（外科学专业论文）腺病毒介导的vegfsirna抑制骨肉瘤及其肺转移的实验研究.pdf

； 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规 定，同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和 电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影 印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目 录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权 按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子 版；在不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分 或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 年月日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在 弓年解密后适用 本授权书。 各耄圣慧日6伽 ，l 1 6 6麓 签师教导匕申。 进行 论文 表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 签名： 年月日 泔1 i 英文缩写词表 英文缩写 英文全称 中文名 a da d c n v i r u s 腺病毒 a d v e g f s i r n aa d e n o v i m sv e c t o rc a r r y i n g 携带v e g f _ s i 烈a 腺病毒载体 v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r - s m a l li n t e r f e r i n gr n a c d n a c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a c p e c y t o p a t h i ce f f e c t 细胞病变效应 d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e 培养基 m e d i u m e l i s a e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n t 酶联免疫吸附反应 a s s a y e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e l i ca c i d 乙二胺四乙酸二钠 f b sf e t a lb o v i n es e r l l m胎牛血清 m o i m u l t i p l i c i t yo fi n f e c t i o n 感染复数 m v dm i c r ov a s c u l a rd e n s i t y 微血管密度 v o d o p t i c a ld e n s i 够 光密度 气 p b s p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e 磷酸盐缓冲液 p f u p l a q u ef o r m i n gu n i t 斑形成单位 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应 r p m r o t a t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转速 r n a ir n ai n t e r f e r e n c e 核糖核酸干扰 t c i d 5 05 0 t i s s u ec u l t u r ei n f e c t i v ed o s e 5 0 组织培养感染剂量 m c t h o d m g 6 3ao s t e o s a r c o m ac e l l l i n e 一种骨肉瘤细胞系 v e g f v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r血管内皮生长因子 龟 a t c ca m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n 美国标准培养收集所 ， 飞 严 文 q 摘要 摘要 目的通过r n a 干扰技术抑制骨肉瘤细胞中血管内皮生长因子( v e g f ) 的表达， 研究抗血管生成治疗骨肉瘤及其肺转移的作用。方法1 在2 9 3 细胞内扩增已构 建的携带有人v e g f s i r n a 的腺病毒载体( a d - v e g f s i r n a ，国家自然科学基金 资助项目，编号：3 0 2 7 1 3 1 4 ) ，通过氯化铯密度梯度离心法纯化和5 0 组织培养 感染剂量法( t c d 5 0 ) 进行滴度测定，并通过10 0m o i 的a d v e g f s i r n a 感 染h e l a 细胞对其安全性进行评价；2 细胞实验：以a d - v e g f s i r n a 体外转染 m g 6 3 细胞株，以免疫组化的方法分析转染后该细胞内v e g f 的表达情况；3 动物 实验：以m g 6 3 细胞悬液( 1x1 0 6 m 1 ) 皮下接种法，建立荷人骨肉瘤裸鼠 动物模型；实验分组：3 0 只裸鼠接种后7 天随机分为a 、b 、c 3 组，每组1 0 只。各组于细胞接种后的第7 天开始自尾静脉给药。