（茶学专业论文）催化合成茶氨酸的菌株筛选与重组菌的构建.pdf

摘要 茶氨酸 t h e a n i n e 是1 9 5 0 年首次从绿茶中分离得到的 是茶叶中的特征氨基酸 也是茶叶 的呈味物质之一 具有很好的生理功能和商业价值 其制各研究是目前茶学研究中的一个热点 由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸 成本高昂 化学合成茶氨酸工艺较复杂 组织培养合成茶氢 酸产量低 开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值 本论文针对茶氨酸的微 生物发酵法制备技术 开展了菌株筛选和工程菌构建两方面工作 将生物技术运用到天然产物制 各技术中 本论文通过比较不同微生物催化l 一谷氨酰胺 l 吒l n 和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力 大小 对微生物进行了筛选 明确了9 种微生物催化合成茶氨酸的能力 通过基因克隆技术构建 了重组菌 优化了重组菌催化合成茶氨酸的条件 重组菌株酶活达到出发菌株的1 5 倍 茶氨酸产 量达到2 9 4 0 9 l 主要研究结果如下 1 对9 种微生物催化l 一谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力进行了测试 发现它们催化 合成茶氨酸的能力都很低 茶氨酸的最大生成量仅为7 9 l l i g l 2 以培养好的西曲e 订c 州ac o j id h 5n ec o j j d h 5n 菌液为模板进行p c r 反应 将扩 增出的y 一谷氨酰转肽酶基因片断和载体p e t 3 2 a 相连接构建重组质粒p e t g 6 t 将重组质粒 p e t g g t 转化至ec o j jb l 2 1 中 构建重组菌 重组菌株经0 0 5 枷i p t g 在3 2 诱导后 s d s p a g e 结果显示出明显的特征蛋白质条带 经酶活性检测 重组菌株每克湿菌体的酶活达到2 0 u 1 左 右 约是出发菌株ec o j jd h 5a 的1 5 倍 3 本实验优化了重组菌催化l 一谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的反应条件 重组菌经3 7 培养2 h 左右 然后再加i p t g 至o 0 5 i h l l 于3 2 诱导表达4 h 收集菌体 1 m l 反应体系 含0 3 5 ml 一谷氨酰胺 2 叫盐酸乙胺 7 0 m g m 1 菌体 p h 9 5 于3 0 培养4 小时 茶氨酸的最大生成量 为2 9 4 0 9 l 即每克湿菌体可催化合成茶氨酸的量为4 2 0 9 l l 吒l n 转化率为4 8 2 2 s u z u k i 等报道的用构建的重组菌催化谷氨酰胺 g l n 和乙胺合成茶氨酸的量为2o 9 0 9 几 g 1 n 转化率为 6 0 本实验中的l g 1 n 转化率稍低 但是茶氨酸产量有所提高 本实验构建的重组菌具有较好的催化l 一谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力 可以尝试 用其进行发酵生产茶氨酸小试实验 可以尝试将本实验构建的重组质粒转化到不同表达载体系统 中 以寻找更适合y 珞氨酰转肽酶大量表达的载体系统 本实验对于微生物发酵法工业化生产茶 氨酸等方面的工作具有较好的指导作用和实际价值 关键词 筛选 茶氨酸 y 一谷氨酰转肽酶 重组菌 催化合成 a b s t r a c t t h e a i l i n e w h i c hw a sf i r s ts e p a r a t e d 行o mg r e e nt e ai n1 9 5 0 i sn o to n l ym em a i nf h e 蜘i n oa c i d c o m p o n e n to ft e a b u ta l s om em a j o ru m a r l l ic o m p o n e n to ft e a np o s s e s s e sh i g hp h y s i o l o 西c a la 1 1 d m e d i c a lb e n e f i t s t h ep r e p 鼬t i o no f t l l e a l l i n ei sar e s e 甜c hh o tp o i n t t h a ti ti sv e r yd i m c u l t 柚dm o r e e x p e 岫i v et oe x 呲iah i 曲 r 时t h e 锄i n ed i r e c t l y 疗o mt e al e a v e s t h et e c h n i c so fc h e m o s y n h e s i s m e a l l m ei sc o m p l i c a c e d t h ey i e l do f 也e 锄i n eb y 廿s s u ec u l t i l r ei sl o w s o 廿1 eb i o s y n t h e s i so f t h e 柚i n e i sg c 砸n gm o r ea n dm o r ea t t e 确o n i nt l l