（化学工程专业论文）一种新型大环内酯类抗生素的分离纯化研究.pdf

摘要 摘要 本研究以抑菌活性为指导 从一株链霉菌s t r e p t o m y c e sr e g e n s i s0 9 9 的发酵液 中分离提取了一种新型大环内酯类抗生素 分子量6 0 0 0 3 分子式c 3 2 h 4 4 n 2 0 9 定名为麦拓莱霉素 m a i t u o l a i m y c i n 并且确定了一条较为合理的分离纯化 丁艺 路线 建立了关于麦拓莱霉素的检测分析方法 包括生物检测方法 薄层层析方法 和分析型高效液相色谱方法 可以对不同基质条件下的麦拓莱霉素进行定性或定 量分析检测 确定了利用大孑l 树脂吸附方法分离提取麦拓莱霉素的工艺条件 筛选出非极 性的n k a 树脂作为吸附剂 优化后的吸附条件为 p h 值为1 0 3 2 吸附流速选 择为l m l m i n n a c l 浓度为o 6 左右 吸附量可达3 3 7 m g g 树脂 优化后的解 吸条件 选择2 0 乙醇溶液除去大部分色素和部分杂质 用1 0 0 乙醇洗脱活性 组分 用含1 浓h c i 的乙醇溶液洗脱剩余色素和杂质 令树脂再生 总解析率 可达到9 2 7 并通过实验比较证实 树脂吸附方法比萃取方法可以使有效成分 含量提高1 3 左右 确定了麦拓莱霉素的制备高效液相色谱条件 制备得到了纯度可达9 5 的 麦拓莱霉索纯品 关键词 麦拓莱霉素 大环内酯类抗生素 纯化 大孔树脂 h p l c a b s t r a c t a b s t r a c t an o v e lm a c r o l i d ea n t i b i o t i c m a i t u o l a i m y c i n w a si s o l a t e da n d p u r i f i e df r o m t h e f e r m e n t a t i o nb r o t ho fs t r a l ns t r e p t o m y c e sr e g e n s i s0 9 9 i t sn o v e ls t r u c t u r eb a s e do n s p e c t r o s c o p i ca n a l y s i sw a sd e t e r m i n e d m o l e c u l a rw e i g h tw a s6 0 0 0 3 a n dm o l e c u l a r f o r m u l aw a si d e n t i f i e da sc 3 2 h 4 4 n 2 0 9 t h e p r e p a r a t i v e r o u t ew a sd e t e r m i n e dt o o d e t e c t i o na n da n a l y s i sm e t h o do fm a l t u o l a i m y c i nw a se s t a b l i s h e d i n c l u d i n g b i o l o g i c a l d e t e c t i o n m e t h o d t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y m e t h o da n d a n a l y s i s h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d t h e s em e t h o d sc a nq u a l i t a t i v eo r q u a n t i t a t i v ed e t e c ta n da n a l y s i sv a r i o u s m a t r i xs a m p l e s p r o c e s sc o n d i t i o n so fi s o l a t i n gm a i t u o l a i m y c i nf r o mf e r m e n t a t i o nb r o t hb y m a c r o p o r o n sa d s o r b e n tr e s i nw e r ed e t e r m i n e d n k an o n p o l a rr e s i nw a ss c r e e n e da s t h eb e s ta d s o r b e n t a n da d s o r b e n tc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h ep hw a sm a i n t a i n e