（有机化学专业论文）壳低聚糖接枝共聚物的制备、表征及其应用.pdf

硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 中文摘要 壳聚糖及聚乳酸都是生物相容性好 生物可降解性能优异的生物医用材料 但 是两者均有各自的局限性 由于含氨基生物多糖的引入 可增强聚乳酸对蛋白质 多肽 基因 细胞的亲和性 因此 此类共聚物可兼具有天然高分子和合成高分子 的优点 有望在药物控制释放 基因载体 组织工程等生物医用方面得到应用 因 此 利用壳聚糖接枝可降解合成高分子的研究已引起人们的重视 本文概述了国内外壳聚糖改性及应用方面的研究进展 以壳低聚糖和丙交酯制 备了壳低聚糖接枝共聚物 运用高效液相色谱 h p l c 傅立叶红外光谱 f t i r 热重分析 t g a 差热分析 d t a 核磁共振光谱 1 h n m r 元素分析等现代 分析手段表征接枝共聚物的化学结构 使用蛋白质药物模型 牛血清蛋白 研究 了聚乳酸 壳低聚糖载药微球的体外释药性能 主要研究内容及结论如下 1 采用a 淀粉酶催化水解壳聚糖制备水溶性壳低聚糖 h p l c f t i r t g a 和d t a 分析表明 降解后的产物分子量降低 但糖残基的化学结构未变化 2 以d l 一乳酸为原料 在催化剂锌粉存在下通过脱水环化合成d l 一丙交酯 单体 显微熔点测定仪测定晶体熔点为1 2 6 其f t i r 谱图与文献报道一致 3 采用溶液聚合法 以壳低聚糖与丙交酯单体反应 d m s o 为反应溶剂 异辛 酸亚锡为催化剂 制备了壳低聚糖一聚丙交酯接枝共聚物 通过f t i r 1 h n m r 和 t g 等分析表明 壳低聚糖上接枝了聚丙交酯侧链 且随着丙交酯用量的增加 接 枝共聚物的亲脂性增强 通过激光粒度分析仪表明 接枝共聚物在水溶液中有一定 的胶束化行为 其平均粒径为2 9 9n n 4 采用复合乳液 溶剂挥发法 以壳低聚糖为复乳剂 制备了聚乳酸一壳低聚糖 载药微球 研究了其体外释药性能 结果表明 当p l a 质量分数为5 投药比 为0 2 1 壳低聚糖质量分数为o 5 所得微球平均粒径在31 6a m 在最佳工艺条 件下 微球对b s a 的包封率为8 5 7 负载率为1 2 11 体外释药研究显示 载 药微球在o 5h 内释放近3 5 释放5 0 药物的时间约为2 4h 且缓释曲线符合 h i g u c h i 方程 5 利用壳聚糖为氨基供体 与提供醛基的乳糖之间发生美拉德反应 研究其发 生美拉德反应的条件 利用核黄素 蛋氨酸一氯化硝基四氮唑蓝体系产生的0 2 来 研究美拉德反应产物清除0 2 的活性 结果表明 其发生美拉德反应的最佳条件 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 为 乳糖与壳聚糖摩尔比为l 1 5 溶液p h 值为5 6 反应温度为8 0 时 发 生美拉德反应的速度最快 m r p s 对氧自由基具有较好的清除活性 且随着样品质 量浓度的增加 其对0 2 的清除率逐渐提高 关键词 壳低聚糖 丙交酯 接枝共聚 聚乳酸 微球 控制释放 抗氧化性 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t c h i t o s a n c s a n dp o l y l a c t i d ep l a w e r ek n o w na sb i o c o m p a t i b l ea n d b i o d e g r a d a b l eb i o m e d i c a lm a t e r i a l s h o w e v e r t h ee x t e n d e da p p l i c a t i o no fc h i t o s a na n d p o l y l a c t i d ea r ef r e q u e n t l yr e s t r i c t e db yt h e i rl i m i t a t i o n s t h ea f f i n i t yt op r o t e i n s p e p t i d e s g e n e sa n d c e l l so fp l ac a l lb ee n h a n c e db y i n t r o d u c i n gt h ea m i n o c o n t a i n i n g p o l y s a c c h a r i d e s s ot h e 酽mc o p o l y m e r sc o m b i n e dt h ev i r t u e so fn a t u r a la n ds y n t h e t i c p o l y m e r s a n da r ee x p e c t e dt oh a v eb e r e ra p p l i c a t i o n si nb i o m e d i c a la n dp h a r m a c e u t i c a l f i e l d sl i k ed r u gc o n t r o l l e d r e l e a s e g e n o n i cv e c t o r t i s s u ee n g i n e e r i n g a n d s