i ss t u d y w es c r e e n e d 山em i c r o b ea n dc o n 蛐m c t 也e 陀c o m b i n 柚t s 订a m t a i i n gt l l eb i a t c c h n d l o g yt ot h ep r e p 盯a t i o n0 fn a t u r a lm a t t e r i nm i sp 印e r t 1 1 es c r e e n i n go f m i c m b ew 船d o n e t l l ea b n i t yo f s y n t h e s i st h e a i l i r 圮a sac 甜a l y s to f n i n eh n d sm i c r o b ew e r ec o m p a r e d nw a sf b u n dt h a tt 1 1 ea b m l yo fn i n ek i l l d sm i c r o b ei sl a w w bc o n s 劬c l e dar e c o m b i n a n tg 廿a m t l l e c o n d n i o n so f b i o s y n m e s i st h e a i l i n ew e r eo p t i m i z 酣 t h ea c t i v i t yo f r e c o m b i l l a m 曲面ni sa b o u t1 5t i m e s h i 曲e rm 锄廿i e 西幽眦枷c d 盯d h 5 d e c d 肛i h 5 n 1 1 1 em a i nr e s u l t sa r e f o l l o w s l t h ea b i l i t yo f s y n 血e s i st 1 1 e a l l i n e 拈ac a t a l y s to f n i n el i n d sm i c m b ew e r ec o m p a r e d i tw 器f o u n d l l l a ti i i n ek m d s 耐c m b eh a v eal o wa b i l h yo fs y n l l l e s i st l i e 柚i n e n em o s ty i e l do ft i l e 锄i n ej so n l y 7 9 m 叽 2 w eg o t 也eg 咖0 f t 群删咖y 慨印印僦粥e 疳o me c o 矗d h 5 qb yp c r 耽er e c o m b i n 孤t p l 础i dp e t g o tw 嬲c o n g 奸u c i e db y 也eg e mo ft 唱l u t 锄y 1 订a i i s p e p 乜d 触e 孤dp e t 3 2 a t h e t e c 0 i n b 恤a mp l 蝴n i dp i 犴舶tw 勰打a n s f o n n e dt oe c d 对b l 2 1 1 g 1 1 i i a m y l 廿蜘s p e p t i d a s ew a s p r o d u c e d v i t i l0 0 5 m ml p t bi i i3 2 i n c u b 鲥o n t h ea c t i v 时o fl g 船s l lc e l l s0 f r c c o m b i n a n tg 啪l i i li s u 蚰a l l y2 0u n i t 鲋m l i ti sa b o u t1 5 廿m e sh i 曲e rt i 啪t h ee c d nd h 5 以 3 t h er c a d i 叽c o n d m o n 矗竹s y l l 血e s i s 血e 锄i n eo f 陀c o m b i n a n ts 删nw e mi n v e s t i g a t e d t h e r e c o m b i n a ms 衄 mw 如i n c u b a l e da t3 7 f o r2 h n l e ni n c u b 种e da t3 2 w i t l lo 0 5 m mi p t gf o r5 h i n 1 m lr e a c 廿o ns y s i c m w h e no 3 5 ml g l nw 勰u s e d 2 o me t h y l 锄i nh y d r o c h l o 瑚 7 0 m 咖lf r e s hc e l l s p h 9 5 锄di n c u b a t i o na t3 0 f o r4 hw e r et l l eo p t 吼u mc o n d i d o n 1 1 1 ey i e l do f n i e 柚i n ew a s2 9 4 0 醵 e q u i v a l e n tt ol g 丘e s hc e u s c a l lp 同u c e4 2 0 班t h e a n m e t h ec o r l v e 倒o nr a t eo f 广g 1 n 船t ot t l e 锄i n e b e 吨4 8 2 2 c 唧a r e d 谢l l ls 1 j z i l l c i 碍p o r t 2 0 9 0 班m e a i l