d a t1 0 3 2 f l o wr a t eo f a d s o r p t i o nw a sl m l m i n o6 n a c lw a sf e a s i b l e a n da d s o r b e d m a i t u o l a i m y c i na tr e s i nn k a w a s3 3 7 m g gr e s i n t h ed e s o r p t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d 2 0 e t h a n o lw a su s e df o rr e m o v i n gs o m ei m p u r i t ya n dp i g m e n t 1 0 0 e t h a n o lw a su s e df o re l u t i n gm a i t u o l a i m y c i n a n d 10 0 e t h a n o lw i t h1 h c lw a s u s e df o rr e g e n e r a t i n gr e s i nd e s o r p t i o nr a t ew a s9 2 7 p r e p a r a t i v eh p l c c o n d i t i o n so fm a l t u o l a i m y c i nw e r ed e t e r m i n e d a n dt h r o u g h p r e p a r a t i v eh p l c m a l t u o l a l m y c i np u r es a m p l ew a sg e t w h i c hd e g r e eo f p u r i t yw a s 9 5 k e yw o r d s m a l t u o l a i m y c i n m a c r o l i d ea n t i b i o t i c p u r i f i c a t i o n m a c r o p o r o u s r e s i n h p l c 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果 除了文中特别加以标注和致谢之处外 论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果 也不包含为获得墨洼盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中 作了明确的说明并表示了谢意 学位论文作者签名 茁青马 签字日期 矿牛年 月 口日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨注盘鲎有关保留 使用学位论文的规定 特授权墨洼盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索 并采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编以供查阅和借阅 同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 学位论文作者签名 7 易屠岛 签字日期 加4 年1 月 驴日 口 月 年 冬勿 t 憎一太 名 期 签 日 师 字 导 签 刖舌 刖吾 二十世纪医药界获得巨大成功 人类在疾病的预防 治疗上出现突破性进展 过去许多人们谈之色变的疾病得到了有效的控制和治疗 人们在了解疾病的致病 机理后 开始有针对性的 系统的进行药物的研发 期待着j l 发出专一性的 低 毒的 高效的治疗药物 抗生素作为一类重要的医药产品 随着它的发现和发展 许多传染性疾病 甚至癌症都得到了有效的控制和治疗 消灭了许多过去夺去了无数人生命的j m 的瘟疫 八十年代 人们曾乐观的认为感染疾病是完全可以治愈的 但是随着临 床多重抗药性病原体的出现和蔓延 使得许多曾经是高效的治疗药物失去了效 果 导致感染性疾病不易被治愈 那些年老的和免疫能力低下的病人重新受到高 的患病率和死亡率的威胁 这又重新唤起了人们对于寻找新型抗菌药物的热情 只有不断研发新型药物 寻找新的药物作用机理才能再次战胜疾病 挽救病人的 生命 在寻找 开发新药的过程中 分离纯化工作占到了举足轻重的地位 它是进 行各神医药学研究的先决条件 只有分离得到足够纯度的样品 才能继续下一步 的研究工作 抗生素种类繁多 结构各不相同 针对其性质的差异建立的分离方 法各异 针对一种新型的药物 如何在研究的基础阶段建立合理的分离方法 以 及快速 准确的分析检测手段一直是研究人员工作的重点 