 基 团 优 先 与 N 末端以及酪氨酸羟 为了提高蛋白质交联反应的效率 ， 实验中所用交联剂 浓 度 、 反 应 时 间 以 及 缓 冲 液 pH 都需要进行必要 的优化 。蛋 白 质 化 学 交 联 产 物 的 分 析 策 略 有 ：Bottom-up 策略和 Top-down 策略29。2.1Bottom-up 策略Bottom-up 策略的核心思想是在蛋白质与交联 剂 完 成 交 联 反 应 后 ， 先 利 用 电 泳 (electrophoresis)、基 反 应 ；在 碱 性 条 件 下(pH=8.4) ，NHS 基 团 优 先与 N 末端以及赖氨酸 反 应 。 Kalkhof 等22指 出 NHS基团除了可以和赖氨酸残基 、 丝氨酸残基 、 酪氨酸 残基反应外 ， 还可以与苏氨酸残基发生反应 。巯基交联剂这类交联剂的靶向目标是半胱氨酸的巯基 。1.2为了获得自由的巯基基团可能 需要对二硫键进行还 液 相 色 谱等 分 离 技( liquid chromatography， LC)原，这一过程将会对蛋白质自然状态下的三维结构术对交联混合物进行分离 ，再用水解酶将蛋白质交造成破坏 ， 这是此类交联剂存在的问题 。 顺丁烯二联产物水解成多种肽段 ， 然后利用质谱法对肽段进酸亚胺(maleic acid imides ormaleimides)是 一 种行 鉴 定(图 2)。研究表明这种策略可以用来研究蛋 被广泛应用于异基双官能团巯基反应交联剂 白质复合体内部结构以及蛋白质相互作用 ，但该策( heterobifunctionalsulfhydryl-reactive cross-linking略所提供的结构信息只能构建分辨率相对较低的三维结构30,31。reagents)的 反 应 基 团( 图 1B) 。 研 究 表 明 pH=6.57.5 时 ， 这种交联剂反应 具有巯基特异性 。如具体过程如下 ： 交联反应完成后 ，对蛋白质交Gorin 等23,24研 究 发 现 ， 当 溶 液 的 pH=7 时 ，顺 丁 烯联产物进行一维 凝 胶 电 泳( one-dimensionalgel二酸亚胺基团与巯基反应的速度比与胺类反应的速度快 1000 倍左右 。electrophoresis)分 离 。根据凝胶上各 条 带 着 色 的 深浅可初步测定交联反应产物的产率 ， 然后将含有交光敏交联剂光敏反应交联剂能在紫 外 光联的蛋白质或交联的蛋白质复合体的条带切下 ，用1.3(ultraviolet， UV)蛋白酶进行胶内酶切 (in-gel digestion)，之 后 用 基的诱导作用下与靶向分子发生反应 。 这类交联剂具有 如 下 特 点 ： (1)具 有较高的反应活性 ； (2)能 够 插质辅助激光解吸电离飞行 时 间 质 谱 (matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmass入到多种类型基团之间 ， 无 歧 视 现 象 ；(3) 在 无 光或 电 喷 雾 离 子 化spectrometry，MALDI-TOFMS)条件下比较稳定 ； (4)对 特定波长的光具有高敏感 性 ； (5)与蛋白质相互作 用能够产生稳定 、 特 异 的质 谱( electrosprayionization mass spectrometry，(图 2)。 此外交联反应完 成 后 ，ESI-MS)进 行 鉴 定产物， 并有利于进一步的分离纯化及质谱分析 。到也可利用亲和色谱 法体(affinity chromatography)、目 前 为 止 ，大多数的光敏交联剂主要是氮烯 积 排 阻 色 谱 法( size-exclusion chromatography，(nitrene) 或者碳烯化合物 (earbene compound)，如SEC)及 免 疫 共 沉 淀( co-immunoprecipitation，叠 氮(azides)25、双 吖 丙 啶(diazirine)26、重 氮 化 合co-IP) 等分离技术分离交联产物 。 如 SEC， 此法与电泳主要不同之处是酶解反应可在溶液中 进 行 。 Jonsson 等 32 的 研 究 表 明 ， 在溶液中酶解效率远远 高于胶内酶解效率 。 