i n ew 船s y l l 也e s i z e d b yr e c o m b i n 枷 m i c r o b e t t l ec o n v e r s i o nr a t eo f l g i n t ot l l e a n i n eb e i n g6 0 t h er e c o m b i n a n ts 删nh 船ag o o da b i m yo fs y n 也e s i st h e a l l i ea s ac a 埘y s t f o rt h ef l l t u r e m e e x p e r h n e n t a 廿o no f s y n t h e s i st l e a n i n eu 廿l i z i n g 廿1 er e c o m b m 柚ts 仃a hs h o u l db ed o n e t h er e c o m b i n 柚t p l a s i i l i dp e m g g ts h o u l db e 仃锄s f 0 皿e dt 0d i 丘b r e n tc a i t i e rs t e m l o o k i n gf o rt 1 1 ec a r r i e rs y s t e mo f h i g he x p r e s s i o n 懈l u t 卸1 y l 咖s p e p t i d a s e t h i s 曲j d yh a sab e n e ri n s n u c o na n du t i l i z i n gv a l u ef o r p r o d u c e m gm e 锄i n eo f m i c r o b e 挹r r i l e m k e yw o r d s t h e 锄i n e s c r e e i l i i l g g l u t a m y l n 彻s p e p t i d a s e r e c o m b i n a n ts t r a i n c a t a l es y n 廿l e s i s 英文缩略表 英文缩写蕊文全称 中文名称 a m pa m p i c i l l i n氨卞青霉素 腑 a d o s i n e 5 m p h o s p h a t e腺苷三磷酸 b pb a s e 弦i r碱基对 e be i l l i d i mb r o m i d e 溴化乙锭 e d l a a t h y l e n ed i 锄e m i n e t e 虹a a c e t i ca c i d乙二胺四乙酸 争g g 下掣城a m y 衔a i l s 刚出 谷氨酰转放酶 l g k 西u t a f n i n el 谷氨酰胺 h p l c h i 曲p e 哟m a c el i q u i dc h m a l o g r a p h y高效液相色谱法 p t g i s o p f o p y l t k o p 牡g 日l a c t 0 s i d e 异丙基硫代 b d 半乳糖蛰 l bl w l a b e 衄d l b 培养基 m c 8 m u h i p l e c l 州n gs j t e多克隆位点 o d o p d c a ld e n s 时光密度 ip c r p o l y m e r 罄ec b 斑辑a c 镬o n蒙台酶链式反应 i 耶孙憾d n n n n 钯h 铷n e t l l y l e l y l e n e d i 锄i n en n n n 四甲基乙二胺 独创性声明 本人声明所毓交的论文是我个人在导师指导下进行的研究 l 作硬取得的研究成 粜 塔我所则 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中刁 包含奠他人l 经发 挺 e 撰o 过的研究成粜 j l 卅 包含为获得中国农业科学院或 站 三 教阿目 构的 化或 f 5 而使用过1 1 勺材料 与我一同t 作的同志对本研究所做的任何贡献均已靠 沦文r 作了 明确的说明并表示了谢意 研 究生签名 谚 员动良时间 争曲纷莎月 矿h 关于论文使用授权的声明 小人完令了解中国农 科学院有关保留 使用学位论文的规定 u l j 小吲农 k 科 学院订权保馏送交沦文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借i i 一j 以乐川始l i j 掰f 叫或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同意中国农业科学院可以用一i 力 式在 i 同媒体j 发表 传播学位论文的全部或部分内容 保密的学位论文在解密后应遵守此协议 沦史f l j 斤镌名 导师签名 张浪 时1 1 l j 扣珞易月 l j 匆协孱6 媳 补 孛国农娩辩学院硕士学位论文 第一章绪论 第一章绪论 1 1 茶氨酸研究的历史与现状 荣氨酸 t h e a n i n e 是茶叶中的特征氨基酸 也是茶叶的星味物质之一 它是1 9 5 0 年由日本 酒户弥 郎从玉露茶新梢中发现的 并命名为茶氨酸 酒户弥二郎1 9 5 0 到目前为止 在其它 植物中很少有发现菸氟酸的报道 除了在荤 茶梅 蘑菇 油茶 级山茶中已检测出微量存在外 在其它攮物中巍束发现 茶氨酸是茶树中含量最高的游离氨基酸 