结构生物学(生物大分子解析方法).ppt

结构生物学的研究方法和技术 生物大分子要发挥功能 必须满足两个条件 第一 凡要发挥功能和活性的生物大分子必须具有特定的 自身特有 相对稳定的三级结构 第二 结构运动 任何的破坏促使没有稳定的三级结构和结构运动 生物大分子是很难发挥生物功能或活性的 结构生物学概念及主要研究方法 结构生物学是通过确定生物大分子三级结构 来研究生物大分子的结构功能关系 从而探讨生物大分子的作用机制和原理作为研究目的 主要研究方法 X 射线晶体衍射方法 X 射线蛋白质晶体学 多维核磁共振 NMR 电镜晶体学和电镜三维重组方法 结构生物学的发展 60年代当时的开文迪许实验室的M PerutzJ Kendrew用X 射线晶体衍射技术获得了球蛋白的结构 由于X射线晶体衍射技术的应用 使我们可以在晶体水平研究大分子的结构 在分子原子基础上解释了大分子 由于他们开创性的工作 Waston Crick获得了1962年的诺贝尔生理学与医学奖 M Perutz和J Kendrew获得了同年的化学奖 从那时起 技术的发展就成为结构生物学发展最重要的决定因素 起源 1950s Waston Crick发现了DNA双螺旋结构 建立DNA的双螺旋模型 60 70年代 在同一实验室的他们又发展了电子晶体学技术 当时的研究对象主要是有序的 对称性高的生物体系 如二维的晶体和对称性很高的三维晶体 70 80年代 多维核磁共振波谱学的发明使得在水溶液中研究生物大分子成为可能 水溶液中的生物大分子更接近于生理状态 80年代到本世纪初 冷冻电子显微镜的发明 这种技术的发明使我们不仅能够研究生物大分子在晶体状态和溶液状态的结构 而且能够研究研究复杂的大分子体系超分子体系 这就是细胞器和细胞 可见结构生物学的发展过程经历了从结晶到溶液再到大分子体系 超分子体系 如核糖体 ribosome 病毒 溶酶体 lysosome 线粒体等 X 射线晶体衍射方法 X射线单晶衍射技术是由H W 布拉格和W L 布拉格父子于1912年提出和发展起来的 此技术最先用于无机晶体分析 后来到1953年 沃森和克里克用于DNA晶体分析 至60年代 肯德鲁和佩鲁兹用于研究血红蛋白和肌红蛋白 逐渐成为生物大分子晶体结构研究的重要手段 直至今天仍占据统治地位 优点是分辨率高 达到原子分辨率 既可研究水溶性蛋白 也可研究膜蛋白和大分子组装体与复合体 它能给出生物大分子的分子结构和构型 确定活性中心的位置和结构 从分子水平理解蛋白质如何识别和结合客体分子 如何催化 如何折叠和进化等生命的基本过程 进而阐明生命现象 如1997年底 应用X射线单晶衍射方法完成了有关核小体 nucleosome 的核心颗粒分辨率为0128nm的精细空间结构的测定 每个核小体的盘状核心含有8个组蛋白形成的八面体 外绕146个碱基对组成的DNA 这一杰出的成就对了解基因转录 DNA复制与修复的动态过程都很重要 此外 应用X射线单晶衍射技术测定蛋白质和核酸的晶体结构并结合分子模拟技术 已经为新药物的设计提供了一个全新的方向 大大缩短了新药的研制过程 新药的设计和开发 要求对这些药物靶标 drugtarget 的结构 性能有精确的了解 由于迄今对其了解甚少 现有临床药物绝大多数是通过尝试筛选获得的 导致研制一个新药常常需十多年 甚至几十年的时间 通过对爱滋病病毒 HIV 蛋白酶的精细结构测定 并以此为靶标设计酶的抑制剂作为治疗爱滋病的有效药物获得巨大成功 已显著减少爱滋病死亡数量 X ray测定生物大分子结构的原理 为什么要用X 射线 只有光源波长与障碍物尺度相当 或者光源波长小于障碍物尺度的时候才能探测到障碍物的信息 X 射线的波长与原子以及化学键的尺度相当 都在 的数量级 因此可以被用来探测蛋白质分子内部的结构 为什么要用衍射 把光源换成X射线 把透镜换成X射线透镜 到目前为止人类还没有发现什么方法能够让X 射线发生折射 所以当前只能通过衍射这种不那么直观的方法来研究蛋白质分子内部构造 什么是晶体 晶体在宏观上呈现出规则的几何形状 二维排列 三维堆积 晶体是一种具有长程 三维分子有序的固体 小孔光栅 衍射图样 如何根据衍射结果解析蛋白质结构 上式也可表示为 