本实验室从土壤中筛选得到了一株藤黄灰属链霉菌 通过对其发酵液的初步 研究 发现其中含有抑制细菌和抑制真菌的活性组分 对多种革兰式阳性菌有很 好的活性 同时对小麦赤霉病 黄瓜炭疽等1 7 种由真菌引起的植物病害有很好 的防治作用 具有一定的开发价值 如何建立一种高效的分离手段 对活性组分 进行分离纯化 并且建立有效 简便的分析检测方法 进而对其各方面性质进行 研究成为我们工作的重点 第一章文献综述 第一章文献综述 二十一世纪人类的目标是更好的享受生活 远离疾病 为了实现这一宏伟目 标 需要医药行业付出巨大的努力 每年都会有新的药物 生物制剂和疫苗被研 制出来 并得到批准使用 同时药物研究的需要推动了各种新技术的发展 这些 新技术使得药物的分析更加快速 准确 容易 反过来使得药物的研发更加有针 对性 更加科学 新药物的发现对于人类的健康和长寿是至关重要的 它能够重 树新的希望 重建新的未来 抗生素是一类重要的药物 是二十世纪医药界的伟大成就之一 它的使用挽 救了无数人的生命 人们利用微生物之间的拮抗作用 用一种生物产生的物质抑 制或是杀死另一种生物 人们在寻找得到适当的抗生素产生菌后 给这些产生菌 以适当的生长条件 包括营养物质 空气 温度 d h 值等 进行培养 使它们 产生抗生素 然后把抗生素提取出来 加以精制 得到抗生素产品 随着微生物学 生物化学 医药和化学工程等学科的发展和配合 抗生素的 研究不断的深入 得到迅速的发展 由于抗生素的广泛应用 使许多细菌感染的 疾病基本上得到了控制 例如传染性很强的流行性脑膜炎 死亡率很高的细菌性 心内膜炎 以及严重威胁生命的肺炎 都可以用青霉素进行有效的治疗 又如过 去人们闻之色变的鼠疫 天花 疟疾等传染疾病 在利用抗生素进行治疗后 得 到了有效的控制 抗生素在对付真菌感染引起的疾病方面也有一定的疗效 直至二十世纪八十年代中期 人们还普遍认为感染疾病是可以治愈的 但是 现在却看到了相反的结果 因为革兰氏阳性菌对所有的l 临床药物都有不同程度的 抗药性 导致感染性疾病不易被治愈 具有多重抗药性的病原体菌株的出现和蔓 延 导致那些年老的和免疫能力低下的病人受到高的患病率和死亡率的威胁 这 又重新唤起了人们寻找新型抗菌药物的热情 随着人类疾病危害性次序的转变 抗生素的研究正向着抗肿瘤 抗病毒的方 向发展 临床上应用的抗肿瘤抗生素有丝裂霉素 放线菌素 平阳霉素 光辉霉 素 正定霉素 阿霉素等 分别对肺癌 胃癌 恶性葡萄胎 磷状上皮细胞癌 睾丸胎盘癌及各种类型的急性白血病等有一定的疗效 或与其它药物联合使用 对肿瘤起缓解作用 但其中大多数毒副反应较大 由于抗肿瘤抗生素在治疗肿瘸 的综合治疗中占有一定的地位 所以研究者同时也在努力的寻找高效低毒的新型 抗生素 第一章文献综述 1 1 抗生素研发的新思路 直到9 0 年代初 医药工业还只是停留在对现有药物的改进上 这使得微生 物抗药性总是 棋高一筹 为了有效的对抗细菌耐药性 必须发展另一种手段 来发现 发展新抗生素 这种手段就是通过分析微生物基因组序列信息 得到新 颖的分子标靶 建立新的抗菌作用机理 避开现有的细菌抗药机理 这种方法导 致新化合物和新抗菌机制的出现 是医生用来对付抗药性病原体的终极武器 已 经完成的基因组序列信息和不断发展的基因技术也成为抗生素开发的有力工具 1 2 1 药物作用韵潜在位点就是一个有效的分予标靶 一个有效的抗菌标靶被定义 为标靶病原体的生存或毒力必需基因的产物 这段基因可以是生存所必需的 可 以是导致发病的机理 可以是 种毒素产物 也可以是对于特定药物的相应抗体 等等 药物通过中断病原体的生长或是通过引起它的死亡来起作用 随着d n a 测序技术的快速发展 使得细菌基因图谱以空前的速度补充着基 因库 1 9 9 5 年 上呼吸道病原体流感嗜血杆菌 h a e m o p h i i u si n f l u e n z a e 首先完 成测序工作 得到了它的基因组序列 现在 公共数据库中已经有1 3 6 种细菌的 完整基因序列 另有 3 0 0余种正在进行中 f w w w t i g r o r g t d b m d b m d b c o m p l e t e h t m l 必须指出 这个数字不包括古细菌和 真核微生物的基因序列测序 也不包括那些数据库还没有公开的由企业进行测序 的细菌基因组 随着基因组数据库的日渐丰富 基于标靶的药物开发也成为可能1 3 f i 和经 典的药物开发方法相比较 基于标靶的药物开发方法显得更加合理 经典的全细 胞筛选方法是以化合物能否杀死生长在实验室培养介质中的细菌为筛选标准的 而基于标靶的药物开发则是这样进行的 第一步 利用基因组学及其相关技术 如基因序列和生物信息分析 来发现 可以利用的新标靶 第二步 通过高通量筛选的特定生化反应来确定标靶的性质 然后 