酶解后的混合物主要包括 ： 未物等苯 甲 酮( benzophenone) 27,28( diazo compound) 、(图 1CE)。蛋白质化学交联产物分析策略被交联剂修饰的肽段 、 交联剂修饰的肽段 、来源于2同一蛋白质的分子内交联肽段 ，以及来源于不同蛋采 用 MALDI-TOF白质的分子间 交 联 肽 段(图 2)。交联反应的成功与否关键在于对蛋白质氨基酸MS 或 ESI-MS 对 水解后的混合肽段进行分析 ， 利序列的了解 ， 一旦知道蛋白质的一级全序列 ，就可用 相 关 软 件( generalprotein/mass analysis for以选择相对合适的化学交联剂来提高反应产率 ， 进而有利于下游的结构分析 。 蛋白质全序列应该尽可windows，GPAMW)33 与对照组质谱数据比较 ，鉴定出交联肽段 ， 获得蛋白质官能团间空间距离的信能包括蛋白质所有特征 ：如 可能的氨基酸变异体 息。 汇总上述信息获得蛋白质结构 、蛋白质复合体( aminoacidvariants) 、翻 译 后 修 饰( post-中蛋白空间排列信息 ，以 及 蛋白质相互作用的信 translational modification，PTM)以 及 剪 接 变 体息 。 除 GPAMW 外 ， 还 有其它的软件可用于化学 交 联 质 谱 数 据 分 析 ： 如 Automated Spectrum(splice variants) 等 。在 进行交联反应时应设置对 照 实 验 ， 以 排 除 蛋 白 质非特异性聚合产生的干扰 。Fig.2General analytical strategies for protein structure characterization by chemical cross-linking and mass spectrometry:Bottom-up approach29可以 对 交 联 肽 段 的进 行 分 析Assignment Program( ASPA) 5,34、 MS2Assign 35、MS/MS；MS2PRO 36、SearchXLinks 37 以 及 VirtualMSLab 38SearchXLinks 可 用 于 蛋 白 质 二 硫 键 质 谱 分 析 ；VirtualMSLab 是近几年出现的一款功能比较完备 的软件 ， 它可以开展伴随有质谱分析相对复杂的蛋等。 这些软件对于各种交联剂 、 蛋白酶 、 质谱仪都具有较好的兼容性 。 其 中 MS2Assign 和 MS2PRO白质组学模拟实验 ， 用以辅助对蛋白质分析 。Bottom-up策 略 的 局 限 性 ： (1)化学交联后的蛋 白质酶解时存在多种漏切现象 ，如当交联剂与蛋白质的赖氨酸残基或者 N 末 端 的 伯 氨 发 生 交 联 时 就会发生漏切现象 ， 胰 酶(trypsin)不 能 对 被 化 学 交联的赖氨酸残基 C 端肽键进行酶切 ；(2)肽 段 中 赖氨酸残基的 氨基发生修饰会导致其电喷雾离子化效率降低 ，致使 m/z 值 增 加 ，由于大部分质谱仪的 质量检测范围有限 ，因此导致大分子量肽段信号丢失 ；(3)酶解后的许多肽 段由于其氨基酸序列不同 或具有不同的氨基酸残基而 具有几乎相同的分子 量。 因此， 高分辨率 、 高精度质谱仪的应用就显得 十分必要 。2.2Top-down 策略Top-down 策略是一种可以直接研 究 交 联 产 物 的 方 法 。 与 Bottom-up 策 略 不 同 ， 利 用 Top-down策略不需要在 MS 分析之前用蛋白酶将蛋白质交联 产物水解成较小的肽段 (图 3)，所以研究对象是相 对完整 的 蛋 白 质 ， 不 是 肽 段39。 因 此 ， 对 于 质 谱 仪的要求较高 ，如电喷雾离子化傅立叶变换离子回旋共 振 质 谱 仪( electrosprayionization fourier-transformion-cyclotronresonancemassspectrometry， ESI-FTICR MS) 。 到 目 前 为 止 ，Top-down 策 略 已 经成功用于许多分子量相对较小 的 蛋 白 质 三 维 结 构 的 研 究 。 