r为电子密度 xyz为实空间坐标V为晶胞体积 F hkl 2 I hkl I代表衍射点的强度 hkl为衍射点坐标a代表初始相角 f x Acos 2px a 对于一束X 射线f x Acos 2px a 来说 无论它的初始相角是多少 它在接收屏上所形成的曝光点都是相同的 反之 我们只根据接收屏上的曝光点也是无法得知造成该曝光点的X 射线的初始相角信息的 初始相角无法直接测量得到 但它又是求解电子密度时所必需的信息 这就是X 射线晶体衍射法解析物质结构时所需要解决的核心问题 相位 相角 问题 解决相位问题的方法 同晶置换法最原始的方法 包括多对同晶置换法和单对同晶置换法 需要在蛋白质晶体中引入重原子 并且要求引入了重原子的晶体与未引入重原子的晶体的晶型基本相同 解析过程需要未引入重原子 引入了重原子 甚至引入了不同重原子的多颗晶体的多套衍射数据 反常散射法包括多波长反常散射法和单波长反常散射法 通常需要引入具有较强反常散射能力的原子 如硒原子 不需要多颗晶体但往往需要同一颗晶体在不同波长X 射线照射下的多套衍射数据 随着技术的进步 目前蛋白质自身的硫原子也开始被用来作为反常散射源 分子置换法需要同源性较高的蛋白质分子结构模型 不需要多颗晶体 不需要多套衍射数据 方便快捷 但不能用来解析全新的结构 主要技术流程图 蛋白质结晶的必要条件 蛋白质分子必须均一 纯化 均一的蛋白质分子 不均一 不纯 的蛋白质分子 沉淀剂的作用 获得蛋白质晶体的方法 由于蛋白质分子体积大 分子表面情况复杂 极性不明显 分子间作用力弱等原因 蛋白质分子在达到过饱和的时候不容易有序排列形成晶体 而是容易随机聚合形成沉淀 因此需要针对不同蛋白质筛选各自的结晶条件 蛋白质结晶技术 整批结晶法 液液扩散法 透析法 气相扩散法a 悬滴法b 座滴法 悬滴法 座滴法 无论是悬滴法还是座滴法 当达到蒸汽平衡的时候 蛋白质所在液滴里的结晶溶液组分的浓度将会接近于池液的浓度 结晶溶液 结晶溶液成分 沉淀剂通常为不同分子量的聚乙二醇或者高浓度的硫酸铵 氯化钠等 辅助分子通常为低浓度的盐pH缓冲剂例如 HamptonResearchCrystalScreenKit 140 2MCaCl20 1MHEPESpH7 528 v v PEG400Detergentsandadditives 结晶条件的优化 最初筛选得到的结晶条件往往不是该蛋白的最佳结晶条件 此时的蛋白质晶体往往衍射能力很差 甚至没有衍射 因此一般来说还需要对该蛋白质的结晶条件进行优化 优化的方法就是把结晶溶液中的沉淀剂 辅助分子 结晶时的蛋白质浓度在原浓度附近做一个梯度 相应地 结晶溶液中的pH值也要在原值附近做一个梯度 在把这些梯度排列组合起来 从而找出一个最佳的结晶条件 优化前 优化后 衍射实例 缺点 样品必须为晶体 单晶 但生物大分子结晶困难 特别是膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更是困难 其次对于像病毒那样大的分子组装体 测量其精细结构十分复杂 原因有二 一是大晶胞含有的原子极多 X射线衍射点极多 常常无法区分 辨认和探测 其二是大晶胞所产生的衍射点强度过弱 特别在高分辨时 无法与背景区分 NMR也是测定生物大分子结构重要手段 基本原理 核磁共振现象 nuclearmagneticresonancespectroscopy NMR 1946年由哈佛大学的伯塞 E M Purcell 和斯坦福大学的布洛赫 F Bloch 所领导的2个小组 用不同的方法在各自的实验室里观察到的 伯塞尔使用的实验方法是吸收法 而布洛赫使用的是感应法 利用物理原理 通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质 NMR不破坏被测样品的内部结构 是一种无损检测方法 由于不同的原子核吸收不同的电磁波 因而通过测定和分析受测物质对电磁波的吸收情况就可以判定它含有哪种原子 原子之间的距离有多大 并据此分析出它的三维结构 以蛋白质为例 它的二级结构如 螺旋 折叠 转角 环形和卷曲等 体现了蛋白质分子主链原子在三维空间各种不同的排列规律性 位于不同二级结构域的原子核间距 