随机从拥有几十万个化合物的文库中挑选合适的化合物作为新标靶的抑制 剂 这是第三步 第四步是将这些抑制剂作为先导化合物进行进一步的修饰 通 过s a r s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p 程序进行优化 接下来就是要对该抑制 剂从性质上做进一步优化 如增强其对关键组织中的标靶的作用效果 增强细菌 细胞透过性 扩展抗菌谱 增加选择性和化学溶解度等等 同时 优化这些先导 化合物的化学性质 使其广谱抗菌活性 药代动力学等性质更适合于口服或注射 使用 得到优化的先导化合物在动物实验中验证其抗菌活性 这就是第五步的工 作 在有了安全性和有效性的情况下进行第六步 进入临床试验 1 通过对一个给定的生物体的全部基因测序 可以得到其全部的开放阅读框架 第一章文献综述 o p e nr e a d i n g f r a m e s o r f s 接下来的问题是如何从数干个o r f s 中选出最适 合于新抗生素作用的标靶呢 有如下几个主要标准 1 标靶必须在要求的生物 体谱图中表达 2 标靶应该不在人类谱图中表达 或者是存在较大的差别 3 标靶应该是感染条件下细菌生长或生存所必需的 4 标靶应该和感染过程相关 联 5 标靶的部分功能应该有所了解 以便于进行相关实验和高通量筛选 通过和现有的微生物基因组数据库进行比较 运用i ns i l i c o 分析就可以大体 得到目的标靶的谱图 一些情况下 广谱的高度保守的标靶可以用于发展新型的 广谱抗生素 另外一些情况下 唯一性标靶可用于发展有针对性的窄谱抗生素 可以主要针对l v t t u b e r c u l o s i s i l p y t o r i 和c h l a m y d i a 这样的药物不但可以减少 对正常种群的破坏 而且还可以减慢抗药性的发展 i ns i l i c o 评估是重要的早期分析手段 可以找出新型抗菌药物的最大潜在谱 图 还可以帮助避免浪费过多的精力花在那些可能没有这种标靶的病原体上 在 人类基因组序列信息可以有效利用的情况下 应该先采用i ns i l i c o 对标靶进行粗 分1 7 1 0 1o 例如 通过i ns i l i c o 分析 在一天的时间里 就可以知道选择的标靶在 病原体内是否会表现 它包含的域或亚域是否在其它序列中也表现 从生物体内 找到的标靶是否足够保守以至于可以用于寻找新药 在真核生物中是否也有类似 的表达 等等 例如 在肽葡聚糖生物合成过程中的关键步骤中起作用的必需酶是m u r a u d p n a c e t y l g l u c o s a m i n ee n o l p y r u v a t et r a n s f e r a s e m u r a 在所有产生细胞 壁的细菌中表达 在进行了i ns i l i c o 分析后 发现在革兰氏阳性菌中m u r a 以第 二种型式起作用 这是未预料到的 称原始蛋白为m u r a i 称第二型式为m u r a 2 在氨基酸水平有4 5 可以被鉴别出来 其可以代替有缺陷的m u r a l 在 x p n e u m o n i a e 中 要想观察到有杀菌效果 就必须同时对m u r a l 和m u r a 2 进行 抑制 一种已知的m u r a 的抑制剂p h o s p h o m y c i n 发现其可以同时抑制m u r a l 和m u r a 2 并且有相同的动力学性质 这一发现对于设计抑制m u r a 药物有重 大启示 为了能真正有效的对抗革兰氏阳性菌 必须同时对m u r a l 和m u r a 2 都 有效果 i l l 在得到了某种微生物的基因组序列后 需要通过适当的技术判断出哪些是必 需基因 可以通过质粒整合 p l a s m i di n t e g r a t i o n 转座子插入诱变 t r a n s p o s o n i n s e r t i o nm u t a g e n e s i s 和等位基因重置诱变 a l l e l i c r e p l a c e m e n t m u t a g e n e s i s 等广泛采用的手段判断一段基因是否为必需基因 另外也可以通过 条件致死突变 c o n d i t i o n a ll e t h a l m u t a n t s 来证明一段基因是否是必需基因 如 果是必需基因 降低基因产物的表达水平就会限制细胞生长 当降低到一个极限 值后 细胞在培养介质中就会停止生长 可以通过同源基因重组技术 用人工的 第一章文献综述 调控启动子来替代原来的启动子 当调控启动子状态下的转录完成后 细胞中标 靶基因表达水平会降低 就可以观测到结果中有哪些地方起了变化 现在已经发 展起了一套系统并应用于f c