在茶树的薪携棼咔中 7 0 左右 的游离氨基酸是茶氨酸 在茶鲜叶中 一般茶氮酸的含量占干重的1 2 有些名特优茶含量可 超过2 在茶汤中 茶氨酸的浸出率可达8 0 对绿茶有重要作用 宛晓春2 0 0 3 近年对茶叶保 健成分的研究中 茶蛰e 酸是比较引人注慝的一个能奋物 它的诲多生理作用被发观后 台成及提 荣氨酸属酰胺类化合物 化学命名为 n 乙基一y l 一谷氨酰胺 n e t h y 卜y l g l u t a i n e 结 为l 黧 纯晶为白色钟状结晶 熔点2 1 7 2 1 8 分解 a 鼍 7 妒 极易溶予水 面不滚 于羌永乙醇和乙醚 置溶解性 瞳温度升高而增大 水溶液成微酸性 其有焦糖的羲睬和类似味精 的鲜爽味 味觉阀值0 0 6 9 6 经6 1 几的盐酸水解厢生成l 一谷氨酸和乙胺 茚三酮反应成紫色 与碱式碳酸铜反应生成淡紫色柱状铜盐 陈椽1 9 8 3 茶氨酸的性质较稳定 将茶氨酸溶液煮沸 5 畦n 或将茶氨酸溶予娜3 o 的溶液中并在2 5 下储放1 2 个月 茶氪酸含量不变 因此在通常 睁食品加工 杀菌过穰中 茶氨酸的性质不会发生变化 太入 c 棼 c 隧 c 啪o c 髭 i 豳1 1 茶氮酸结构式 f 噜l lm o h u l eg 响c 亡h 砖o f t k 髓j n c 辅曲y lg l u a 嘶l 船 作为茶叶的特征氨基酸 茶氨酸几乎存在于茶树的所有器官和组织中 经大量研究表明 茶 氨酸在茶树的根部形成 然后向新梢积聚 因而茶树新梢中茶氨酸禽量最高 老叶 根部 茎部 也有少量分布 而果皮 子叶中含量媛少 茶氨酸静形成是茶树储存氮救手段之一 这是因为茶 氨酸被荼氪酸水解酶水解为谷氨酸和也胺 乙胺在胺氧仡酶的作用下产生氨和乙酸 氨可作为氮 源供茶树的幼龄组织生长 因此茶氨酸是茶树幼芽光合作用开始前谢机碳骨架合成的起始物 而 且也是茶树中多酚类物质的重要前体 张莹等2 0 0 3 茶氨酸在茶树中的积累与光照 温度和合 藏前体密切捃关 研究发现当温度为2 5 黑暗条件下 在培葬基中船入盐酸乙胺缝明显增热茶 中国农业群学院硕士学霞论文 第一章绪论 氨酸的积累 1 9 9 2 年我国学者李荣林等对茶树新梢中茶氨酸的分布情况及其在不同攀节 不同品 种弄 不同栽培条件下台量的变化作了较全面的研究 李荣林1 9 9 2 发现 随着茶树叶片成熟度的 增抽 荟氨酸的含量逐渐降低 因疵茶氨酸可作为茶鲜时嫩发雏铯学指标之一 茶氨酸在新楼中 的含踅随季节的不同存在显着的差异 其在春茶新梢中的含量是在夏茶中的4 倍 怒在秋茶中的7 倍 环境对茶氨酸含麓也有较大的影响 土壤的p h 假下降 不利于茶氨酸的积累 而氨态氮的存 在和遮荫环境有利予茶氨酸的积累 茶b 制作过程不弼 其茶中茶氮酸的含量也蠢明显变化 绿 茶谁i 造过程中由于豁氩酸的转纯使茶氨酸的含量呈增加趋势 黄茶 青茶 黑茶镥4 建过程中谷氨 酸的燮化不明显 茶氨酸呈减少趋势 白茶制造过瑕中茶氨酸变化的特点是长时间的萎凋中蛋自 质分解 谷氨酸增多并向茶氨酸转化 因此茶氨酸开始表现为增加趋势直至干燥才有所减少 而 红茶发酵过程茶氨酸变化复杂 有增膏减 总趋势是减少 1 9 9 7 年钟俊辉等研究了不薅培养条件 不同碳源帮不霹耀境对茶愈伤组织培养及萁茶氪酸的积累的影响 发觋激素i a a 积6 一默结合作用 时 以i a a 2 m g l 和6 一b a4 m g l 时对茶氨酸积累最有利 而培养基中碳源不同 愈伤组织的增长速 率及其茶氨酸的含最的差异并不显着 但当用不同浓度的蔗糖作为碳源时发现 随糟蔗糖浓度的 增加茶氨酸豹积累里上升趋势 钟俊辉等1 9 9 7 1 9 9 7 年弃桂年等骈究表明 不固工艺杀青对氨 基酸缀分含量有一定的影响 萁氨蒸羧总量和茶氨酸含量均为蒸汽蓉青 锅炒杀脊 滚篱杀青 并且提出可通过工艺技术对茶叶中茶氨酸和其它氨慕酸的含量进行调控 齐桂年等1 9 9 7 虽然人们普遍认为茶氨酸可作为评价绿茶质量的熏要标志之一 但对红茶茶氨酸的含量与其 品矮的相关性闷题有蕾不同的看法 e k b o 疆 o t ik l 等在对1 7 静茶的茶氮酸禽量进露分析时发现 某些级茶中茶氨酸的禽量并不毙绿茶和乌龙茶低 有的红茶 如中国的云南茶 中荼氨酸的含量甚 至还商于某些绿茶 e k b o 学o hk h 酣廿f1 9 9 7 赵和涛等在研究茶氨酸的生化特性时测定了我国 六大荣类中茶氨酸的含量 结果发现以白茶中茶氨酸的含量最高 为3 0 0 7 9 l l l g 1 0 0 9 之间 其次是 绿茶和黄茶 在1 7 3 0 1 一1 9 鳇7 m g 1 0 0 9 乏闯 红茶相对绿茶低一点 为1 4 6 1 6 m g l o o g 毒茶 为6 2 7 4 m g 1 0 0 9 含量最低的是黑茶 只有7 1 1 m g l o og 这可能是由于其加王过程中特有的 渥堆作用导致了茶氨酸大量损失 赵和涛1 9 9 4 因此也有学者认为荣氨酸的含量也可作为红茶品 质的裁要评价因子之一 1 2 茶氨酸体内生物合成途径 茶氨酸在茶树根部由茶氨酸合成簿催化谷氨酸和乙胺反应合成 然后通过枝干送至叶部 并 积慕农叶中 芽与第一卧中含量最高 往下逐渐降低 在光照射下茶氮酸会分解为谷氨酸和乙胺 谷氨酸成为氮源 乙胺氧化后被用于合成儿茶素 如图1 2 这个分解代谢在蔽光条件下受到抑 制 因此遮荫栽培的茶叶中茶氨酸宙量较高 相反则是多酚类含景商 杨贤强1 9 8 2 村松敬一郎 1 