Kruppa 等 40 应 用ESI-FTICR MS 和同基双功能交联剂 disuccinimidyl研 究 了 泛 素交 联 反 应suberate( DSS)( ubiquitin)(MW8.5kDa)，鉴 定 了泛素三级结构中的两个交 Fig.3General analytical strategies for protein structurecharacterizationbychemicalcross-linkingand mass spectrometry: Top-down approach29联 位 点 K6-K11 和 K48-K63； Novak 等 用 FTICR41MS 研 究 了 泛 素 的 交 联 反 应 ， 并且考察了一系列具 有相同反应活性基团 、不同臂长的同基双功能交联剂DSS-11.4魡、disuccinimidylglutarate( DSG)-7.5魡、 disuccinimidyl tartrate (DST)-5.8魡 与 泛 素 的交联反应情况 。利 用 FTICR MS 研 究 蛋白交联产物的过程中 可以应用不同的解离技术进行 MS/MS 分 析 ， 如 持技术可以形成较大的肽段碎片 ， 因此可以保存大量完整的翻译后修饰信息 。Top-down 策略的缺点是较难测定 分 子 量 较 大 蛋白复合体的结构及 相 互 作 用 。 Novak 等 42 将 Top-down 策 略 与 Bottom-up 策 略 相 结 合 ， 成 功 研 究了牛视紫红质蛋白 ( rhodopsin， Rho) (MW 续 非 共 振 照 射 碰 撞 诱 导解 离 ( sustainedcollision-induced红外多光子解离 off-resonancedissociation，irradiationSORI-CID) 技 术 、40kDa) 。其 研 究 策 略 是 在 进 行 ESI-FTICR MS 及(infrared multiphoton dissociation，IRMPD)技 术 和MS/MS 分 析 前 ， 用溴化氰特异性切割肽键 C 端 的甲 硫 氨 酸 残 基 ， 将 Rho 切割成许多较大的肽段 ，应用质谱法鉴定这些肽段 。电子捕获解离(electron capture dissociation， ECD)利 用 上 述 解 离 技 术 与 Top-down 策技 术 等(图 3)。略结合可以直接对交联产物进 行 鉴 定 。 其 中 ECD定向诱导突变与定位交 联 法 相 结 合 ， 研 究 了 DNA错 配 修 复 系 统中 的( mismatch repair， MMR)化学交联法结合质谱分析法在蛋白3MutH 和 MutL 的 相 互 作 用 ，揭示了它们的作用位 质结构及相互作用研究中的应用点 及 作 用 机 制 。 Chang 等 54 利用化学交联结合 MALDI-TOF MS， 研 究 了 尿 素 酶( urease)亚 基蛋白质交联产物的高复杂性是质谱分析面临的巨大挑战 。 迄今， 有两种软电离技术被应用于蛋白UreA、 UreB、 UreC 与 辅 助 蛋 白 UreD、UreF 的 相互作用及其位点 。 Toews 等 55 利 用 MALDI-MS 及串联质谱法研究了甲醛在细胞内与蛋白质发生的交质交联混合产物的分析和鉴定 ：一是基质辅助激光解 吸 电 离(matrix-assisted laserdesorption联 反 应 ，优化了甲醛在细胞 内发生交联作用的条 ionization，MALDI)技 术43，另 一是电喷雾离子化 技术44。件Bovet 等 56利用化学交联 剂 及 MALDI-MS、。(electrospary ionization， ESI)nanoESI-MS 成 功监测了药物小分子配体与共活化 肽 (coactivator peptide) 类 固醇受体共活化物 3.1Bottom-up 策略结合 MALDI-MS 的应用MALDI 的 应 用 使 得 被分析化合物的离子化效 率大大提高 ， 但需要有相应的质量分析器与之相整合 ， 如 飞 行 时 间 ( time-of-flight， TOF) 分 析 器 。Schnaible 等 45,46 用 MALDI-TOF MS 获 得 的 研 究 结 果 表 明 ， TOF 和 串 联 TOF 极大推动了蛋 白 质 交 联产 物 的 质 谱 分 析 。 