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实验二：柠檬酸发酵一、实验目的1、了解柠檬酸发酵的基本原理2、掌握柠檬酸发酵的基本过程和操作方法二、实验原理柠檬酸是微生物好气代谢途径的中间产物，一般并不积累。为了积累柠檬酸，柠檬酸合成酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶及丙酮酸羧化酶要强大，乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、异柠檬酸裂解酶应很弱。这样，糖质原料由葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，后者在强大CO2固定反应酶系的催化下，大量生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA在高活性的柠檬酸合成酶的作用下，大量生成柠檬酸。由于乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶和异柠檬酸裂解酶微弱，生成的柠檬酸很少被进一步降解，导致目的产物柠檬酸的积累。2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O三、实验材料、仪器黑曲霉(诱变后)、斜面培养基、摇瓶培养基、旋转式摇床、水浴锅四、实验步骤1、斜面培养基配制：20%马铃薯煮汁，2%蔗糖、2%琼脂、12130分钟灭菌。2、摇瓶培养基配制：30%玉米粉加-淀粉酶液化滤液，补适量全玉米粉氮源。3、玉米粉的液化：30%玉米粉调浆后水浴保温至50左右，加入高温-淀粉酶和CaCl2，升温至90，液化60分钟。4、接种培养：斜面34培养5-7天，旋转式摇床240r/min，35培养72-96h。五、注意事项 在整个操作过程中注意无菌操作。六、思考题 在摇床培养中，总糖同产酸量呈现出什么关系？实验三：柠檬酸含量的测定一、实验目的1、了解柠檬酸测定的原理2、掌握柠檬酸测定的操作和方法二、实验原理柠檬酸在碱金属高锰酸钾作用下可转化为丙酮二羧。此酸在紫外光谱区有255nm特征性吸收峰。可借以进行定量测定。三、实验仪器、设备 紫外分光光度计四、实验步骤1、标准曲线：取0.001M的柠檬酸溶液于50毫升容量瓶中，从滴定管中加0.001M高锰酸钾溶液至反应达终点，稀释至刻度，使浓度分别成为：0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.010-4M。分别用紫外分光光度计进行测定，在255nm吸收峰处测定其吸收强度值，用蒸馏水作参比，曲线在3.010-4M浓度范围内成一直线。2、滴定：取柠檬酸发酵液于50毫升容量瓶中，进行适当的稀释，使最终浓度在上述标准曲线的范围内。加入0.001M高锰酸钾溶液，温度控制在60约10分钟左右，溶液颜色由黄色变成深黄色即达到终点。反应完结定容，用紫外分光光度计测定。3、测定：把电源、氢灯接通后，选择狭缝宽度为0.25毫米，扫描速度4毫米/厘米，纸速10秒/厘米。用10毫米石英吸收池。选好条件，把参比溶液(没有加入高锰酸钾反应的发酵液)和样品溶液(加入高锰酸钾反应的发酵液)放于光路上，固定波长在295nm处把透光率调至100%，然后测定吸收值，根据朗伯-比耳定律，由K值计算或从标准曲线
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