9 9 1 日本的玉露 辗茶 抹茶原料 的栽培就是采用遮赘法以提高茶叶中茶氨酸含量 2 乏妊 善篓 二二 西氯t 磐嚣穗 聿 r 乙胺 知几萦囊 蓦李 二二二 冒1 2 茶戴馥在茶树体内代谢途径 f 培1 2 硪t e 髓i n e m d 曲0 1 i s m 轴v i v i d t e 8 p l b n t 茶树中茶氨酸合成产蘸体是谷氨敬和己胺 这一点己用1 示踪的方法得刭7 证实 t 呔e ot 1 9 7 4 竹尾忠一1 9 8 1 乙胺是由丙氨酸脱羧而来 t a d a i c a z u t1 9 7 4 丙氨酸和谷氨酸虽然广泛 存在子各种动植物体内 但却只有茶树才獒有大惫合成茶氨酸的能力 这是因为茶树体内其有l 谷氨酸 乙胺连接酶 l g l u t a t e e t h y l i n e1 i g s e 又称茶甄醒合成酶 该酶催化如下反 应 l 谷氨酸 乙胺 a t p 茶氨酸十a d p 磷酸 该酶己波k s a s a o k a 等从茶的籽根中分离出来 并证实对谷氨酸 乙胺和盯p 共有较商的特异紊和力 豆仅海茶树所特有 值该酶在体外板易失 活 s u s k ak 1 9 6 5 茶氨酸体内合成过程中另一重要的酶是丙氨酸脱羧酶 卜a l a m i n e d e c a r b o x y l a s e 它催化丙氨酸脱羧形成乙胺 在体外的稳定性比茶氨酸合成酶要嵩得多 1 3 茶氯酸的生理功能研究与开发利用前景 从茶氨酸自发现以来 一越是被作为茶时的主要品度成分广为磷究 近尼年来 茶氨酸其有 的一些特殊生理功能不断地被发现和研究 特别是其具有的药用功能成为研究的热点 茶氨酸的 主要生理功能有 1 降赧压作嗣 敞o g o s h ih 等擐道了茶氨貔对先天性高血压患者具有降压俸用 y o k o g o s h i h1 9 9 8 a 血压是通过人体的中枢及末梢神经系统的递质儿茶酚胺和5 一羟基色胺的分泌量来调节 的 y o k o 9 0 8 h ih 等通过实验证明 服用茶氨酸后5 一羟基色胺在老鼠大脑中的含成减少了 且增 加了5 一羟基色胺在老鼠丈藏中翡分解 老瓤肄魂豹5 一羟基色胺的含量骧显降低 在给自发褴嵩盘 压老鼠注射不同剂量的茶氨酸时 血压也量下降趋势 并且下降的撩度与注射的荆量呈正比关系 但茶氨酸对血压正常的犬鼠没有降巅压作用 y o i 0 9 0 s h ih1 9 9 8 b 2 增强抗葺孛癌药物的疗效 近期的研究表明荼氨酸本身壕无抗舯癌活动 却毙提高多种抗辨 瘤药物的疗效 抗癌药毒杀索 d o x o r u b i c i n 与茶氨酸配合应用时 可抑制m 5 0 7 6 卵巢内瘪向肝 脏转移 当将茶氨酸与抗癌药阿霉 d o x o r u b i c i n d 0 x 同时使用时 增强了阿霉索抗癌的功效 茶氨酸因嚣被认为具有骑癌抗瘿的作用 s 勰邵k a y d 胡9 9 8 2 0 0 2 茶氨酸每d 0 x 一起使朔时 3 中国农业科学院硕士学位论文 第一章绪论 不但提高d 0 x 的抗肿瘤活性 而且还提高其抑制肿瘤转移活性 其原理均为防止d 0 x 从肿瘤细胞中 流出 从而提高了d o x 在肿瘤细胞中的浓度 s u 舀y a r n a t 甜口f1 9 9 9 2 0 0 1 年 s a d z u k ay 等研究了 茶氨酸提高抗癌药阿霉素 d 0 x 抗癌活性的途径 s a d z u l a y 甜甜2 0 0 1 研究认为谷氨酸盐进入 细胞后生成谷胱甘肽 谷胱甘肽会与抗癌药结合而被泵出细胞外 而茶氨酸能减少细胞对谷氨酸 的吸收 使细胞中谷胱甘肽的生成量减少 从而抑制了抗癌药物的流出 z h a n gg 等研究了绿茶粉 末 p g t 和茶氨酸的直接抗癌作用 指出它们对恶性肿瘤和由恶性肿瘤引发的高血脂具有抑制作 用 z h g g 酊口j 2 0 0 2 3 松弛神经紧张 焦虑等作用 t e r a s h i m a 等人发现茶氨酸的主要受体是脑 茶氨酸通过大 脑屏障进入大脑后 使大脑细胞中线颗粒内的神经递质多巴胺显着增加 而多巴胺是肾上腺素和 去甲肾上腺素的前驱体 是传达脑神经细胞兴奋程度的重要物质 它的释放会大大影响人的情绪 t e m s h i i n a t 甜甜1 9 9 9 另外 y o k o g o s h i 等人通过使用血清素 5 一羟色胺 代谢抑制剂研究发 现茶氨酸可对大脑血清素的合成和分解产生影响 服用茶氨酸后 大脑中色氨酸的含量明显增加 或有增加趋势 可使血清素的含量减少 茶氨酸可能会减少血清数的合成及增加其分解 或抑制 血清素的释放 y o k o g o s h i h 甜讲1 9 9 8 咖啡因有提神兴奋的作用 茶叶中也含有较多的咖啡因 单独摄入咖啡因对人体有一定的危 害 而饮用茶后 却不会产生饮入等量咖啡因的兴奋作用 1 9 7 5 年木村等人研究证明了茶氨酸对 咖啡因产生的兴奋有拮抗作用 木村赵平等1 9 7 5 2 0 0 0 年有学者用脑电图仪评价方法进一步确定 茶氮酸和咖啡因在几乎相同摩尔浓度的情况下 对咖啡因的刺激作用产生拮抗 这也是饮茶后能 使人心情平静 情绪稳定的原因 k a k u d a t 2 0 0 0 有报道指出茶氨酸能促进大脑皮层产生n 波 而n 波的产生是人身体产生舒畅 愉快感觉的标志 并且茶氨酸没有引起睡眠状态时发生的 波 的数量的增加 因此茶氨酸在使人情绪稳定的同时还能使注意力更集中 4 