另 外 ， Peterson 等47的 研 究 发 现 基质辅助激光解吸电离四极杆离子阱飞行时间质谱的 相 互-1 ( steroid receptor coactivator-1，SRC-1)作用，证实了药物的药效可以通过调节蛋白质之间的相互作用来实现 。3.2Bottom-up 策略结合 ESI-MS 的应用等 57,58 发 现 纳 喷 雾 离子 化 技 术Wilm(nano-electrospary)可以极大地提高质 谱 检 测 灵 敏度。 为了降低分析的复杂性 ， 肽段混合物往往通过一些分离技术 ， 如高效液相色谱 (high-performance仪matrix-assisted laserdesorption ionization(quadrupole ion trap mass spectrometry，MALDI-QIT MS) 也 为 交 联产物的研究带来极大方便 。Rappsilber 等48利 用 MALDI-MS 结合化学交联法成 liquidchromatography，HPLC) 、毛 细 管 电 泳(capillary electrophoresis， CE) 等 进 行 分 离 ， 之 后被 引 入 到 质 谱 仪 中 进 行 鉴 定 。研 究 表 明功研究了酵母核孔复合体 (nuclearporecomplex)ESI-MS/MS 分析可以获得交 联肽段的氨基酸序列 信息及其交联位点的信息 59,60。 Chen 等 61 利 用 2,4-亚基的作用规律 ， 表明化学交联法结合质谱法可以用 来 研 究 复 合 体 中 临 近 亚 基 间 的 相 互 作 用 。二 硝 基 氟 苯 (2, 4-dinitrofluorobenzene，DNFB)对Petrotchenko 等49通过对胞质磺基 转 移 酶(cytosolic 氨基进行了同位素标记 ， 并 应 用 ESI-MS 研 究 了sulfotransferases)二 聚 化 基 序(motif)的 研 究 发 现 ，交联蛋白质甲基化修饰的情况 。Back 等 62 应 用交 联 肽 段 的 MS/MS 分析不仅可以得到 交 联 位 点 的ESI-QTOF MS 结合化学交联法研究了酵母线粒体 信息而且可以 得到交联肽段的序列信息 。Cai抑 制 复 合 体 (mitochondrial prohibitincomplex)中等 50,51 用MALDI-TOF MS 结 合 光 敏 交 联 剂亚基之间的相互作用获得了该复合体的一些空间，N- (2-pyridyldithio)-ethyl-4-azido salicylamide (PEAS)构 象 信 息 ， 发 现 了 PHB1(MW32KDa)和 PHB2成 功 鉴 定 了 Rho 与 转 导 蛋 白(transducin， T)相 互( MW34KDa) 亚基之间的相互作用位点 。 Silva等 15 应用交联反应和高分辨率质 谱仪对载脂蛋白 作 用 的 位 点 ，并 证 明 了 T蛋白内部的交联 (alpha)反应主要发生在 C 末 端 两 个 肽 段 区 域 310-313(RDVK) 和 342-345 (ENLK) 及 N 末 端 一 个 肽 段 区 域 L19-R28， 这 对 于 T (alpha) 的 C、 N 末 端 都 非A-I) 进 行 了 研 究 ，A-I( Apolipoprotein A-I，apo发 现 交 联 的 apo A-I 二 聚 体 C 末 端 和 N 末 端 氨 基酸 残 基 通 过 6 个交联反应而发生自联作用 。 Akashi常靠近 Rho 胞质环(loop) 的现象有着特殊的意义 。等 63 整合了化学交联法 、 SEC 及 ESI-MS，成 功 测Trester-Zedlitz 等 52 将 交 联 剂 的 固 相 合 成 技 术 定 了 溶液中人源转录因子 IIFtranscription factor(solid-phase synthetic strategy)、交联蛋白质酶解技 IIF， TFIIF) 的 结 构 ， 发 现 TFIIF 是 一 种 由 、 亚基构成的异源二聚体 ， 并结合电镜分析结果推测 ，在转录起始复合体 ( pre-initiation complex， PIC) 中 TFIIF 也是以异源二聚体形式存在 ， 此 外 还 发 现 在 溶 液 中 人 源 TFIIF 与 TFIIE 之间没有相互作用 。