oo n t h e r e f o r e c h i t o s a ng r a f t e db i o d e g r a d a b l es y n t h e t i cp o l y m e rh a sa t t r a c t e dp e o p l e s a t t e n t i o n t h ed e v e l o p m e n t so fs y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no fc h i t o s a nd e r i v a t i v e sw e r e r e v i e w e d t h eg r a f tc o p o l y m e rw a ss y n t h e s i s e d b yc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e l c s a n d l a c t i d e t h em o d e m a n a l y s i sm e t h o d sw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z e dt h ec h e m i c a ls t r u c t u r e s o ft h ep r o d u c t s i n c l u d i n gh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g h a p h y h p l c f o u r i e r t r a n s f o r mi n f r a r e d f t 1 r t h e r m o g r a v i m e t r i ca n a l y s i s t g a d i f f e r e n t i a lt h e r m a l a n a l y s i s d t a n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c ef n m r a n de l e m e n t a r ya n a l y s i s t h e r e l e a s i n gb e h a v i o r si nv i t r oo fp l a l c sd m g l o a d i n gm i c r o s p h e r e sh a v eb e e ns t u d i e d b yu s i n gt h ep r o t e i nm o d e ld l g s 一b o v i n es e r u ma l b u m i n b s a t h ef o l l o w i n ga r et h em a i nc o n t e n t sa n dc p n c l u s i o n s 1 c h i t o s a nw a sh y d r o l y z e dt og i v ec h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sb ya l p h a a m y l a s e h p l c f t i ra n dt ga n a l y s i ss h o w st h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to fd e g r a d a t i o np r o d u c t s d e c r e a s e s t h e r m o s t a b i l i t yw a sl o w e r b u tt h es t r u c t u r eo fc h i t o s a nw a sn o tc h a n g e d 2 d l l a c t i d ew a sp r e p a r e db yd l l a c t i ca c i d 诵t 1 1z i n cd u s ta sac a t a l y s t t h e m e l t i n gp o i n to ft h ec r y s t a lw a s12 6 b ym e l t i n gp o i n td e t e r m i n a t i o na p p a r a t u s t h e s t r u c t u r eo ft h ee x p e c t e dl a c t i d ew a sp r o v e db yf t i r 3 ag r a f tc o p o l y m e ro fc h i t o o l i g o s a c c h a r i d e sa n dl a c t i d e l c s l a w a sp r e p a r e d b ys o l u t i o np o l y m e r i z a t i o nu s i n gd i m e t h y ls u l p h o x i d ea ss o l v e n t s t a n n o u si s oc a p r y l a t e a sc a t a l y s t t h ed e t a