对脑神经细胞保护作用 谷氨酸是兴奋神经传递物质 在神经细胞内含量保持在1 1 0 m o l 几 在细胞外为1 2 岫o l 几 当脑缺血时 细胞内因0 2 供应中断 使细胞内的能源物质a t p 生成量减少而逐步枯竭 神经细胞膜分离 谷氨酸过多的向细胞外释放 并作用于受体 使细胞 内钙离子浓度持续增高 激发各种分解酶的活性 并最后作用于细胞而使之破坏 死亡 而茶氨 酸对谷氨酸受体有竞争保护作用 因此茶氨酸对脑组织有保护作用 可避免由脑缺血所致脑神经 细胞死亡 而脑缺血所致的脑神经细胞死亡是脑梗塞 脑中风和血管性痴呆症主要病因 凌关庭 2 0 0 3 5 促进大脑功能作用 茶氨酸能影响人体大脑的功能 服用茶酸后 人的记忆力能得到提高 这是由于茶氨酸影响了与学习 记忆有关的脑内中枢神经递质5 羟色胺的活性 茶氨酸能活化5 一 羟色胺 杜荣茂等2 0 0 2 6 改善经期综合症 经期综合症 简称p m s 是女性在月经前3 到1 0 日中出现的精神及身 体上的不舒适的症状 j u n e j a 等考察了茶氨酸对p m s 的改善作用 让2 4 名女性每日服用茶氨酸 2 0 0m g 两个月后p m s 症状有明显改善 具体有头痛 腰痛 胸部胀痛 无力 易疲劳 精神无 法集中 烦躁等症状得到改善 吕毅等2 0 0 3 其机理还需进一步调查 可能与茶氨酸的镇静作 用有关 7 减肥作用 用混有o 0 2 8 嘲 氨酸的饲料喂养小鼠1 6 周后 其体重比对照群有明显减少 腹腔脂肪减少到对照群的5 8 同时血液中脂肪级胆固醇减少了2 8 因此 茶叶的减肥作用是 4 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 指茶叶中包括茶氨酸在内的多种成分共同作用的结果 研究发现茶氨酸尤其对减少体内胆固醇有 效 吕毅等2 0 0 3 8 抗疲劳作用 王小雪等研究了茶氨酸的抗疲劳作用 小鼠经口给予茶氨酸3 0 h 后 采用负 重游泳实验 观察记录小鼠游泳死亡时间 小鼠游泳一定时间后采血检测清尿素氦 血乳酸 取 肝脏检测肝糖原 结果经口给予小鼠不同剂量的茶氨酸3 0 h 后 能明显延长小鼠负重游泳时间 减 少肝糖原的消耗量 降低运动时血清尿素氮水平 对小鼠运动后血乳糖升高有明显的抑制作用 能促进运动后血乳酸的消除 王小雪等2 0 0 2 李敏等研究指出 茶氨酸具有延缓运动性疲劳作 用 其机制可能与茶氨酸增加脑组织中d a 多巴胺 含量 抑制5 一h t 5 一羟色胺 的合成和释放 等效应有关 李敏等2 0 0 5 9 提高免疫力 防御病毒 2 0 0 3 年5 月美国 国家科学院进度报告 发表了哈佛大学研究 人员k a a t ha 等就茶氨酸在人体肝脏分解为乙胺和谷氨酸后 前者调动了 伽玛一德耳塔1 型 细胞 这种人体血液免疫细胞作出抵御外界侵害的反应 成为抵御放大细菌 病毒因子的第一道 防线 继而t 型细胞促进干扰紊的分泌量激增5 倍 对细菌的歼灭反应提高1 0 倍 可是喝咖啡 者的免疫细胞的干扰素分泌量没有变化 k a m a t h a b 口 2 0 0 3 这种调节机体免疫系统的功能 使茶中的 l 茶氨酸 可制成药物以提高体内的抗传染能力 b u k o w s k ij f 酣口f1 9 9 9 美国的科学家研究发现荣氮酸可以让人体对疾病的抵抗力提高五倍 这种物质具有调动免疫 细胞活力的功能 从而使肌体可以更好地抵抗细菌 病毒 真菌等 可以预计未来有一天会把这 种物质转化成治疗药物 尤其在s a r s 期间 国内外专家都提出 饮用绿茶有助于增起人体免疫 力 预防传染病 美国的最新研究 这些可能均与茶氨酸的作用有关 哈佛医学院布考斯基博士 通过对志愿者进行测试 证明茶氨酸可以通过调节免疫细胞来增强人体的免疫系统 抵抗致病微 生物如病毒 细菌 真菌的入侵 林智2 0 0 3 茶氨酸除了具有i l 上药用价值外 在食品领域也有很好的应用价值 早在1 9 8 5 年 美国食品 和药物管理局 f d a 就认可了茶氨酸 并确认人工合成茶氨酸是一种公认安全的物质 g r a s 在使用过程中不作限制用量的规定 其安全陛实验表明 茶氨酸的大鼠急性毒性在5 9 k g 以上 连 续服用2 8 天 每天2 9 k g 茶氨酸的亚急性实验中 大鼠未见任何毒性反应 在致突变实验中也没 有发现茶氨酸的任何诱变作用 细菌恢复突变实验也证明未导致基因变异 良好的安全性和稳定 性 使茶氨酸已在食品如饮料 焙烤点心 冷冻点心等中得到广泛的应用 可被用作饮料的品质 改良剂 功能性食品的添加剂 风味改鏖剂 茶氨酸是一种安全 无毒 具有多种生理功能的茶叶天然产物 具有广阔的开发前景 总的 来说 在技术方面 利用生物技术获得更多的茶氨酸 其中微生物发酵法生产茶氮酸具有很好的 发展前景 在应用方面 除作为食品添加剂外 应开发功能性食品 拓宽茶氨酸在食品领域的应 用 在开发方面 利用茶氨酸的特殊生理功能 开发功能性药物 降低血压 治疗肿瘤 预防老 年痴呆症等 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 1 4 茶氪酸制备技术的研究 1 4 1 提取分离技术 1 4 1 1 特殊试剂沉淀法提取茶氨酸 特殊试剂沉淀法是采用某些有机或无机试剂与相应氨基酸形成不溶性衍生物的一种分离方 法 茶氨酸与碱式碳酸铜生成淡紫色柱状铜盐 利用此性质可将茶氨酸分离 传统的提取方法是 