原子核间的相互作用以及多肽段的动态特性 都直接反映蛋白质三维结构的特征 这些具有不同结构特征的原子核间距 肽键二面角 肽键的动态特性等都具有特征的核磁共振谱线 因此 我们分析核磁共振谱就可以获得蛋白质的三维结构 1H 13C 15N是核磁共振检测的主要对象 各有不同的共振频率 从而形成核磁共振氢谱 碳谱和氮谱三部分 核磁共振 NuclearMagneticResonance NMR 在水溶液中 大约有一半的蛋白质链呈现出规则 紧密的三维结构 而另一半则非常松 目前 科学家已经利用这一方法绘制出15 20 的已知蛋白质的结构 最初 核磁共振技术主要用于核物理研究方面 用它测量各种原子核的磁矩 误差仅是0 003 0 005 迄今 它已广泛应用于化学 食品 医学 生物学 遗传学等学科领域 已成为在这些领域开展研究工作的有力工具 甚至是某些领域 如 化学 医学诊断 药物学等 常规分析中不可缺少的手段 1985年 维特里希 KurtW thrich 等人公布了第一次利用NMR法测定的溶液中蛋白质 蛋白酶抑制剂IIA proteinaseinhibitorIIA 的结构 如图4所示 1990年用NMR测定的蛋白质结构有23个 而到1994年一年测定的蛋白质结构数上升到100个 1997年 维特里希应用NMR方法测定的一种蛋白质 蛋白感染素 prionprotein 的结构 核磁共振方法的最大特点是可以直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间结构 其分辨率已接近012nm 但因为大分子量的生物分子的核磁共振图谱非常复杂 难以解释 因此它只能测量分子量较小 15 25kDa 的生物分子 至今最大可测定35kDa的生物分子 其次在测定中要求样品是高纯度且数量相对较多 使样品制备亦有困难 此外 核磁共振只能用于水溶液性的生物样品 对膜蛋白或病毒等的组装体 复合体就无法测定 另一种方法称为冷冻电镜计算机三维重构方法或单颗粒技术 Cryo EM 特点 急速冷冻 103 104 Ps 样品悬液 样品被包埋在无定形的非晶态冰薄膜中 这样既不损伤样品 又可使样品保持着自然状态 因而样品制备简单 缺点 分辨率稍低 研究的病毒样品 目前分辨率接近0 17nm 预计这几年内可达0 14nm 核糖体可达1 10nm 而离子通道可达2 10nm 由于应用冷冻电镜与计算机重构技术研究病毒三维结构所需样品制备简单 对病毒的大小没有限制 使其发展很快 至今已有100多个病毒的三维结构被冷冻电镜计算机重构方法所阐明 远远超过X射线晶体学的30 40种病毒的数量 虽然其分辨率还有待提高 但所提供的资料和数据对于生命科学的许多研究来说 已经是十分宝贵和重要的依据 甚至已经满足了某些研究的要求 如果把这种研究方法与用X射线单晶衍射所获得的病毒衣壳高分辨三维结构结合起来那就更有意义了 冷冻电镜计算机重构方法虽然其发展历史较晚 但特别有利于病毒 核糖体 离子通道等大的复合体 组装体等的结构与功能的研究 是结构生物学的新发展方向 这些研究既是结构生物学的重要内容 又是正在走向综合的重要一步 Cryo EMstructureofprokaryotic30STranslationInitiationComplex 3 6 AngstromcryoEMstructureofhumanadenovirustype5 TAJBTARGETS 人类十类重大疾病 病毒性感染性疾病 SARS HIV H5N1 手足口病 肝炎细菌真菌类感染性疾病 链球菌感染性肺炎 幽门螺杆菌感染性胃炎 足癣糖尿病 I型糖尿病 II型糖尿病等癌症 肺癌 肝癌 胃癌 白血病 淋巴瘤等心血管类疾病 包含高血压 高血脂 冠心病等 抑郁症 针对以遗传 体质 中枢神经介质的功能及代谢异常等因素引发的抑郁症 神经退行性疾病 由神经元或其髓鞘的丧失所致 随着时间的推移而恶化 以导致的功能障碍 关节炎 包含由炎症 感染 创伤或其他因素引起的关节炎 肥胖性疾病 其中包含单纯性肥胖 内分泌 代谢病引发的肥胖 自身免疫性疾病 机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的