术 、微 型 浓 缩 器( microconcentrators) 富 集 技 术 、MALDI-MS 分 析 技 术以及计算机处理技术相结合 ，成 功 研 究 了 负 辅 因 子 2 (negative cofactor 2， NC2)异 源 蛋 白质二聚体的结构 。 Giron-Monzon 等 53 将Bai 等 64 采 用 了 时 间 控 制 心 脏 灌 注 交 联 法(time-controlled transcardiac perfusion crosslinking，CaM/M13 复 合 体 中 CaM 与 由 26 个氨基酸组成的 M13 之间有几个距离限制位点 ，这与已经发表的 tcTPC)， 结 合 IP 法 、同位素标记相对和绝对定量 CaM/M13 复 合 体 NMR 结 构 一 致( 如 图 4)74，法isobarictagforrelative andabsoluteESI-FTICR MS 分 析 表 明 M13 的 K18 和 K19 位 点与 CaM 螺旋中心的赖 氨酸残基有交联形成 (如(quantitation，iTRAQ) 以 及 ESI-QTOF MS，对 脑内 的 淀粉体前体蛋白 ( amyloid图 5) ，从 图 5 中 可 以 发 现 有 4 种 交 联 产 物 的 质 谱precursorprotein，APP)进行了研究 ， 发 现 了 许 多 与 APP 相 互 作 用 的峰 ：m/z2040.032、m/z2380.193、m/z2396.185、蛋 白 质 ， 确 认 了 8 种 已 被 证 明 的 、 可 与 APP 发 生相互作用的蛋白质 ， 并 鉴 定 出 30 种 新 的 与 APP 有m/z 2699.360。 以 m/z 2380.193 质 谱 峰 为 例 ， 此 峰与 CaM 螺 旋 中 心 肽 段 ( 75 86) 和 M13 肽 段潜 在相互作用的蛋白质 ，以及另外两种与 APP 相(1926) 形成的单电荷交联产 物 m/z 是 一 致 的 。另关并会引起这种疾病的蛋白质 。 Grela 等 65 采 用 化学 交 联 法 ， 结 合 ESI-QTOF MS、 圆 二 色 谱 法外 ， 质 谱 峰m/z2396.185 被 证 明 是 由 于 CaM肽 段( 75 86) M76 发 生 了 氧 化 ， 引 起 的中荧 光 光 谱m/z 2380.193 峰 迁 移 ， 这 也 进 一 步 证 明 了 m/z2380.193 与 m/z 2396.185 是 交 联 产 物 的 质 谱 峰 。此外通过同样的方法 证实了三种分子内交联产物 ：( circular dichroism spectroscopy，CD) 、法法 ，(Fluorescence Spectroscopy)以 及 体 积 排 阻 色 谱研 究 了核糖体蛋白质 (ribosomal proteins)，发现人类核糖体蛋白质 P1 和 P2 可 以 形 成 稳 定 的 异其中一种产物的交联 位 点 为 M13 中 K18-K19，另源二聚体 ， 这 与 酵 母 中 的 P1/P2 二 聚 体 一 致 ，所 不外两种产物的交联 位 点 都 为 CaM 中 K57-K77。同的是 ， 人类 P1-P2 二聚体可以表现出三态转化机 Sinz 等 还 利 用 disulfosuccinimidyl tartrate( Sulfo制( three-state transition mechanism) ，暗 示 人 类EGS) 及 disuccinimidyl adipate (DSA)交 联 剂 结 合P1-P2 二聚体在溶液中可能存在中间体 。ESI-FTICR MS 对 CaM/M13 复合体进行研究 ，综与策 略 结 合合 BS3 的 研 究 结 果 发 现 ，CaM 螺 旋 中 心 序 列3.3Top-downBottom-upFTICRMS 的应用Comisarow 等 66,67 曾 指 出 ， 为 了获得交联蛋白 7590 与 M13 中 的 K18、 K19 之 间 一 共 有 7 种 交联 产 物 形 成 ， 所 有 这 些 产 物 与 NMR 对 于 CaM/M13 复合体结构研究数据是一致的 。 