因茶叶中存在的游离氨基酸为水溶性的 选用热水浸提 用醋酸铅沉淀去除茶汤中的蛋白质 多 酚类和部分色素 通地s 去除过剩的铅 用氯仿萃取去除咖啡碱 茶汤中茶氨酸经碱式碳酸铜成 盐后 过滤除去其它组分 茶氨酸铜盐经稀硫酸溶解 加入h z s 和适量b a 0 l i 抽滤去滤渣 浓 缩 精制后得天然茶氨酸纯品 但是此法收率较低 引入杂质重金属离子p 矿 c u 2 用硫化氢除 p b c 一 硫化氢制气比较麻烦 后又加入b a o 1 沉淀硫酸根离子 工序较多 茶氨酸铜盐 在稀硫酸中溶解度不大 为使铜盐溶解 加入稀硫酸量相当大 这样造成除铜盐硫酸根时 形成 大量硫酸钡沉淀 且造成茶氨酸损失 中国农业科学院茶叶研究所1 9 8 3 1 4 1 2 离子交换法提取茶氨酸 离子交换技术是氨基酸工业中应用最为厂泛的提取方法之一 同其它氨基酸一样 茶氨酸作 为两性物质 选择适当的p h 值 用离子交换树脂也可以分离提取茶氨酸 但这方面的报道很少 仅1 9 9 8 年陈瑛等报道了用离子交换法提取茶氨酸 他们选用国产7 3 2 阳离子交换树脂 从茶愈伤 组织浸提液中提取茶氨酸 通过静态 动态实验 对洗脱液的p h 离子强度 样液浓度和流速等 因素进行了考察 比较了在不同条件下 树腊对茶氨酸的吸附情况 茶氨酸的得率为7 0 陈瑛 等1 9 9 8 a 由于茶叶中茶氨酸的含量不高 单纯的从茶叶中提取茶氨酸成本很高 但是 从提取茶多酚 后的残留液中用离子交换树脂提取茶氨酸 却是一项很有经济价值的工艺技术 对茶叶加工生产 厂家来说 这将为茶叶的综合利用与开发提供新的方向 此外 2 0 0 4 年张莹等对茶氨酸在制各色谱分离时其在反相c 一 色谱分离柱上的热力学及动力学 色谱行为进行了研究 结果表明 为提高茶氨酸产率 以采用体积超载方式为好 并可采用峰宽 对体积超载进行表征 当w 增宽1 5 2 0 时 表示色谱柱处于体积超载状态 为提高制备量 可采 用较大颗粒的填料 张莹等2 0 0 4 1 4 2 化学合成技术 茶氨酸传统合成制法是谷氨酸的吡咯烷酮化 1 9 4 2 年以色列人l i c h t e n s t e i n 首次在实验室 中用乙胺和吡咯烷酮酸在水溶液中反应得到茶氨酸 1 9 5 1 年 日本的桥爪斌改进了合成方法 即 用l 毗咯烷酮酸与纯乙胺 而不是在水溶液中 放置 以提高茶氨酸产率 桥爪斌1 9 5 1 1 9 6 1 年 6 孛嚣农她群学院硕士学往论文 第一章绪论 y y a l i l d a 等利用反应物与生成物之间溶解性的差异 将l 吡咯烷酮酸先形成铜盐 再与纯乙胺 反应合成了茶氨酸 丈大提高了反应的收率 y a i i l d aye t 舒1 9 6 1 2 0 0 3 年 y 脒s h o uh e 等报 道了一耱改连的茶氨酸 一谷醛基乙胺 豹合成方法 包括卜答氨酸自孽去氢成为嗽咯靛醺羟酸 p c a 然后再加纯的乙胺 9 9 气 液 反应 得率9 2 6 稃在8 4 乙醇溶液中重结晶后 高纯度茶氨酸 a 型 的得率3 7 4 8 型茶氨酸从l p c a 合成 用h p l c 分析证明 a 和b 型茶氨 酸是混合异构体 a 型含4 7 9 的l 一蕊氨酸 b 型含9 0 9 的l 茶氨羧 y a n s h o u ee 2 0 0 3 套氨酸的虢咯烷黎优并菲是台成茶氨酸的唯一方法 t f u y 栅8 等于1 9 6 4 年采用 硫化碳保 护a 氨基而合成了茶氨酸 1 9 6 5 年 n l i c h t e n s t e i n 改用谷氨酸乙醛为原料 用钯碳催化还原 合成茶氨酸 并在以色列申请了专利 n l i c h t e n s t e i n1 9 6 5 2 0 0 1 年王三永等先将l 一谷氨酸与 无水矗醇反应生成l 一貉氨酸一y 一乙慕酯 再用三苯基氧甲烷保护氨基后 与乙胺反盛生成n 三苯 甲基一b 一谷氨酸一y z t 黻 最后除去量苯甲基褥至l 茶氨酸 魏法的特点为反应中阂产物无需分离 提纯就可进行下一步操作 比较简便 王三永等2 0 0 1 2 0 0 5 年 钱绍松等以廉价的l 一谷氨酸为原 料 采用邻苯二甲酰慕作为保护基 保护l 一谷氨酸的d 氨基 醋酐回流1 0m i n 使其分子内脱水生成 n 邻举二甲酰一卜谷氮泼酝在常温 常压条件下 分别与2m o l l 氨水和2m o l l 乙胺水溶液反应生 成中问产物舯邻苯二甲酰 l 一谷氨酰胺 邻苯二甲酰一卜荼氨酸 中间产物在室溢条件下与o 5 m 0 1 l 水合肼反应4 8 h 脱除保护基 分别以5 7 6 1 的收率得到l 谷氨酰胺和l 一茶氮酸 钱绍松等 2 0 0 5 目前 丑本双筠化生产流程考虑 仍然采用l 一谷氨酸加热脱水生成l 啦咚烷酮酸 然后再与 无水己胺反应生成茶氨酸 化学合成手段制备茶氨酸成本低 操作复杂 魇应条件苛刻 化学合成制造的都是d l 型消 旋体 需要进行拆分才能得到l 型产品 日本学者在这方面进行了大量工作 他们采用微生物固 化酶分离d l 一型氨慕酸彀褥了成功 1 4 3 组织培养技术 棱物组织培养合成茶氨酸是采用茶树细脆或茶树愈伤组织培葬来产生茶氨酸 然后透过离子 交换法提取茶氨酸 1 9 9 0 年o r i h 8 r ay 等采用茶树细胞培养生产茶氨酸和其它y 一谷氨酰衍生物 发现在2 5 下 黑暗中振荡培养能获得最高的茶氨酸含量 0 r i h a r a ye ta 儿9 9 0 同年m a t s v v r a