i l e dm o l e c u l a rs t r u c t u r eo fl c s l aw a sc h a r a c t e r i z e db yf t i r n m kd s c a n ds oo n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h el i p o t r o p yo fg r a f tc o p o l y m e rw a s s t r o n g e ra st h ea m o u n to fl a c t i d ei n c r e a s e d t h ep a r t i c l es i z eo fc o p o l y m e r si na q u e o u s s o l u t i o nw a sm e a s u r e db yl a s e rp a r t i c l es i z ea n a l y z e r l p s a a n dt h e i ra v e r a g e d i a m e t e r sw a sa b o u t2 9 9n l n 4 p o l y d l l a c t i d e p l a a n d c h i t o o l i g o s a c c h a f i d e w e r ec h o s e nt o m i c r o e n c a p s u l a t eb o v i n es e r u ma l b u m i n b s a b ye m u l s i f i c a t i o n s o l v e n te v a p o r a t i o n i i i 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s m e t h o d t h er e s u l t so fc h a r a c t e r i z i n gb s a l o a d e dn a n o p a r t i c l e s n p s p r e p a r e d a c c o r d i n gt ot h eo p t i m i z e df o r m u l a t i o ns h o w e dt h a tt h em e a ns i z eo fn p sw a s316n m e n c a p s u l a t i o ne f f i c i e n c y r e a c h e d 8 5 7 a n db s a l o a d i n g l e v e lw a s 1 2 1 1 r e s p e c t i v e l y t h ed e t e r m i n a t i o no fi t sr e l e a s er a t ei nv i t r or e v e a l e di tw a si ns u s t a i n e d r e l e a s ee x c e p ta na b r u p tr e l e a s ei nt h ei n i t i a l3 0 m i n u t e s r e l e a s ec u r v ec o n f o r mt ot h e h i g u c h ie q u a t i o n 5 c h i t o s a nw i t hf r e ea m i n og r o u p sr e a c t sw i t hl a c t o s et of o r mm a i l l a r dp r o d u c t s 触lp h s t e m p e r t u r e st i m e sa n dr e a c t a n t s m o l a rr a t i o sa f f e c t i n gt h er e a c t i o nc o n t e n ta n d r a t ew e r et e s t e d r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fm a i l l a r dr e a c t i o np r o d u c t s m r p s w a se v a l u a t e d l i ms c a v e n g i n ga b i l i t i e sa g a i n s ts u p e r o x i d ea n i o nw h i c hw a s c r e a t e db yt h es y s t e mo fr i b o f l a v i n m e t h i o n i n e n b t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e a c t i o n r a t ew a sf a s t e s tw h e nt h er e a c t a n t s m o l a rr a t i o 1 a c t o s e c h i t o s a n w a s1 1 5 t h ep h v a l u e sw a s5 6a n dt h er e a c t i o nt e m