大肠菌群检测方法(中文翻译).doc

3 定义和简介3.1 定义所有的大肠菌群均是发酵乳糖，革兰氏阴性，无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度（30、32、35、37）不同作评价；或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其他官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。鉴于这些定义的不同，建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。l 国际标准：样品分析是否符合国际交易规范l 官方主市场调整定义：样品分析是否符合地方标准l 一般定义：样品分析是否符合一般规范。任何必要方法的调改必须通过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。以下为一些官方定义例子：*ISO 4831大肠菌群是通过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义*AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气（T=32或35度）革兰氏阴性杆菌*ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37)311 液体培养基中ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37)AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。（T=32或35） 由LI第一章概述，大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。312 固体培养基中IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小（最小5mm直径）和产酸情况。(T=30或35或37)AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气由LI第二章概述，大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。32 简注BGLB：亮绿乳糖胆盐培养基肉汤LST：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤MPN：最可能数VRBL：紫红胆汁琼脂4 安全防范 大肠菌群不表现为无害，注意实验室的良好操作。5 参考资料51 LIs中提到的及其它心要文件LI-00700LI-00702LI-00743-252 参考书目*美国公共健康协会(1985).日用品检验标准，华盛顿。DC*Bruchez N (1996).Research Note QS-TN960017: Detection of coliforms-lnprovement of LST*Colwell N.D.and M.D. Microbiological techniques-Some statistical aspects.J.Sci.Fd.Agric_20(1969)573-579*ISO 4831:1991:Microbiology-General guidance for the enumeration of coliforms-Most probable number technique.* ISO 4831:1991:Microbiology-General guidance for the enumeration of coliforms -Colony count technique.*Merck Microbiology Manual 2002 http:/chemdat.merck.de/mda/ch/de/index.html*U.S.FDA(1995).Bacteriological Analytical Manual,8th Ed AOAC international, Gaitheresburg,MD,pp 4.01-4.296 前面说法之修正完整修订本额外细节在大肠菌群计数、定义和分离改编中提供。7方法认可审批人签名日期编写者组领导部门领导CT-QM8 附1安全说明2概述大肠菌群的研究与举例第一章液体培养基中的生长研究1方法原理接种至原倍或稀释后的选择性培养基中，30培养24-48小时，再通过转接阳性管进确认。摘要根据大肠菌群相应用的不同定义选用不同的培养温度（30/32/35/37）(查阅定义)2 培养基的准备在使用化学药品前查阅Sigma/Aldrich化学药品安全指南或其它相应手册或地方权威提供的安全数据表。认真阅读附1中的安全说明。更多的安全信息可从NEC/QS中获得。2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）根据制造商说明配制培养基，如是非成品干粉则可按以下方法配备（g/L）单倍料 （g） 双倍料(g)胰蛋白胨 20.0 40.0乳糖 5.0 10.0 磷酸二氢钾 2.75 5.5磷酸氢二钾 2.75 5.5氯化钠 5.0 10.0 月桂硫酸钠 0.1 0,2 蒸馏水 1000ml 1000ml PH6.6-7.0(25)将以上化合物水中溶解，必要时可以加热，调整PH单倍料分装到16*160mm的试管中每管10ml双倍料分装到18*180mm的试管每管10ml121,15分钟灭菌为了避免月桂硫酸钠沉淀，LST室温贮藏不应超过4星期。注意由于样品引起高百分比的假阳性，也就说气体的产生是由于其它微生物而非大肠菌群。在LST肉汤灭菌后加入无菌梭链孢酸或万古霉素，最终浓度为10毫克每毫升。2.2 亮绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）蛋白胨 10.0乳糖 10.0 脱水牛胆苯 20.0煌绿 0.0133 蒸馏水 1000mlPH7.0-7.4(25)将以上化合物水中溶解，必要时可以加热，调整PH, 分装到带有小试管的16*160mm的试管中每管10ml，灭菌后小试管中不应含有气泡。3 化学药品与材料商业参考仅供指导，列在页边提到的或是莫克化学药物和试剂目录或是2002莫克微生物手册或是雀巢实验室材料。