a 组注射a d - v e g f s i r n a1 0 0 | il ，隔日注射，每周注射3 次，共注射9 次。总量为2x1 0 9p 如；b 组注射 a d e g f p l 0 0 l al ，隔日注射，每周注射3 次，共注射9 次。总量为2 1 0 9 p f mc 组注射p b s ，隔日注射，每周注射3 次，共注射9 次。实验自接种开始共2 6 天。 各组分别于接种的1 4 天和2 6 天处死5 只裸鼠，取血、取瘤、取肺。以荧光实 时定量p c r ( r e a lt i m ep c r ) 测定各组动物模型肿瘤组织中v e g f m r n a 的含量； e l i s a 法检测各组裸鼠血液中血管内皮生长因子( v e g f ) 的含量；肿瘤组织 h e 染色，观察坏死情况，以l e i c aq w i n 图像分析系统计算各组肿瘤坏死率； 免疫组化法测定各组肿瘤组织中微血管密度( m v d ) ；测量计算各组裸鼠肿 瘤体积的大小以及肺转移率。结果1 a d v e g f s i r n a 感染h e l a 细胞后，观察 7 天，未发现c p e ；在各个时间点计数细胞，与未转染对照组相比，无统计学差 异，两组细胞的生长曲线也基本一致。2 免疫组化按标准评分：两对照组中最低9 分，a d v e g f s i r n a 组中最高6 分。a 组与b 、c 组间统计分析差别有统计学意 义，b 、c 组问统计分析差别没有统计学意义。3 1 4 天和2 6 天a 组裸鼠肿瘤组 织中v e g f m r n a 的r q 平均值分别为0 0 8 8 0 0 2 4 ，0 0 7 5 0 0 2 6 1b 组裸鼠肿 瘤组织中v e g f 。m r n a 的r q 平均值分别为0 1 7 9 0 1 0 3 和0 1 6 7 0 0 6 5 ；c 组 裸鼠肿瘤组织中v e g f m r n a 的r q 平均值分别为0 1 8 5 0 0 8 5 ，o 1 8 3 4 - 0 1 2 8 。 统计学分析a 组r q 平均值与其他两组的差别有意义( p o 0 5 ) 。1 4 天和2 6 天a 组裸鼠血液中v e g f 含量平均值( p g m 1 ) 分别 h 摘要 为2 4 7 0 2 3 1 0 5 6 3 ，1 9 3 7 4 9 7 9 2 0 ；b 组裸鼠血液中v e g f 含量平均值( p 幽1 1 1 ) 分别为8 3 3 0 0 2 2 9 0 9 1 和8 5 9 6 3 8 1 9 4 7 4 ；c 组裸鼠血液中v e g f 含量平均值 ( p g m 1 ) 分别为8 2 3 2 4 5 9 2 8 6 ，8 31 9 8 7 2 9 5 1 0 。统计学分析a 组其他两组的 差别有意义( p o 0 5 ) 。各组裸鼠肿瘤的坏死 率在1 4 天时较低，2 6 天时升高，但a 、b 、c 各组间差别无统计学意义( p o 0 5 ) 。 1 4 天和2 6 天各组裸鼠肿瘤的m v d 值分别为a 组：l o 2 1 6 ，9 8 1 2 ；b 组： 1 8 4 1 8 ，2 3 4 1 4 ；c 组：1 9 8 3 0 ，2 2 5 1 3 。统计学检验在两个时间段a 组与b 、c 两组间差别有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 7 天、1 4 天、2 6 天各组肿瘤体积的平均值( c m 3 ) 分别为：a 组：0 1 4 7 4 - 0 1 4 3 ，0 4 9 2 0 1 5 1 ，0 5 2 7 4 - 0 1 8 6 ；b 组：0 2 2 5 0 1 0 2 ，0 5 0 4 0 2 7 6 1 0 2 1 0 7 6 9 ，；c 组： 0 1 8 54 - 0 1 0 9 ，0 5 1 4 + 0 3 9 0 ，0 9 0 4 0 4 8 4 。7 天、1 4 天时各组体积无统计学差异， 2 6 天时a 组与b 、c 两组间差别有统计学意义( p 0 0 5 ) 。计算抑瘤率为5 2 3 。大体观察每组裸鼠1 4 天、2 6 天的肺转移率 ( ) 分别为a 组：0 ，2 0 ；b 组：2 0 ，4 0 ；c 组：0 ，4 0 。病理切 片观察每组裸鼠1 4 天、2 6 天的肺转移率( ) 分别为a 组：o ，4 0 ；b 组： 4 0 ，6 0 ；c 组：2 0 ，6 0 。结论a d - v e g f s i r n a 能够转染m g 6 3 骨肉瘤 细胞，抑制v e g f 的表达；以静脉注入动物模型体内能引起靶肿瘤组织v e g f m r n a 的降解，下调血液中v e g f 的含量，抑制肿瘤新生血管的生成，对骨肉瘤 的生长和远处肺转移有治疗作用，但对肿瘤本身无直接杀伤作用。 关键词：骨肉瘤；肺转移；血管生成：抗血管生成；r n a 干扰 n 、 ， 一 文 j q a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n h i b i tt h ee x p r e s s i o no fv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ( v e g f ) i nt h eo s t e o s a r c o m ac e l l s 、) l ，i mr n ai n t e r f e r e n c et e c h n o l o g ys oa st os t u d yt h ep o s s i b l e f u n c t i o no f a n t i a n g i o g e n e s i st h e r a p y i no s t e o s a r e o m aa n d i t s p u l m o n a r y m e t a s t a s i s m e t h o