p e r t u r ew a s8 0 t h em r p ss h o w e dg o o da b i l i t y f o rs c a v e n g i n gt h es u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l a n dt h ea b i l i t yw a si n c r e a s e da st h ea m o u n t o ft h e r p si n c r e a s e d k e y w o r d s c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e l a c t i d e g r a f tc o p o l y m e r i z a t i o n p o l y l a c t i ca c i d m i c r o s p h e r e s c o n t r o l l e dr e l e a s e a n t i o x i d a n ta c t i v i t y i v 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 独立进行研究工作 所取得的研究成果 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果 对本文的研究傲出贡献的个人和集体 均已在 文中以明确方式标明 本声明的法律结果由本人承担 作者签名 鹌基域 晾1 年占月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权华中师 范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 同意华中师范大学可以用不同方式在不同媒 体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 作者签名 彭虐磁 日期 1 年 月 日 导师签名 字移芗 日期 参乡年厂月弦日 本人已经认真阅读 c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程 同意将本人的 学位论文提交 c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布 并可按 章程 中的 规定享受帮关权益 圃意途塞埕交厦澄盾i 旦坐生 旦二生i 旦三生发查 作者签名 彭惠砍 帆1 年 月厂日 导师签名 字彩季 呐一少 胁日 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第一章绪论 甲壳素是自然界中含量第二的天然高分子多糖 仅次于纤维素 也是除蛋白质 外数量大的含氮天然有机化合物 甲壳素广泛存在于节肢动物 环节动物及真菌和 藻类的细胞壁中 是由2 乙酰氨基 2 脱氧一d 吡喃葡萄糖通过d l 4 糖苷键连接而 形成的二元线形化合物l i j 壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基后得到的一种天然碱性多糖 该多糖具有良好的生物相容性 生物可降解性以及防腐 抗菌 促进伤口愈合和止 血等生物活性 2 1 从而被广泛地应用于食品 3 医药 4 化妆品 5 1 功能材料 6 1 等领 域 图1 1 为甲壳素和壳聚糖的结构示意图 l l l l t 0 8 n 图1 1 甲壳素和壳聚糖的结构 由于壳聚糖存在力学性能及水溶性差等缺点 因此在一定程度上限制了其应 用 而由于壳聚糖上游离氨基的存在 因而可在溶剂中对其进行多种化学改性 从 而改善其生物活性 水溶性及力学性能 拓宽壳聚糖在上述各种领域的应用 1 1 壳聚糖的化学改性 1 1 1 降解反应 在一定的条件下可将壳聚糖进行降解 已有大量文献报道 降解后的壳低聚糖 可以抑制癌细胞的生长 促进脾脏内抗体的生成 7 引 增强巨噬细胞的功能 9 1 能活 化增殖人体肠道内的双歧杆菌u o l 吸附胆固醇 降低血脂 血压 i l 1 2 1 在酸性环境 条件下具有较强的抗菌抑菌功能 1 3 等 目前 有关壳聚糖降解的方法主要包括三种 酶降解法 悼1 6 甲壳素酶 壳聚糖酶以及非专一性糖酶等 化学降解法 1 7 1 h 2 0 2 浓h c i 以及k m n 0 4 等 物理降解法 高能射线 超声波等 其中由于酶降解 法条件温和而被广泛应用于壳聚糖的降解 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 2 酰化反应 壳聚糖分子链的糖残基上既有羟基 又有氨基 能与多种有机酸的衍生物如酸 酐 酰卤 主要是酰氯 等发生酰化反应 从而导入不同分子量的脂肪族或芳香族 酰基 是壳聚糖的化学改性中研究较多的一种 壳聚糖残基有氨基 由于氨基的反应活性大于c 6 o h 因此 酰化反应可以在 氨基上发生弘酰化反应 生成酰胺 壳聚糖分子链上除了氨基还有羟基 其中羟基又分为两种 一种是c 6 o h 为 一级羟基 该羟基从空间构象上来说 位阻较小 可以较为自由的旋转 另一种是 c 3 一o h 为二级羟基 该羟基空间位阻较大 且不能自由旋转 因此 般情况下 c 6 o h 的反应活性要大于c 3 o h 酰化反应优先在哪个官能团上发生 与酰化试剂的结构 