t 等研究了合成前体 光照和温度对茶树愈伤组织中茶氨酸积累的影响 发现在培养基中加入浓 度为2 5 删螅盐酸乙胺 2 5 黑跨条律下 毙壤耱茶氨酸积累 据嚣本报道 采用3 g 新鲜细胞 在5 0 l 培养液中 2 5 悬浮培养4 7 天 培养液经提取 浓缩和干燥 可得纯度8 0 左右粗茶氨酸 4 8 1 9 产量比愈伤组织培养法提高约1 倍 钟俊辉等对不躁培养条件下愈伤组织生长及茶氨酸积累情况进行了研究发现 不同碳源对愈 伤组织生长及茶氨酸积累相近 增加耱浓度有稠于次生代谢物翦积累 愈往组织的凝适培莽温度 和荣氨酸积累温度都是2 5 暗培养更有利于茶氨酸的积累 钟俊辉筠1 9 9 7 1 9 9 8 年陈瑛等研究 了多种激素对愈伤组织合成茶氨酸的影响 试验证明 以4 m g l6 一b a 十2 口l g li 从或3 m g l6 b a 十1 5 m g 几i a a 十2 m g lt a 的组合 添加于璐培养基上 茶愈伤组织嫩长和茶氨酸积累均皂好 茶 氨酸禽量最离可达1 7 0 m g g 陈臻等1 9 9 8 7 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 成浩 高秀清对不同外植体来源的茶树培养细胞的茶氨酸生物合成能力 适宜培养细胞合成 茶氨酸的培养基条件 培养细胞茶氨酸生物合成动态和更新培养基对提高培养细胞茶氨酸累积含 量的效果等进行了分析 结果表明 在一个培养周期中 培养细胞的茶氨酸累积高峰出现在第1 1 d 左右 在以每1 0 d 更新 次培养基的条件下 培养细胞茶氨酸合成能力可维持在第3 0 d 达到细胞 干重的近2 0 9 6 成浩等2 0 0 4 吕虎等进行了茶叶细胞发酵罐悬浮培养试验 结果表明 发酵罐放大培养取得了与摇床悬浮 培养类似的效果 从茶氨酸生产效率来看 细胞培养周期以2 0 2 2 d 为宜 发酵罐大规模培养时采 用桨叶式搅拌器 细胞增长量和茶氨酸合成量优于标准板搅拌器先加入一定量盐酸乙胺再每天进 行少量补充 茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好 并且培养基中盐酸乙胺浓度维持在20 l i i m 0 l l 以上时茶叶愈伤组织的茶氨酸合成量和细胞生长量即可保持良好状态 吕虎等2 0 0 5 组织培养合成茶氨酸由于产量低 最高达1 9 4 1 6 m g g 干细胞重 产品分离纯化过程复杂及 生产工艺的控制难度大等限制了该方法的工业化 m a t s u u r a t1 9 9 4 1 4 4 微生物发酵技术 随着生物技术的发展和应用 利用微生物发酵来生产酶 进而利用酶的提取物来进行目的物 的生产越来越被广泛地应用 与化学合成法相比 微生物发酵法生产茶氨酸具有完全不同的特色 由于酶促反应所具有的高度专一性 所以无需对n 一氨基进行乙胺基化 但是由于生物体内合成茶 氨酸需要a t p 水解成a d p 来提供能量 而 t p 的获得与再生要靠葡萄糖的降解来推动 因此 茶氨酸 的合成反应必须与葡萄糖的降解反应相偶联 微生物发酵合成茶氨酸的反应 实际上是运用微生 物中的谷氨酰胺酶在特殊的条件下 高乙胺浓度和特定的p h 值 进行的非特异反应 而该酶在通常 情况下对氮的亲和力比乙胺大得多 1 9 9 3 年日本报道了已应用于实际生产的酶促合成茶氨酸的反应 利用的是细菌中的谷氮酰胺 酶在特殊条件下 高乙胺浓度和特定的p h 值 进行的非特异反应 a b e l i m 甜口 1 9 9 3 具体方 法是先将一种硝基还原假单胞z 细菌i f 0 1 2 6 9 4 p s e u d o m o n a sn i t r o r e d u c e n s 培养物悬浮在0 9 n a c l 溶液中 将4 5 k 角叉菜胶在8 0 下溶解并冷却至4 5 时与细菌悬浮液混匀 使细菌固 定成直径3 的颗粒 填充于四根1 7 4 0 c m 的柱型反应器中 以0 7 m m 乙胺和0 3 删l 一谷氨 酰胺为底物 在o 0 5 删硼酸缓冲液 p h 9 5 中 3 0 条件下 底物以0 3 个床体积每小时通过反 应器 该方法制各的反应器活性可持续几个星期以上 预计生产半衰期可达1 2 0 次反应 第5 1 次反应 茶氨酸的产量仍可达到4 0 m 0 1 h 粗产物用离子交换柱层析就可分离出茶氨酸 得率可 达所消耗谷氨酸的9 5 左右 而此法严格而言为半生物合成 并因底物试剂乙胺和谷氨酰胺的消 耗及反应周期较长提高了成本 同时该酶在通常情况下对氨的亲和力比乙胺大得多 h i d e y u k is u z u k i 等报道了利用从细菌中得到的谷氨酰转肽酶作催化剂 将2 0 0 m m 谷氨酰胺 和1 5m 乙胺在p h 为1 0 温度为3 7 的条件下 保持5 小时 获得1 2 0 m m 茶氨酸 转化率为6 0 h i d e y u j c is u z u l i 甜可2 0 0 2 采用微生物发酵法可直接得到l 茶氨酸 可大量生产茶氨酸 适合工业化生产 但设备规模 较庞大 成本相对较高 8 串霜农盈科学院硕士学位论文 第一章绪论 1 5 茶氨酸测定方法 茶氨羧的测定方法有缀多种 妇碱式碳酸铜沉淀法 芬三弱显色的薄层色谱法 强酸性阴离 子交换树脂层析法 气相色谱法 磷效渡相色谱法 胶束电动毛缎色谱分析法 紫外光吸收光谱 法 曰立8 3 5 5 0 型 氨基酸自动分析仪 红外线分光