d s ：1 a m p l i f i c a t i o no fa d e n o v i r u sc a r r y i n gh u m a nv e g f s i r n a ( a d - v e g f s i r n a ) i n s i d e2 9 3c e l l l i n e t h e np u r i f i e dt h ea d e n o v i r u s 、析t hc e s i u m c h l o r i d ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t f i f u g a t i o na n di n v e s t i g a t e di t st i t e rb y5 0 t i s s u ec u l t u r e i n f e c t i v ed o s em e t h o d ( t c i d 5 0 ) ? s a f e t ya s s e s s m e n to fh e l ac e l li n f e c t e db y10 0m o i a d - v e g f - s i r n aw a sa l s ou n d e r t a k e n 2 c e l le x p e r i m e n t ：m g 6 3c e l ll i n ew a s t r a n s f e c t e di nv i t r ow i t ha d - v e g f s i r n a m e t h o do fi m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw a su s e d t oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no fv e g fi n s i d ec e l l s 3 a n i m a le x p e r i m e n t ：t oe s t a b l i s h n u d em o u s em o d e lc a r r i e d 、析mh u m a no s t e o s a r c o m ab ys u b c u t a n e o u si n o c u l a t i o no f m g 6 3c e l ls u s p e n s i o n ( 1x1 0 6a n l ) g r o u p i n g ：a f t e ri n o c u l a t i o nf o r7d a y s ，3 0 n u d em i c ew e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o3g r o u p sa ，b ，c ，10m i c ee a c hg r o u p a g e n t w a sa d m i n i s t e r e dt oe a c hg r o u pt h r o u g hv e n ac a u d a l i s7d a y sa f t e ri n o c u l a t i o n a d - v e g f - s i r n a10 0 p 1w a sa d m i n i s t e r e dt og r o u pa e v e r yo t h e rd a y , 3t i m e saw e e k a n d9t i m e sw i t ht h et o t a la m o u n to f2 xl0 9p f u a d - e g f p1 0 0 1 dw a sa d m i n i s t e r e dt o g r o u pbe v e r yo t h e rd a y , 3t i m e saw e e ka n d9t i m e sw i t ht h et o t a la m o u n to f 2 10 9p f u p b sw a sa d m i n i s t e r e dt og r o u pca sac o n t r o lg r o u p ，a l s oe v e r yo t h e rd a y , 3t i m e sa w e e ka n d9t i m e st o t a l l y i tt o o k2 6d a y sf r o mt h ef i r s ti n o c u l a t i o n 5n u d em i c eo fe a c h g r o u pw e r ee x e c u t e da tt h e14 t ha n d2 6 t hd a yf r o mt h ef i r s ti n o c u l a t i o n b l o o d ，t u m o r a n dl u n gs a m p l e sw e r et a k e n r e a lt i m ep c rw a su s e dt om e a s u r et h ea m o u n to f v e g f - m r n ae x p r e s s e di nt u m o rt i s s u eo fa n i m a lm o d e l so fe a c hg r o u p e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) w a su s e dt om e a s u r et h ea m o u n to fv e g fi nt h e b l o o ds a m p l e so fn u d em i c e t u m o rt i s s u ew a st r e