反应溶剂的种类 催 化剂及反应温度等多种因素有关 因此 酰化反应往往得到的不是单一的酰化产物 即发生 酰化时又发生d 酰化 发生c 6 o h 酰化的同时也发生c 3 o h 酰化 为得到o 酰化的产物 则应先将壳聚糖分子链上的氨基保护起来 再在温和条 件下进行酰化反应 酰化结束后再脱掉保护基 从而得到目标产物 如采用壳聚糖 与醛反应生成希夫碱的方法 可控制酰化反应只在羟基上进行 图1 2 然后再脱 掉保护基 f l 函 三 函l 竺 n h 2l tn c h r 厶 i 露n c h r 詈 露 一 图1 2 壳聚糖与醛反应 通过选择适当的溶剂 也可使壳聚糖的氨基或羟基进行选择性的酰化反应 近 年来 有文献报道了在甲磺酸溶剂体系中使壳聚糖口酰化的一步合成方法 18 1 们 该法是以甲磺酸作为质子化试剂进行区域选择性反应 因此不需对壳聚糖氨基进行 预先保护 使反应步骤简化 1 9 3 0 年 k a r r e r 等 2 0 1 报道了羧酸酐与壳聚糖在高温下能发生很猛烈的反应 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 并生成 酰化衍生物 h i r a n o 等 2 l 报道了有关 酰化衍生物的制法 将1 0 0m g 壳聚糖溶于溶剂中 然后加入过量的酸酐 室温下放置1 2h 出现均匀相的黏性溶液 或者形成凝胶后 则反应完毕 其产率为5 0 7 8 而对于高级脂肪酸 c 1 0 1 8 e 而言 在溶剂中要 外加1m l 吡啶 并用水浴加热几分钟 反应结束后 把反应后的混合物倾入1 0 0m l 丙酮中 室温搅拌几小时 即生成了相应的 酰化壳聚糖 m o o r e 等 2 2 也指出 壳聚糖的 酰化反应与反应溶剂的溶解度参数 6 有关 一般地 当选择的溶剂或溶剂体系 其6 值在1 3 0 1 5 5 之间时才能获得n 酰化率 较高的产物 近年来 有关 邻苯二甲酰化壳聚糖的选择性反应也受到了关注 如将壳聚 糖悬浮于d m f 中 加热至1 2 0 1 3 0 加入过量的邻苯二甲酸酐使其反应 所得 的邻苯二甲酰化产物可溶于d m s o 中 图1 3 同时该反应中也发生部分d 邻苯二甲酰化 由于邻苯二甲酰胺对碱较敏感 因此在甲醇和钠的作用下 可发生 酯交换反应 使口酰基离去 只生成 邻苯二甲酰化壳聚糖 2 3 1 o 0 图1 3 壳聚糖与邻苯二甲酸酐反应 1 1 3 烷基化 壳聚糖的氨基是伯氨基 且有一对孤对电子 具有很强的亲核性 因此壳聚糖 与卤代烃反应时 首先发生的是 烷基化 这个反应也是氨基的一类重要的反应 d 一烷基化壳聚糖衍生物 其合成方法通常有3 种 1 席夫碱法 先将壳聚糖 与醛反应生成席夫碱 使氨基被保护 然后与卤代烃进行烷基化反应 再在醇酸溶 液中脱去保护基 则得到只在d 位取代的衍生物1 2 4 2 金属模板合成法 首先用 过渡金属离子与壳聚糖进行络合反应 使 n h 2 和c 3 一o h 被保护 再用卤代烷进行 反应 然后用稀酸处理 即得到仅在c 6 位上发生取代的d 位衍生物i lj 3 邻 苯二甲酰化法 先用邻苯二甲酸酐于壳聚糖反应 生成 邻苯二甲酰化壳聚糖 再 与卤代烃发生烷基化 然后用肼脱去保护基 v 二邻苯二甲酰基因l 由于自由氨基 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的存在 因此 该类壳聚糖衍生物在环境治理方面将有着较为广泛的用途 烷基化壳聚糖衍生物的合成 通常是由醛与壳聚糖分子中的 n h 2 反应形成 希夫碱 然后用n a b h 3 c n 或n a b i h 还原得到 图1 4 研究表明 用该法引 入的甲基 乙基 丙基和芳香化合物而生成的壳聚糖衍生物 对各种金属离子有很 强的吸附或螯合能力 2 5 2 6 1 董炎明等人采用苯甲醛和壳聚糖反应 再经硼氢化钠还 原得到苄基壳聚糖 发现其具有溶致液晶行为l z 7 j 并提出壳聚糖经羟基苄基化后还 可形成热致液晶 因此壳聚糖有可能在液晶材料方面得到进一步的应用 f j j 奄十马 p 舒十马 h p 譬十一 p j 舒c h 2 0 hf 4 一 p 龟 n 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 肾卜 一卜 s 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 肽等发生接枝反应 其反应机理主要是自由基反应 如c e 4 过硫酸钾 三丁基硼 烷等氧化还原引发接枝 偶氮二异丁腈 a i b n y 射线的自由基引发接枝 汪艺等 3 9 以过硫酸钾为引发剂 研究了m m a 与壳聚糖在非均相条件下的接 枝共聚反应 研究表明 壳聚糖的氨基参与了自由基的引发过程 且接枝产物的接 枝率随壳聚糖脱乙酰度的升高而增加 魏德卿等 4 0 采用十二烷基苯磺酸钠为乳化 剂 过硫酸钾和亚硫酸钠为引发剂 研究了丙烯酸丁酯与壳聚糖在醋酸溶液中的反 应 其过程为 过硫酸钾与亚硫酸钠在酸性介质中反应先生成亚硫酸氢根自由基 然后再与壳聚糖作用形成壳聚糖自由基 再由产生的壳聚糖自由基引发丙烯酸丁酯 接枝共聚 因柔顺侧链的引入 壳聚糖的断裂伸长率和耐水性得到了明显提高 近年来 有关壳聚糖的离子接枝共聚以及官能团的偶联接枝共聚的报道也逐渐 增多 k u r i t a 等 4 1 1 研究了苯乙烯与碘代甲壳素的阳离子接枝共聚反应 