此 外 ， 尽 管 CaM 中 K13、 K21、 K94 或 K148 与 M13 的质相互作用以及交联剂作用类型的可靠信息 ，应用高 分 辨 、 高质量精度的方法十分必要 。 Schulz 等68正 是 凭 借 FTICR MS 具有的超高分辨率和高质量 距 离 在 NMR 结 构 中 都 小 于 20魡 ( 如 图 4) ，但 是准确度的特点 ， 结合化学交联法 ，成功鉴定了钙调Sinz 等 并 没 有 证 明 CaM 中的这些位点的赖氨酸与 蛋 白 - 蜂 毒 肽(calmodulin-melittin)复 合 体 中 的 相互作用结构域 ， 并构建出了该复合体中各亚基间相互作用的三维结构模型 。 Ihling 等69将 纳 升 级 液 相色 谱与 ESI-FTICR( nano-liquid chromatography)MS 联用， 实现了 利 用 FTICR MS 对蛋白质交联产 物检测的高灵敏性和高通量性 。 Dihazi等 70 应 用nano-HPLC/nano-ESI-FTICR MS 联 用 技 术 ， 快 速 、高效地分析了细胞色素 C 和鸡卵溶菌酶蛋白质分 子间的相互作用 ， 证实了多个相互作用位点 。Sinz 等 71 73 在 ESI-FTICRMS 上 应 用 Top-和策 略利 用downBottom-up，bis-(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3)交 联 剂 成 功 地 分析了分子量较大的蛋白质复合体中分子间的交联反应 。通过对钙调蛋白 ( calmodulin， CaM)和 骨 骼kinase，Fig.4NMR structure of the calmodulin-M13 complex肌 肌 球 蛋 白 轻 链 激 酶( myosinlight-chainaccording to pdb entry 2BBM. The side chains of lysinesand acidic amino acids that are potentially involved in cross-linking are indicated. CaM: calmodulin74MLCK)M13 组 成 的钙依赖复合体 ( calmodulin-M13 complex， CaM/M13 complex) 的 研 究 发 现 ，点， 并成功构建了异源二聚体起始复合体的结构 。总结与展望4将化学交联法结合质谱分析法用于蛋白质复合体结构及蛋白质相互作用的研究是一种崭新的技术方法。现代质谱法的发展极大地加快了对化学交联产物的分析 。高分辨率及高准确度质谱分析法的应用， 保证了实验数据的高可靠性 。 新型交联剂的出现和现代质谱仪的快速发展将使这两种技术不断发展与完善 。化学交联法与质谱法的有机结合将会极大推动生物大分子复合体结构及蛋白质相互作用的研究。Fig.5Deconvoluted ESI-FTICR mass spectrum of the参考文献 ：tryptic peptide mixture from the CaM/M13 (11) complexcross-linkedwithBS3 (100-foldmolar excessover protein/peptide concentration)at an incubation time of60 min.The inset shows the magnified signal of a1Taylor KA, Glaeser RM.Retrospective on the earlydevelopment of cryoelectron microscopy of macromoleculesand a prospective on opportunities for the future.Biol, 2008,163(3):214223Hirokawa N, Noda Y. Intracellular transport and kinesin superfamily proteins, KIFs: structure, function, and dynamics. 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