a t e d 丽mh e m a t o x y l i na n de o s i n s t a i nt oo b s e r v et h es i t u a t i o no fn e c r o s i s n e c r o s i sr a t e so fe a c hg r o u pw e r ec a l c u l a t e d b yl e i c aq w i ni m a g ea n a l y z i n gs y s t e m i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw a si m p l e m e n t e d t om e a s u r em i c r ov a s c u l a rd e n s i t y ( m v d ) o ft u m o rt i s s u ei ne a c hg r o u p i n v e s t i g a t e 1 1 1 e 、 a b s t r a c t t h ev o l u m eo ft u m o rt i s s u ei ne a c hg r o u pa n dt h er a t eo fp u l m o n a r ym e t a s t a s i s r e s u l t s ： 1 c p ew a sn o to b s e r v e di nh e l ac e l ll i n ea f t e r7d a y so fa d - v e g f s i r n ai n f e c t i o n c e l lc o u n t i n gw a sp e r f o r m e da te a c hi n t e r v a la n df o u n do u tt h a tn os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c ee x i s t e dw h e nc o m p a r e dw i mc o n t r o lg r o u pa n dt h eg r o w t hc u r v ew a sa l s o s i m i l a ri nt w og r o u p s 2 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a n d a r dr a t i n g ：9p o i n t sw a st h e l o w e s ti nt w oc o n t r o lg r o u p s 6p o i n t sw a st h eh i g h e s ti na d - v e g f - s i r n ag r o u p s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ee x i s t e d 3 t h ea v e r a g er qv a l u eo fv e g f m r n ai nt u m o r t i s s u eo fn u d em i c ei ne a c hg r o u pa t14 t ha n d2 6 t hd a yw e r e ：g r o u pa ，0 0 8 8 士0 0 2 4 ， 0 0 7 5 士0 0 2 6 ；g r o u pb ，0 17 9 士0 10 3 和0 16 7 士0 0 6 5 ；g r o u pc ，o 18 5 士0 0 8 5 ， 0 18 3 士0 12 8r e s p e c t i v e l y a v e r a g er qv a l u eo fg r o u pah a d s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew i t h o t h e rt w og r o u p s ( p 0 0 5 ) t h ea v e r a g ea m o u n to fv e g f ( p g m 1 ) i nb l o o ds a m p l e so fn u d em i c ei n e a c hg r o u pa t14 t ha n d2 6 t hd a y w e r e ：g r o u pa ，2 4 7 0 2 3 士10 5 6 3 ，19 3 7 4 9 士7 9 2 0 ；g r o u p b ，8 3 3 0 0 2 士2 9 0 9 1 ，8 5 9 6 3 8 士1 9 4 7 4 ；g r o u pc ，8 2 3 2 4 5 士9 2 8 6 ，8 3 1 9 8 7 士2 9 5 1 0 r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ee x i s t e db e t w e e na a n dg r o u pb ，c ( p o 0 5 ) t u m o rn e c r o s i sr a t eo fe a c h g r o u pw e r er e l a t i v e l yl o wa t 14 t hd a ya n dg r a d u a l l yi n c r e a s e da t2 6 t hd a y n o s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ee x i s t e di nt h r e eg r o u p s ( p 0 0 5 ) m v do fn u d em i c ei ne a c h g r o u pa t1 4 t ha n d2 6 t hd a yw e r e