o l i l a c t o c o c c u s l a c t i s s p n e u m o n i p b s u b t i l i s 和 s a m r e h s 1 2 1 4 1 一个有效的可用于治疗的标靶必须在感染过程中表达 目前 对于感染过程 中的基因转录的研究还只局限于绍菌在实验室培养基中生长的情况 而在复杂的 宿主中生长的细菌基因转录与在培养基中生长的细菌基因转录有很大的不同 传 统的全细胞体外抗菌筛选集中作用于这样一些标靶 这些标靶对于在体外培养基 环境中生长是非常重要的 而对于体内环境 这与感染过程紧密联系 选出的抑 制剂的作用效果可能就不理想了 1 5 1 鉴别感染过程中的基因表达的技术有体内表达技术 i v e t i n v i v oe x p r e s s i o n t e c l m o l o g y 标签突变技术 s t m s i g n a t u r e t a g g e dm u t a g e n e s i s 荧光差示诱 导技术 d f i d i f f e r e n tf l u o r e s c e n ti n d u c t i o n 这三种技术鉴定和感染相关的基 因 而生物信息分析技术是基于基因组序列的一种更系统的方法 它对全部基因 的转录情况 逐个开放阅读框架去分析 评定 其通常采用微生物阵列技术 用 d n a 模板代表每一个0 r f 而d n a 模板通常是通过p c r 技术得到的基因碎片 或是具有特殊基因的寡核苷酸 然而这种方法还只是用于探测生长于培养基中的 细菌的基因转录情况 现在已经发明了一种称为r t p c r 的新技术用于探测体内感染过程中的基斟 转录情况 其基本的方法步骤为 第一步 使动物体内发生感染现象 第二步 切下感染组织并迅速放入液氮中冷冻 以防止不稳定r n a 的降解 将冷冻样品 分解为均匀的微粒 分离出全部的r n a 第三步 样品用脱氧核糖核酸酶处理 以转移污染的d n a 用寡核菅酸引物反转录以获得c d n a 第四步 c d n a 作 为多极p c r 反应的模板 上面有成对的引物 每对的其中一只是用荧光标记的 模板和全部想要研究的o r f s 反应 实验有计划的让p c r 产物有着不同的大小 和不同的荧光标记 然后就可以在标准序列凝胶上进行多元分析了 这种技术可 以对感染过程中的全部基因转录进行半定量的分析 也可以用于直接比较发生在 不同介质中的感染过程的基因转录情况 或是检测不同感染模型和感染不同阶段 的基因转录情况 1 6 1 0 目前使用的绝大部分抗生素只是作用于有限的标靶上 数量大约有5 0 0 个 大体可以分为 细胞膜受体和g 蛋白耦合受体 g p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r s g p c r s 约占4 5 各种酶类 约占2 8 各类激素和各类作用因子 约占 1 l 离子通道 约占5 细胞核受体 约占2 d n a 约占2 另外是 一些未知功能的标靶 约占7 这些标靶是细胞中起决定作用的功能蛋白 如 第一章文献综述 d n a r n a 蛋白质及细胞壁合成等 随着基因组测序的完成 这就提供了 个供鉴定所有潜在药物作用标靶的平台 通过基因组序列信息分析 发现大约有 5 0 0 0 1 0 0 0 0 个潜在的药物作用标靶 是现有利用标靶的1 0 倍多 三种类型的 标靶可用于寻找新型先导化合物 脂肪酸的生物合成 多肽脱甲酰基酶和氨基酰 化合成酶 1 7 1 9 1 脂肪酸的生物合成是通过脂肪酸合成酶 f a s 的作用完成的 对于哺乳动 物 也包括人类 f a s 是一个单一的大型多肽 而对于细菌 植物和原生动物 它们的f a s 是由多个独立蛋白质组成 每 种蛋白质只催化这条途径上的一利r 反应 细菌通过f a s 的作用合成脂肪酸 这是细菌生存所必需的 而细菌的f a s 同人类的f a s 在结构上存在着很大的差异 可以筛选一种广谱的抗菌药物 只 作用于细菌而对人类无害 抗结核的药物i s o n i a z i d 和抗生素t h i o l a c t o m y c i n 就 是这样的药物 通过实验证明 f a bi 和f a bh f a b b f a b f 都是可以利用的有效标靶 c e r u l e n i n t h i o l a c t o m y e i n d i a z a b o r i n e s 和t r i c l o s a n 就是作用于这些标靶的药物 通过对sa u r e u sf a b l 的h t s 得到了2 种新型先导化合物 它们只是选择性的对 s a u r e u s 中的酶起作用而对人体内的f a s 无效 