该反应是以 硝基苯为反应介质 四氯化锡为催化剂 在n 2 气氛中进行 用甲醇终止反应后 再用氯仿 醚的混合溶剂除去均聚物 干燥后即可获得接枝产物 王鹏等 4 2 j 将甲氧基 聚乙二醇的碳端基改性为醛基后 再通过醛基与壳聚糖上的氨基发生希夫碱反应 从而将聚乙二醇接枝到壳聚糖的吡喃环上 所得接枝产物具有良好的生物相容性 1 1 8 共混改性 通过共混改性可以很容易的将两种或多种聚合物的优点都充分发挥出来 有效 地扩大了高分子材料的使用范围 是高分子改性常用的方法 在共混改性中 若组 分问相容性好 则可以形成热力学稳定的体系 相容性不好 组分间则会发生分离 而加入适量的交联剂 组分间就会有一定程度的交联 从而避免了这一缺点 也可 以通过氢键作用 使共混物有一定的交联 s a k u r a i 等 4 3 研究表明 聚 乙烯基 2 吡咯烷酮与壳聚糖能形成良好的共混膜 壳聚糖虽然有许多突出的优点 如无毒 生物相容性 生物可降解性 对药物 的损伤小等 但也有机械性能差 溶解性差 对p h 依赖性大等缺点 由于p v a 溶 于水 因此壳聚糖与p v a 共混 能明显地改善壳聚糖的溶解性差等缺点 通过对 共混膜的研究发现 壳聚糖较p v a 更易于在空气一侧的表面富集 且该共混膜对 成纤细胞的粘附及生长较单独的p v a 膜更有利 4 6 1 1 1 9 交联 壳聚糖可与双官能团的醛或羧酐等进行交联 交联的主要目的就是使产物不溶 解 溶胀都很小 性质也很稳定 这是它们被用作固定化酶载体或色谱分离载体的 一个重要原因 交联主要是在分子间发生 一般足壳聚糖的氨基与醛基生成席夫碱 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 结构 其次才是羟基与醛基的反应 常用的交联剂有戊二醛 乙二醛 甲醛等 这 个反应既可在水溶液中发生 也可在非均相介质中进行 而且在很宽的p h 范围内 也可反应 近年来 还报道了同时带入活性基团的交联方法 如 将壳聚糖粉末在 稀碱溶液中用环氧氯丙烷进行交联 4 7 4 8 用环硫氯丙烷为交联剂阳 5 0 1 制得的产物 中的两个交联键之问有一个巯基 曲荣君和刘庆俭 5 i 用含有双环氧基的聚7 醇 4 0 0 p e g 一4 0 0 双缩水甘油醚为交联剂对壳聚糖进行交联 得到了两个交联键之间 具有很长脂肪链的交联产物 汪玉庭等1 35 j 用含有活泼基团的冠醚交联壳聚糖 交联 产物兼有壳聚糖和冠醚的双重结构与功能 具有广泛的应用前景 1 1 1 0 树型衍生物 壳聚糖树形衍生物是近年来发展起来的一类高分子化合物 其一般是在壳聚糖 的氨基上接枝功能基团而形成 如果接枝基团是糖 肽类 脂类或者药物分子 则 所得的树型衍生物具有壳聚糖的无毒 生物相容性和生物降解性 以及功能分子的 药物作用 因此在药物化学方面将会有广泛的应用前景 从其结构来看 这类化合 物可形象地形容为壳聚糖是这种分子的树干和主枝 而接枝基团就是树形材料的花 和叶子 s a s h i w a 等 5 2 1 人合成了一种树型分子 且在主客体化学和催化方面显示出 了良好的应用前景 1 2 壳聚糖及其衍生物的应用 1 2 1 在医学上的应用 1 在治疗癌症中的作用 人体内的l a k 细胞和n k 细胞均具有杀灭癌细胞的作用 其中在p h 7 3 5 的环境中活力最强 在酸性环境下受到抑制 壳聚糖属于弱碱性物质 能提高b 淋 巴细胞和t 淋巴细胞的活力 并增加免疫活性细胞的数量和质量 从而发挥其抗 癌的作用 s u z u k i 等发现六聚体的 g l c b 0 6 和 g l c n a c 6 经静脉注射后 对小鼠 的s 1 8 0 和m m 4 6 肿瘤有很强的抑制作用 5 3 1 但对瘤细胞并没有直接的杀伤作 用 六聚体的壳寡糖对m e t h a 癌细胞也有较明显的抑制作用1 5 训 但低于六个残基 的壳寡糖却无抑制m e t h a 肿瘤的作用 研究发现 该抗肿瘤机制可能是通过先增 加淋巴因子 然后由溶细胞的t 细胞的增生来产生抗肿瘤作用 但长期口服甲壳 素对s 1 8 0 肿瘤却无抑制作用 t s u k a d a 等也报道了六糖对小鼠的路易斯肺癌有抗 转移作用 5 引 s u z u k i 等人通过分析患癌鼠的脾细胞变化 证实了壳低聚糖的抑癌机 理是由低聚糖的免疫促进作用所引起的 即通过加速t 细胞的分化来增加细胞毒 7 硕士学位论文 m a s t e r st t l e s i s 素t 细胞的活性 并伴随抑制性t 细胞的减少 国内外有关水溶性壳低聚糖的抑 癌作用均有报道 认为水溶性壳低聚糖能显著增加n k 细胞的活性 并能诱导脾 脏细胞的生成 5 引 2 用于伤口愈合材料 壳聚糖及其衍生物是一类具有广阔应用前景的伤口愈合材料 这主要是由于它 们能促进伤口的愈合 具有独特的杀菌性 可降解性以及能为细胞的生长提供一定 的养分等 u e n o 等用脱乙酰度为8 2 分子量为3 万一8 力 的纤维状壳聚糖处理小犬的伤 口 并用组织学和免疫组织学来评价伤口的愈合情况 结果表明 用壳聚糖处理的 伤v i 与对照组相比较 壳聚糖对伤口愈合早期的两个阶段均有很好的促进作用 5 9 1 主要表现为壳聚糖能除去发炎的细胞 加速清净伤口以及成纤细胞的迁移和增值 3 在药物释放体系中的应用 随着药物制剂向 三效 和 三小 发展 壳聚糖成为药物载体的研究也逐渐 成为一个热点 如用壳聚糖与药物制成的颗粒剂 