g r o u pa ，1 0 2 士1 6 ，9 8 士1 2 ；g r o u pb ，1 8 4 士i 8 ， 2 3 4 士1 4 ；g r o u pc ，1 9 8 士3 0 ，2 2 5 士1 3r e s p e c t i v e l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ee x i s t e d b e t w e e naa n dg r o u pb ，ci nt w oi n t e r v a l s ( p o 0 5 ) a v e r a g ev o l u m eo ft u m o r ( c m 3 ) i ne a c hg r o u pa t7 t h ，14 t h a n d2 6 t hd a yw e r e ：g r o u pa ，o 1 4 7 士0 1 4 3 ，0 4 9 2 士0 1 5 1 ，o 5 2 7 士0 1 8 6 ；g r o u pb ， 0 2 2 5 士0 1 0 2 ，0 5 0 4 士0 2 7 6 1 ，0 2 1 士0 7 6 9 ； g r o u p c ， o 1 8 5 士0 1 0 9 ， 0 51 4 士0 3 9 0 ，0 9 0 4 士0 4 8 4r e s p e c t i v e l y t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e n t w og r o u p sa t7 t ha n d14 t hd a y h o w e v e r , s i g n i f i c a n td i f f e r e n c ee x i s t e da t2 6 t hd a y b e t w e e ng r o u paa n dg r o u pb ，c ( p 0 0 5 ) t u m o ri n h i b i t i o nr a t ew a s5 2 3 ( 自r a t eo fp u l m o n a r ym e t a s t a s i s ( ) i n n u d e m i c eo fe a c hg r o u pa t1 4 t ha n d2 6 t hd a yw e r e ：g r o u pa ，0 ，2 0 ；g r o u pb ，2 0 ， i v 气 a b s t r a c t 4 0 ；g r o u pc ，0 ，4 0 r e s p e c t i v e l y r a t eo fp u l m o n a r ym e t a s t a s i s ( ) i nn u d e m i c e o f e a c hg r o u pa t1 4 t ha n d2 6 t hd a yf r o mp a t h o l o g i c a ls e c t i o n sw e r e ：g r o u pa ，o ，4 0 ； g r o u pb ，4 0 ，6 0 ；g r o u pc ，2 0 ，6 0 r e s p e c t i v e l y c o n c l u s i o n ：a d - v e g f - s i r n a c a l lt r a n s f e c tm g 6 3o s t e o s a r c o m ac e l la n di n h i b i tt h e e x p r e s s i o n o fv e g f a d m i n i s t r a t i o n t h r o u g h v e n ai n t oa n i m a lm o d e l sc a nc a u s ed e g r a d a t i o no f v e g f - m r n aa n dd o w nr e g u l a t et h e a m o u n to fv e g fi nb l o o ds a m p l e s i tm a ya l s o i n h i b i ta n g i o g e n e s i so ft u m o ra n dh a s t h e r a p e u t i ce f f e c to nt h ep r o g r e s s i o no f o s t e o s a r c o m aa n dp u l m o n a r ym e t a s t a s i s k e yw o r d s ：o s t e o s a r c o m a ，p u l m o n a r ym e t a s t a s i s ，a n g i o g e n e s i s ，a n t i - a n g i o g e n e s i s r n ai n t e r f e r e n c e v 目录 目录 引言1 第1 章a d v e g f s i r n a 的制备3 1 1 概述3 1 2 实验材料与方法3 1 3 实验结果9 1 4 实验结论o oo00 0000 1 0 第2 章a d v e g f s i r n a 抑制骨肉瘤细胞v e g f 表达的实验研究1 l 2 1 概述“1 1 2 2 实验材料与方法1 l 2 3 实验结果j oo os 1 5 2 4 实验结论o o oo oo 0ooo oo 1 6 第3 章a d v e g f s i r n a 抑制骨肉瘤生长及其肺转移的实验研究1 7 3 1 概j 苤1 7 3 2 实验材料与方法o oooo ooo oobo o ood oo o om o 1 7 3 3 实验结果2 8 3 4 实验结论o g go qo ooo iq ooo oa oo o o 3 4 第4 章讨论3 5 乜 第5 章全文总结4 3 q 致谢4 4 一 q 参考文献4 5 附录文献综述4 7 个人简历在读期间发表的学术论文与研究成果5 3 v l t 、 q 引言 己i 言 丁-fj 骨肉瘤( o s t e o s a r c o m a ) 是青少年最常见的高度恶性肿瘤之一。