果蝇总蛋白提取和SDS-PAGE.docx

果蝇总蛋白提取和SDS-PAGE检测摘要：本次实验主要分为两大部分。第一部分是分别以果蝇成虫和幼虫为材料，通过TBS试剂提取果蝇总蛋白，第二部分是通过SDS-PAGE检测果蝇总蛋白表达，对果蝇的蛋白表达进行了分析。关键字：果蝇；总蛋白；1 材料及仪器1.1实验材料果蝇成虫还有幼虫各6-10只，雌雄均等。果蝇是一种非常重要的模式生物，通常所指的是黑腹果蝇，学名： Drosophilamelanogaster，在分类学上所属动物界，节肢动物门，昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇以其繁殖迅速、生长周期短、易于养殖、相对性状丰富、基因组较为简单等显著特点成为了遗传学、分子生物学、发育生物学等重要学科的主要实验动物之一，对果蝇基因组的测序分析也较为透彻，因此，本实验选用果蝇为实验材料，可以使数据更加具有代表性和说服力。1.2试剂及仪器1.2.1试剂TBS缓冲液（20mMTris-HCl，150mMNaCl,pH7.9），蛋白上样缓冲液，染色液，脱色液1.2.2器材1.5ml离心管，匀浆棒，高速台式离心机，10l、200l及1ml微量移液器及吸头，微波炉，电泳仪，电泳槽，扫描成像仪，水平摇床等2实验方法及步骤2.1总蛋白提取分别取果蝇成虫、幼虫各约5只，加入200lTBS缓冲液在匀浆器中匀浆，将匀浆液于4摄氏度条件下1000rpm离心十分钟，取出离心管，吸取上清液4l，加入16l蛋白上样缓冲液，沸水浴5分钟。2.1凝胶制备安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。贮存液分离液 ml浓缩胶5%6.5%7.5%10%12.5%15%20%A344.565680.9B4.54.54.54.5333C1.5H2O10.59.597.5430.53.6微波加热10SD0.070.070.070.070.070.070.070.040.0060.010.010.010.010.010.010.010.006A液：丙烯酰胺29.2g Bis0.8g 加水至100ml完全溶解 （配完过滤）B液：1.5M Tris-HCl buffer PH=8.8先将Tris溶于水（18.16）至完全溶解，加水至100ml，在酸度计和磁力加热搅拌器联合作用下，用浓盐酸和稀盐酸调PH=8.8C液：0.5M Tris-HCl buffer PH=6.8 1M HCl 48ml，加Tris5.98g，加水至100mlD液：10%过硫酸铵，4可贮存2-3星期电泳缓冲液：10X电极缓冲液，使用时稀释10倍 甘氨酸144g Tris35.3g 加水至一升染色液：考马斯亮蓝1.92g 甲醇227ml 冰醋酸46ml 水227ml脱色液：10%冰醋酸25% 工业酒精制备凝胶板：（已经由老师准备完毕）（1）分离胶制备：按表配制20ml10%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约34mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2）浓缩胶的制备：按表配制10ml3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约30min后凝胶聚合，再放置2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。2.2加样加样前沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。加样体积为20L。用微量注射器贴在长玻璃板小心将样品还有Marker通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，可开始电泳。2.3电泳将直流稳压电泳仪开关打开，电压调节至120V左右。当蓝色染料迁移至底部时，电泳完成，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，将胶板移至大培养皿中染色。2.4染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。2.5扫描条带用蛋白胶扫描仪扫描条带，得到样张。3实验结果 1 2 3 4 5 6 7第7条泳道是marker，第5泳道是成虫总蛋白电泳条带，第6泳道是幼虫总蛋白电泳条带。从条带中可以明显的看出果蝇果蝇成虫和幼虫的蛋白质存在这明显的差别：蛋白质表达量不一样。4实验结果分析与讨论对果蝇总蛋白SDS-PAGE检测从蛋白质的SDS-PAGE图谱可以看出，果蝇蛋白都有表达。但是条带的深浅不同，是因为不同蛋白质在果蝇体内的表达导致的。我们应该着重分析果蝇的成体和幼体蛋白质的差异。从图谱中可以明显看出来，第5条和第6条的条带不一样，第5条表达的蛋白质，第6条没有表达，而第6条表达的蛋白质，第5条没有表达，所