改善了口服制剂在胃肠道 尤其 在胃内的滞留时间 从而提高药物的生物利用率1 6 0 1 此外 壳聚糖还具有易成膜 能经受高温 机械强度较高 对水 尿素等小分子也有较好的渗透性 能保护皮肤 伤口及促进皮肤的再生等优点 使其成为一种很好的体外给药载体 h i r a n o 等 6 l 指出 相对分子质量小于2 9 0 0 的化合物就能透过壳聚糖膜 壳聚糖除能成膜之外还能制成凝胶 使其包埋的药物通过蚀解式的缓释 如 m i y a z a k i 等f 6 2 以消炎痛为模型药物制得了壳聚糖缓释凝胶 其在p h 7 4 的磷酸缓 冲溶液中的溶解情况 与粉剂溶解很快的情况形成了鲜明的对照 可见壳聚糖凝胶 能明显地延缓药物的释放 微胶囊是一类具有一定通透性的球状小囊泡 其主要特征就是通透性 舒晓正 和朱康杰 6 3 采用乳化法制得了注射用的壳聚糖 海藻酸钠多肽药物微囊 其平均粒 径为1 2 0l x m 此外 壳聚糖微胶囊的通透性受p h 的显著影响 根据这一特性 其在生物活性物质和化学药物的控制释放方面将非常有用即j 壳聚糖的弱酸水溶液带正电荷 且具有高粘性 因而可与带负电荷的高聚物 如 d n a 抗原以及大多数蛋白质药物相互作用 这种方法条件温和 工艺简单 已广泛应用于药物载体和医用辅助材料f 6 5 7 0 1 徐淑芳等 7 l 在中性和室温条件下 采用离子交联的方法 用季铵化壳聚糖与三 聚磷酸钠制备了一种新型纳米粒子 研究了其对b s a 模型药物的载药情况及体外 释药性 结果表明 该纳米粒子对b s a 的包封率达9 0 且具有良好的缓释性能 8 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 2 在农业上的应用 壳聚糖能提高植物体的免疫力 诱导植物体产生酶系 提高其抗倒伏能力等 使其生长旺盛 从而提高农作物的质量和产量 7 2 j 通过拌种 浸种 包衣等方法处 理种子 激发种子提前发芽 促进作物生长 提高抗病能力 从而提高产量 可增 加土壤中的固氮菌 乳酸菌等有益菌群 调节土壤中有益酶的活性 保证农作物在 良好的土壤环境中生长 此外 还可用作饲料添加剂 促进畜禽健壮生长 1 2 3 在食品工业上的应用 1 在保健食品中的应用 s u g a n o t 7 3 j 指出多于六个残基的壳低聚糖能阻止大鼠体内胆固醇和甘油三酯含 量的升高 而少于六个残基的壳寡糖则不能 k o n d o 7 4 研究结果显示 在其降低胆 固醇方面 壳聚糖的链长多于六个残基是必要的 d e u c h i 7 5 研究表明 壳聚糖能够 有效地降低小鼠血清中胆固醇的含量 一般地 壳聚糖的相对分子质量在8 2 0k d a 的降低胆固醇作用比相对分子质量为3 0 0k d a 的要大 而分子量在5 5 0k d a 的 其对胆固醇的降低能力以及粪便中脂肪含量的增加并无明显差异 但若分子量小于 2k d a 其降血脂功能也随之消失 7 3 此外 在壳聚糖中添加抗坏血酸能增强其降 血脂的作用 7 6 7 7 1 2 在食品保鲜中的应用 壳聚糖具有很好的抗菌活性 其抗菌机理主要与结构中的氨基有关 7 蹦0 1 将其 添h n n 固液食品中 尤其是酸性或低酸性的食品中 不仅可以澄清汁液 还具有防 腐保鲜的作用 也可将其低酸溶液喷涂在鲜肉制品或果蔬的表面形成膜 该膜对 0 2 c 0 2 等气体有选择渗透性 可以抑制果蔬或鲜肉的呼吸强度 达到保鲜的效果 由于壳聚糖能溶于弱酸 能很方便的成膜 且这种膜是可食用膜 也很容易被水沈 去 在冷水和热水中又能保持原状 因此特别适合作固体 液体食品的包装材料 1 2 4 在环境保护上的应用 壳聚糖分子中有大量游离氨基 在酸性条件下氨基被质子化 带正电荷 是一 种天然的阳离子絮凝剂 可使水中的悬浮物发生凝聚而沉降 8 1 1 由于大多数有机物 及蛋白质带负电荷 壳聚糖可通过电中和作用使胶体颗粒形成细小的凝聚体 再通 过高分子架桥作用使这些凝聚体形成大体积的絮团并聚集沉降 如将壳聚糖用于处 理蔬菜 家禽 肉类 奶酪等的废液 可使废液中悬浮物含量减少7 0 一9 8 其 中的粗蛋白等絮凝物可被回收利用 壳聚糖还是一种天然的螯合剂 可利用分子中的氨基 羟基与h 矿 n i 2 c u 2 9 硕士学位论文 m a s t e r st t t e s i s 等重金属离子形成稳定的螯合物 减少重金属污染 此外 商品化壳聚糖还被用于 饮用水的净化 1 3 壳聚糖在生物医用领域研究现状 目前 壳聚糖及其衍生物在医疗方面应用比较广泛 很多文献进行了述评 8 2 8 6 1 世界上发表s c i 收录的壳聚糖研究论文从2 0 0 1 年的3 0 0 多篇到2 0 0 6 年的1 5 0 0 余 篇中 涉及生物医用方面的达一半以上 近年来 壳聚糖纳米粒子作为药物和基因 载体更受青睐 s 7 壳聚糖具有独特的跨细胞膜转运能力 如杜予民教授在纳米粒子 制备和量子点荧光探针方面做了很多的创新工作l 8 8 9 1 高分子量壳聚糖有易脆 不 易加工 缺乏亲脂性等缺点 限制了它的应用 由于壳聚糖上有大量羟基和氨基 可以进行多种反应 目前 大多报道是在壳聚糖上接枝烯烃类单体 利用双键聚合 形成凝胶 如 李文俊教授以壳聚糖与聚丙烯酸制成的聚电解质配合物可制得环境 响应的药物控释膜 9 0 j 方月娥教授采用保护氨基的方法 使c 6 一o h 接枝p v a l 9 1 1 印春华教授将甲基丙烯酸甲酯接枝于壳聚糖上制备纳米粒子 