自上世纪8 0 年代 以来，随着对肿瘤有关基础和临床的研究不断深入，特别是新辅助化疗的应用， 使骨肉瘤患者的5 年生存率有了明显的提高。但在此以后的2 0 多年间，虽然不断 有新的科学技术应用于骨肉瘤的研究，如新辅助化疗方案的推出、肿瘤安全手术 边界的判断、肺转移的早期诊断与干预等，骨肉瘤患者的5 年生存率却并未进一 步提高。8 0 的患者早期即可发生亚临床转移，而肺转移又是骨肉瘤患者最主要 的死亡原因。因此，如何进一步有效的预防和控制骨肉瘤及其肺部转移仍然是目 前提高临床疗效的关键。 上世纪7 0 年代，f o l k m a n 博士在新英格兰医学杂志上首先提出肿瘤的生长依 赖于新生血管的生成。这一观点得到大多数学者的认同，开创了该研究领域的先 河。目前许多研究表明在肿瘤新生血管的发生中，许多方面的因素参与了这一过 程，具体包括肿瘤细胞、血管内皮细胞、周围基质、众多促血管生成因子以及抑 制新生血管形成因子、基因的改变等等。 肿瘤新生血管的生成具体包括：1 、现已存在的血管的膨胀，血管侵润的增加， 细胞外基质的降解；2 、内皮细胞的增殖与迁移；3 、内皮细胞聚集一血岛形成一 管腔形成；4 、内皮细胞的分化；5 、血管结构的修整、改建一形成功能性的血管 网一最终导致成熟血管的生成。其中肿瘤血管的生成以及抑制因子在这一过程中 起到了重要的作用。目前研究较多、作用较为肯定的促血管生成因子主要是血管 内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , v e g f ) 。 v e g f 是目前已知最有效的、直接作用于内皮细胞的血管生成素蛋白，是一 种可扩散的内皮细胞特异性有丝分裂素和血管生长因子。其在包括骨肉瘤在内的 绝大多数恶性肿瘤中都有高表达，以旁分泌和自分泌方式，促进血管内皮细胞的 分裂、增殖，诱导新生血管的形成；并直接作用于肿瘤细胞，刺激肿瘤细胞的生 长。 v e g f 及其家族成员能特异性促进内皮细胞的分裂、增殖和迁移，在新生血 管的形成过程中起到关键的作用。如何阻断血管内皮生长因子的表达及其信号转 导，进而早期抑制肿瘤血管的生成，已成为肿瘤抗血管生成治疗的热点，因此也 k 引言 成为抗肿瘤血管生成基因治疗的良好靶点。国内外许多学者采用反义技术、导入 癌基因、阻断血管内皮生长因子受体位点等基因治疗方法或使血管内皮生长因子 表达减少，或阻断信号转导通路，或耗竭肿瘤细胞产生的血管内皮生长因子，从 而达到抑制肿瘤的目的。 r n a 干扰( r n a i n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 是近年来基因治疗与研究领域的热点，其原 理是将外源性的小的双链r n a ( d o u b l e s t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 分子通过一定的方法 转入细胞内，形成酶切复合体，并与其互补的目的m r n a 结合，使之降解，从而 无法合成相应的蛋白质，在m r n a 水平特异地下调该基因的表达，这就是所谓的 序列特异性的转录后基因沉默( p o s t - t r a n s c d p t i o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 。近年来的 研究发现，干扰性小r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a 或s h o r ti m e r f e r i n gr n a s ，s i r n a ) 是r n a 干扰赖以发生的重要的中间效应分子。r n a 干扰主要通过双链 r n a ( d o u b l e s t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 被核酸酶切成2 1 2 5 m 的干扰性小r n a ( s m a l l i n t e r f e r i n gr n a 或s h o r ti n t e r f e r i n gr n a s ，s i r n a ) ，由干扰性小r n a ( s m a l l i n t e r f e r i n gr n a 或s h o r ti n t e r f e r i n gr n a s ，s i r n a ) 介导识别并靶向切割同源性靶 m r n a 分子而产生效应。z h a n g 等在最近的研究中，将针对鼠v e g f 的r n a 干 扰序列插入到r n a 聚合酶启动子的下游并转染到小鼠体内，成功地将小鼠体内 v e g f 基因的表达封闭，并预言r n a 干扰是一种抑制肿瘤血管生成的有效手段。 那么能否利用r n a 干扰技术，通过抑制骨肉瘤细胞中v e g f 的表达，抑制肿 瘤新生血管的生成，进而抑制骨肉瘤的生长及其远处肺转移呢? 第1 章a d v e g f s i r n a 的制备 第1 章 a d - v e g f - sir n a 的制备 1 1 概述 本室于2 0 0 4 年成功构建携带人v e g f - s i r n a 的腺病毒载体a d v e g f - s i r n a ( 国家自然科学基金资助项目，项目编号：3 0 2 7 1 3 1 4 ) ，。现将其在2 9 3 细 胞内进一步扩增，通过氯化铯密度梯度离心法纯化和5 0 组织培养感染剂量法 ( t c i d 5 0 ) 进行滴度测定，并通过感染h e l a 细胞对其安全性进行评价以备下 一步实验用。 