31化学药品101310 微生物煌绿104873 KH2PO4 p.a.K2HPO4 anhydrous GR梭链孢酸钠盐 Sigma F 0881Mannanase solution, Novo Nordisk KHNO1051a-淀粉酶，Termamyl 1201 Novozymes106404 氯化钠，p.a.107657 微生物一水乳糖112533 生物化学月桂基硫酸钠822187 万古霉素氢化物，sigma V 20023.2 药品和准备1.03756干纯微生物牛胆苯1.05454 BGLB或Oxoid CM311.07214 胰蛋白胨1.10213 微生物胰蛋白1.10266 LST或Oxoid CM 451 或Difco 02413.3 器材101601 试管，直径15或16mm,长160mm101603 平口试管17/18mm长180mm101605 平口试管，聚丙烯，10mm长100mm101901 发酵试管，圆底，纵切7 mm长28 mm252801 发酵试管，聚丙烯，12mm 长55mm902103 调整到301培养，如Heraeus B61204 样品样品处理根据产品相关标准或说明根据L1-00.700或L1S细节取适当用量选恰当方法处理样品。5步骤51 样品的准备样品的准备与稀释在L1-00.700中有说明注意在从第一个稀释度（-1）的准备到最后的分析不超过15分钟52样品准备-特别事项521 谷物和面粉类制品用100ml蒸馏水溶解5g淀粉酶，过滤灭菌并加10ml到80ml无菌的TS中。5.2.2稠化1ml甘露聚糖酶加99mlTS溶解，过滤灭菌注意加入的甘露聚糖酶体积可以增加到3ml，以促进诸如藻酸盐、果阿胶、黄原胶特殊稠化剂的溶解。5.2.3卵磷脂灭菌前加1ml到80至90ml的TS中，第一个稀释度充分混匀。5.2.4 含脂肪较多的食品（20%脂肪含量）灭菌前加1ml到80至90ml的TS中，第一个稀释度充分混匀。5.2.5酸性或类酸性产品第一稀释度PH低于6.5的，用1N的氢氧化钠调至PH6.5-7.05.2.6婴儿食品根据样品类型要求，如ML-44.006和CP-08.714中所述，称取10g产品到90mlTS中，在宽颈瓶里稀释。将产品喷洒到该溶液上，放置10分钟，通过慢慢旋转瓶子将湿润、溶解。如有必要，40以下水浴5分钟同时轻轻震荡散热，然后室温放置。如果其他类型样品要求，可适当调整TS用量。5.2.7植物乳用LST加万古霉素。加过滤灭菌后的万古霉素稀释至最终浓度10g/ml5.3 接种转接10ml第一个稀释度或10ml原液体样品到10ml双倍LST料液1ml（-1）稀释液和之后的稀释接到10ml单倍LST培养液中小心混匀接种液与培养液5.4 培养所有的双倍和单倍LST试管301培养24和48小时注意如果是婴儿食品分析，LST肉汤必须在371培养24和48小时5.5 观察24和48小时后检查各试管，有产气或变浑浊的均认为是假定大肠菌群。大肠菌群的存在应该在这些管中确认。5.6确认每支产气或浑浊管转接一环到BGLB肉汤30培养。如果此阶段气体形成无法观测则再培养24小时。24或48小时培养后对每个稀释的阳性管数第一时间统计。注意对于婴儿食品，LST假定阳性管要在VRBL上进行划线培养，用于如L1-00.743-2上所述进行后续鉴定6结果描述6.1 计算仅计算大肠菌阳性管并将结果表述如下：出现或不出现测试：基于阳性管确认数，根据所做稀释度计算，并表达为：每克或每毫升分析样出现或不出现大肠菌。（见L1-00.700）最大可能数（MPN）：根据L1-00.700计算大肠菌确认数。6.2方法的精确度如果是MPN，其结果必须考虑到置信度的限制。第二章固体培养基中的举例应用1方法原理倾注法接种到VRBL琼脂培基上，并做适当的稀释度。30培养20至24小时。列举特征菌落。注意根据所提供的不同的大肠菌群的定义选择不同的培养温度。2试剂与器材2.1脂红胆汁乳糖胆盐VRBL根据制造商说明准备培养基，如非干粉成品，按以下方法配置蛋白胨 7.0酵母汁 3.0 乳糖 10.0氯化钠 5.0胆汁盐 1.5中性红 0.03结晶紫 0.002琼脂-琼脂 9.0-18.0蒸馏水 1000mlPH7.2-7.6（25）*根据供应商推荐各组分水中放置5分钟，混合，煮沸，同时搅拌。调整PH，煮沸2分钟，不须灭菌和再热。立即45-47水浴冷却。2.2 BGLB药品和试管的准备参考第一章3 化学药品、培养基和器材3.1化学药品3.2培养基和微生物准备3.3器材请参考第一章和L1-00.7004 样品根据标准或产品相关说明处理依据L1-00.700或L1s的具体规定选取适当量和恰当方法处理样品5步骤5.1 样品准备样品准备和稀释如L1-00.700上所述注意在从第一个稀释度（-1）的准备到最后的分析不超过15分钟。52样品准备-特别事项参照第一章5.2.1至.3接种转接每个适当梯度1ml到无菌平皿，立刻倾注45-47的VRBL约15ml，马上将其混匀，水平放置冷却凝固，不堆叠。 完全凝固后再一层5-10ml的VRBL在上面，然后待凝固。5.4 培养倒扣放置301培养20-24小时，不要堆放超过6个皿。5.5.1 ISO方法4832在VRBL上培养，计数直径0.5mm或更大，略带紫色的菌落，有时其周边会有微红胆盐沉淀物注意不要求再确认5.5.2 AOAC，BAM在VRBL上培养，计数直径0.5mm或更大，略带紫色的菌落，有时其周边会有微红胆盐沉淀物。确认那些认为有气体产生（如5.6所述）的菌落为大肠菌群。注意1在菌落周边出现的微红胆盐沉淀取决于大肠菌群的类型和培养基的质量。注意2某些大肠菌群菌落颜色可以变成粉红色或者甚至白色。5.6确认接种5个特征菌落到BGLB管中（2.2），30培养24小时.如果24小时后气体产生不易观察，可再培养24小时。产生有气体在发酵管中的被认为是大肠菌群。24或48小时后，记数每个稀释度的产气管数，将结果代入公式计算（第六节）注意如果是婴儿食品，在VRBL琼脂上的菌落则须如L1-00.743-2上所述进行鉴定。6 结果表达保留特征菌落数在10-150之间的平皿，每克或每毫升样大肠菌数计算如下：number（per g or ml）=C /（n1+0.1n2）d C：所有保留下来的平皿的菌落总和n1：保留下来的平皿中第一稀释度的平皿数n2：保留下来的平皿中第二稀释度的平皿数d：例10-2稀释度： 128个菌落10-3稀释度： 11个菌落number/g=128+11/（1+0.1*1）*10-2=1.3*104co