作为口服蛋白质药物 载体1 9 2 1 但这类高分子材料因含有烃类链段 不是完全生物可降解的 因此 在国内外 利用壳聚糖接枝可降解高分子的研究逐渐引起人们的重视 董常明博士将丙交酯接枝于壳聚糖上通过自组装产生纳米粒子 9 3 j 姚芳莲教授将寡 聚乳酸接枝于壳聚糖上阱 o u c h i 把p e g 含单醛基的p e g 接枝到壳聚糖上制 备了生物可降解物理交联水凝胶以及纳米微球 95 并用于多肽药物控制释放 方月 娥教授 9 6 制备了多孔结构的含p e g 侧链的壳聚糖 也制备了接枝聚己内酯的壳聚 糖 壳低聚糖与高分子量的壳聚糖相比 具有更多的优点 目前 有关这方面的报 道不多 1 4 本论文研究意义及主要内容 壳聚糖及聚乳酸都是生物相容性好 生物可降解性能优异的生物医用材料 但 是两者均有各自的局限性 如聚乳酸在体内降解的中间产物乳酸会在体内引发无菌 性炎症 壳聚糖由于强大的氢键作用 分子刚性强 使得壳聚糖不易加工 并且使 用高分子量壳聚糖接枝聚酯制备共聚物时 发现难于寻找适当的溶剂来溶解这些接 枝共聚物 而低分子量壳聚糖与高分子量壳聚糖相比 亲水性好 在d m s o d m f 等溶剂中溶解性要好 9 7 1 接枝反应易于控制 因此 思考将壳低聚糖引入聚乳酸中 来改善材料的生物亲和性和功能性 也可以利用壳聚糖调节聚乳酸材料的生物降解 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 速度 而且壳聚糖还可以结合酸 既避免炎症反应又有抗菌作用 另外 壳低聚糖 还具有促进细胞生长作用 其糖单元是软骨组织需要的基本成分 因此 把天然可 再生资源的利用与生物医用材料相结合 是当今世界发展的需要和要求 相信这类 新型可完全生物降解共聚物有望在生物医用材料方面得到应用 本论文工作内容 1 采用泓淀粉酶催化水解壳聚糖制备水溶性壳低聚糖 2 以d l 哥l 酸为原料 在催化剂锌粉存在下通过脱水环化合成d l 一丙交酯 单体 3 通过接枝共聚的方法将聚乳酸接枝到壳低聚糖分子链上 探索壳低聚糖接枝 聚丙交酯的反应条件及不同条件下产物的性能 4 通过采用复乳挥发法将聚乳酸对壳低聚糖共混改性 制备聚乳酸 壳低聚糖 共混微球 并研究了它们对蛋白质模型药物 牛血清蛋白的包封率和释放性能 5 研究了壳聚糖与乳糖发生美拉德反应的条件及其产物的抗氧化性能 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第二章壳低聚糖的制备及其表征 目前 制备壳低聚糖应用较多的方法主要有过氧化氢法和酶法 过氧化氢法制 备的水溶性氧化壳低聚糖在中性环境中具有较好的吸湿保湿性和抑菌作用 宜用作 化妆品原料和医用敷料 但是 过氧化氢法使降解产物中氨基的含量减少 而氨基 又是壳聚糖不同于纤维素和其它多糖的典型特征 也是壳低聚糖具有生物活性的功 能性基团 9 9 9 9 3 由于氨基是活泼基团 很容易在反应过程中被破坏 所以在制备壳 低聚糖的过程中应当重视氨基的保护 采用酶法制备壳低聚糖不仅条件温和 且易于控制 污染小 产物的安全性高 对产物的化学结构改变也最小 1 0 0 l 由于专一性酶 甲壳素酶和壳聚糖酶等 目前 成本高 难于工业化应用 近年来 研究了一些非专一性水解酶 如胃蛋白酶 木 瓜蛋白酶 纤维素酶 淀粉酶等 降解壳聚糖 由于淀粉酶是一种工业上易得的糖 类水解酶 制备工艺相当完善 在自然界也大量存在 价格低廉 因而在壳低聚糖 的制备上得到了广泛的应用 本章主要采用酶降解法 利用g p c 监测酶催化壳聚糖的水解过程 超滤膜对 降解产物进行分级处理 使用f t i r t g d t a 等检测手段鉴定酶解壳低聚糖产物 的结构 采用电位滴定方法测定其脱乙酰度 2 1 实验部分 2 1 1 材料及仪器 壳聚糖原料c s 浙江玉环海洋生物化学品有限公司提供 m w 为5 2 0 1 0 4 d d 为9 0 5 a 一淀粉酶 北京星奥生物科技有限公司 浓盐酸 3 6 一3 8 分 析纯 其它试剂均为分析纯 超滤仪和超滤膜n m w l o s 0 0 1 c 11 o m e g a 1 0k d a 3k d a 和1k d a 从美 国p a l l f i l t r o nc o r p o r a t i o n 购进 n i c o l e ti m p a c t3 8 0 智能傅立叶红外光谱仪 美国 尼高力公司 k b r 压片 d s c 厂r g 分析仪 美国t a 公司 r e 一5 2 型旋转蒸发 仪 上海亚荣生化仪器厂 p h s 2 c 型精密酸度计 上海精密科学仪器有限公司 t d l 5 一a 飞鸽牌离心机 湖北科学器材公司 2 1 2 壳低聚糖的制备 壳聚糖溶于2 醋酸中制成5 w t 的溶液 然后加壳聚糖质量3 4 的舡 1 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 淀粉酶 控温4 8 5 0 到达预定的反应时间后 产物用1 0 3 和1k d a 的超滤 膜分离 滤液低温浓缩至原体积的l 5 调节p h 9 0 过滤 固体产物用去离子水 洗涤 抽干 3 0 真空干燥后收集 得水不溶性产品 滤液加乙醇沉淀 析出的 固体产物用乙醇洗涤干净 抽干 放入装有五氧化二磷的干燥器内真空干燥 得水 溶性产品 2 1 3 脱乙酰度测定i l o l l 称取0 1g 水溶性壳低聚