1 2 材料与方法： 1 2 1 主要实验材料 a d v e g f s i r na 2 9 3 细胞 h e l a 细胞 1 2 2 主要试剂与仪器 d m e m 培养液 r p m i 1 6 4 0 培养液 胰酶一e d t a 混合液 小牛血清、胎牛血清 本室构建 上海东方肝胆病毒研究所 中科院上海分院细胞生物研究所 杭州吉诺公司 二氧化碳培养箱( f o r m as c i e n t i f i e ) l r h 1 5 0 b 生化培养箱 电热恒温水浴槽 l e i c a 倒置相差显微镜 光学显微镜 t g l 1 6 c 离心机 微量加样器 1 2 孔排枪、枪头、e p p e n d o r f 管 美国g i b c o 公司 ( 原装美国g i b c o 公司) 杭州吉诺公司 北京鼎国生物技术公司 美国f o r m as c i e n t i f i c i n e 广东医疗器械厂 上海医疗器械七厂 德国l e i c a 公司 日本o l y m p u s 公司 上海安亭科学仪器厂 德国g i l s o n 公司 美国a x y g e n 公司 第1 章a d v e g f s i r n a 的制备 超低温冰箱( f o r m as c i e n t i f i c ) a f l0 制冰机 s o r v a l lr c 2 8 s 低温高速离心机 m i l l i ql a b c o n c o 纯水仪 医用超净工作台 1 2 3 实验步骤与方法 美国f o r m as c i e n t i f i c i n c 美国s c o t s m a n 公司 美国杜邦公司 美国m i l l i p o r e 公司 苏州吴江市净化设备总厂 1 2 3 12 9 3 细胞、h eia 细胞的培养 1 常规培养 在含1 0 f c s 培养基中( 2 9 3 细胞用d m e m 培养液，h e l a 细胞用 r p m l l 6 4 0 培养液) ，3 7 。c 、5 c 0 2 条件下培养。传代：取对数生长期细胞， 0 2 5 的胰酶消化制成细胞悬液，按一定比例移入新培养瓶中培养。 2 冻存 对数生长期细胞，0 2 5 的胰酶消化制成细胞悬液，离心，弃上清，加入 l m l 冻存液，吹打均匀制成细胞悬液，细胞浓度为1 0 6 - - 1 0 7 m l 。转移至冻存管， 4 cl h ，一2 0 2 h ，- - 8 0 c 4 h ，而后置液氮中保存。 3 复苏 将冻存的一管2 9 3 细胞迅速置于3 7 ( 2 水浴轻轻晃动融化 i 融化后在超净台无菌条件下用7 0 乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净 l 加入5 m l1 0 f c s d m e m ，1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清 1 将细胞用10 m l10 f c s d m e m 重悬，轻轻吹打均匀 i 转入7 5 c m 2 培养瓶中，5 c 0 2 孵箱3 7 2 培养 4 移去2 9 3 细胞培养液，小心加入病毒混合液，十字形慢慢晃动3 次 l 3 7 c5 c 0 2 孵箱培养1 2 0 m i n ，加入9 m l1 0 f c s d m e m l 再培养7 2 h ，收集细胞，6 0 0 x g 离心5 m i n i 病毒保存液重悬细胞，2 0 至3 7 冻融3 次 l 台式离心机上以2 0 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n 去除细胞碎片，收集上清 l 反复扩增至需要病毒量 1 2 3 3a d v e g f _ s i r n a 的纯化( 氯化铯密度梯度离心法) 预冷离心机转头至4 l i 第l 章a d - v e g f s i r n a 的制备 5 0 m l 离心管1 2 0 0 0 9 ，1 0 r a i n ，取上清，弃沉淀 每l m l 上清加入l m l2 0 聚乙二醇( p e g 8 0 0 0 ) 2 5 mn a c i ，混匀 l 冰浴1 h i 4 。c ，1 2 5 0 0 9 ，3 0 m i n i 弃上清，沉淀充分重悬于5 m lc s c i1 1g r r d 4 c ，8 0 0 0 9 ，5 m i n ，取上清 在超速离心管中缓慢加入2 m lc s c l1 4g m l 非常小心轻轻顺管壁加入另一层3 m lc s c l1 3g m l 沿管壁小心加满病毒颗粒，约5 m l 上清1 1 9 m l 平衡离心管，4 c ，6 0 0 0 0 9 离心2 h 取出离心管，固定于离心管架上 用5 m l 注射器，1 8 g 针头，在病毒层的最低点刺破管壁 在c s c l1 3g r r d 和c s c i1 4g m l 交界处吸出病毒颗粒层 病毒层溶液转移到一个无菌的容器 4 。c ，透析过夜( 以0 0 1 mt r i s h c lp h 8 1 换液三次反复透析除去c s c l ) 6 准备2 0 m l1 0 5 m l 细胞。 3 滴度测定 收集一瓶2 9 3 细胞，计数 i 用5 f c s d m e m 准备2 0 m ll 1 0 5 m l 细胞 用1 2 道排枪在2 块9 6 孔板中每孔加入1 0 0l al 细胞悬液 准备稀释病毒液 反复稀释至最高稀释度( 系列稀释度为1 0 d - 1 0 。1 0 ) 最后8 个稀释液( 1 0 。 - - - 1 0 。1 0 ) 加入9 6 孔板，每孔o 1 m l 每个稀释度1 0 孔，余下2 孔为阴性对照监测细胞存活情况 7 第l 章a d - v e g f s i r n a 的制备 i 3 7 。c 5 c 0 2 培养( 于第5