虽然最初得到的苯二氮先导化合 物没有抗菌活性 而且对于f a b l 只有很弱的抑制作用 但经过s a r 改进得到的 衍生物却是在效能上有了很大的提高 针对s a l 4 f e u s 的m i c 是o 5 p g m l 另 类的先导化合物眯唑类也有类似的情况t 2 0 1 旱在3 0 年前 人们就认识到多肽脱甲酰基酶 p d f 可以作为药物作用的 标靶 但是直到现在才对其进行开发 现在对此酶的各方面性质有了更加深入的 理解 诸如它的三维立体结构 它的抑制剂活性 它的抗性以及作为药物标靶的 合理性 细菌和人类在蛋白质合成方面有许多相似的地方 但也有明显的差异 细菌 是先甲酰化 然后再在p d f 的作用下把蛋氨酸上的甲酰基脱去 如果甲酰基团 没有脱去 则会抑制蛋白质的合成 细菌就不会生长 可以通过这方面的差异 选择合适的抑制剂 只对细菌作用丽对人类无害 p d f 在细菌中是相当保守的 通过分析已经完成测序的细菌基因组可以发 现 在所有的细菌中都存在p d f 的同源基因 而且高度保守的基因序列正是对 应于酶起催化作用的活性部位 可以利用p d f 的这种特性寻找广谱的抗菌药物 天然产物放线酰胺素 a c t i n o n i n 是一种p d p 的抑制剂 在体外实验中有 很好的抗菌作用 但在体内实验中却没有活性 而另两种合成的p d f 抑制剂 v r c 3 3 7 5 和b b 3 4 9 7 具有很好的体内抗菌活性 在小鼠实验中可以治愈由葡萄 球菌感染引起的败血症1 2 1 2 3 1 第一章文献综述 氨基酰化合成酶催化氨基酸和同源的t r n a 的氨基酰化反应 使这些氨基酸 可以组成多肽链 形成蛋白质 原核生物中有2 0 种t r n a 合成酶 能够抑制异 亮氨酰基t r n a 合成酶的抗生素m u p i r o c i n 已经商品化 如果抑制其它合成酶也 有同样的抗菌效果 那么就意味着通过t r n a 合成酶家族可以找到2 0 种可供丌 发的标靶 临床上重要的病原体的t r n a 合成酶在上世纪九十年代中期就已经被 鉴别出来 它们成为第一代以基因组为基础的药物标靶 其中的几种已经证实是 必需的和代表性的 是可在体内利用的标靶 通过高通量筛选和合理的药物设计 已经得到了它们的先导抑制剂 通过进一步的结构分析 又可以对先导化合物进 行优化 1 微生物基因库的目益扩大 筛选得到的先导化合物的不断出现 将使得用于 临床的药物趋于多样化 尽量减少细菌抗药性的发展 目前 t i g r 的科学家们 正在进行一项被称之为 基因组序列种族关系史 p h y l o g e n o m i c s 的庞大的研究 工程 希望通过对全部已知的基因组序列信息进行综合分析 更好的理解主要细 菌种群之间的种群发展关系史 w w w t i g r o r g n e w s 通过对种群发展史的分析 可得到标靶在不同种类间的相似性 和相同种类问的差别性 例如 标靶在有代 表性的革兰氏阳性菌中的相互关系如何 如果这些标靶也同样在革兰氏阴性菌 中表达 那么 在这些生物体中是否也表现出相似的性质呢 对于这些有效活性 部位的同源性和保守性的深入研究可以使评定工作更加细致 基于标靶的药物开 发过程也会随着基因技术的不断发展而日趋完善 缩短先导化合物的筛选时间 提高筛选成功率 1 2 大环内酯类抗生素的分析方法 大环内酯类抗生素是当今应用最为广泛的抗菌药物之一 一般可以抑制革兰 氏阳性菌 和一些革兰氏阴性菌 以及支原体 流感嗜血杆菌 衣原体 立克次 氏体等 已经上市的主要大环内酯类抗生素有 红霉素及其相关物质 a z i t h r o m y c i n c l a r i t h r o m y c i n d i r i t h r o m y c i n r o x i t h r o m y c i n f l u r i t h r o m y c i n j o s a m y c i n 交沙霉素 r o k i t a m y c i n 罗他霉素 k i t a s a m y c i n 柱晶自霉素 m y c i n a m y c i n m i r o s a m y c i n o l e a n d o m y c i n 竹桃霉素 r o s a r a m i c i n 蔷薇霉素 s p i r a m y c i n 螺旋霉素 t y l o s i n 泰乐菌素 等 它们的分析技术比较成熟 参 照它们的分析手段可以对研发新型的大环内酯类抗生素提供一定的参考 因为它 们的结构上有很多的相似之处 同时可以尽快找到适宜的分析检测条件和方法 便于改进实验方法 优化工艺路线 主要分析方法包括 薄层层析 纸层析 气相色谱 h p l c 毛细管电泳 这些技术已经用于从发酵液中分离和定量分析这些大环内酯类抗生素 以及用于 笙二兰奎堕堡姿 临床测量这类抗生素在生物体内的情况 包括血液 血浆 血清 尿液和组织液 同时也用到了其它的检测手段 包括生物自显影 紫外分光光度测定 荧光法检 测 电化学检测 化学发光检测 质谱技术等t 2 5 1 大环内酯类抗生素 般根据内酯大环上的原子个数柬分类 红霉素 a b c d e f o l e a n d o m y c i n r o x i t h r o m y c i n d i r i t h r o m y c i n c l a r i t h r o m y c i n f l u r i t h r o m y c i n 是1 4 元大环 a z i t h r o m y c i n 是1 5 元大环 j o s a l r l y c i n r o s a r a m i c i n r o k i t a m y c i n k i t a s a m y c i n m i r o s a m i c i n s p i r a m y c i n t y l o s i n 是1 6 元大环 后两种抗 生素被广泛用于兽药 除了r o s a r a m i c i n 和m i r o s a m y c i n 是由小单孢菌属产生得到的 其它的大环内 酯类抗生素均由链霉菌属产生得到 而且大环内酯类抗生素产生菌一般产生很多 抗生素类似物 1 2 1 红霉素和相关的1 4 元大环内酯类抗生素 红霉素由放线菌属的红霉素链霉菌产生 红霉素a e a 的化学结构是红 霉素家族的基本结构 红霉素的产品中含有许多微量的杂质 包括一些红霉素的 盐和酯的衍生物 和红霉素的代谢物及其它类似物等 1 2 11 t l c 和p c 方法 表1 1 列出了有关的利用t l c 和p c 方法对红霉素及其相关化合物进行分析 的条件 利用各种有机试剂的混合液在硅胶薄层板上对红霉素进行展开 用5 0 的硫酸水溶液显色炭化 还可以用1 0 的硫酸加入1 的硫酸铈和25 的钼 酸作为显色剂t 2 7 1 可以通过t l c 方法对红霉素的甲醇溶液进行半制备畦8 3 2 1 e s t e r b o o k 和h e r s e y 利用生物自显影的方法在t l c 上对红霉素进行分离盱 k i b w a g e 利用k i e s e l g e lg f 2 5 4 板分离红霉素混合物 显色剂为对甲氧基苯甲醛 硫酸乙醇 l 1 9 然后加热 他还提供了各种大环内酯类抗生索在此条件下的 r f 值1 3 4 1 类似的t l c 方法还用于半定量分析鼠的尿液和粪便中的红霉素及其代 谢物t 3 5 1 c a c h e t 等利用k i e s e l g e l6 0f 2 5 4 板分离兽药中的红霉素 显色剂为4 一甲 氧基苯甲醛 硫酸 乙醇 1 l 9 然后加热t 3 6 1 t a b l e1 1t l ca n dp cc o n d i t i o n su s e df o rt h ea n a l y s i so fm a c r o l i d ea n t i b i o t i c s r e f s t a t i o n a r y p h s a m o l e c o m p o u n d s s o l v e n ts y s t e md c t e c t i o o j 2 6 s i l i c a g e ig s o l u t i o n e a e b a e p s e a h k 二氧甲烷 甲醇 苯 甲5 0 硫酸炭化 酰胺 第一章文献综述 2 7 k i e s e l g e lg s o l u t i o n e e b e c a e e s m二氯甲烷一正己烷一乙醇5 0 硫酸炭化 k i e s e l g u h r或1 硫酸铈和25 钳 幢 f 入到io 疏峻中 2 8 s i l i c a g e lhs o l u t i o n红霉素甲醇生物自疆影 2 9 p a p e r b u f f e r e s o l u t i o n e s o l e a n d o m y c i n 甲醇 氧乙烷生物自显影 dp a p e rs t r i p s m a g n a m y c i n p i c r o m y 甲醇 苯 c i n m e t h y m y c i n 3 s i l i c a g e lg s o l u t i o n p e e e s e s e l e g e甲醇 乙酸钠水 f 液8 5 磷酸 水 乙晰 于 e s c e e c a e a 丁酶 3 ls i l i c ag e l6 0t a b i e r se s氯仿一甲醇一乙酸 含重铬酸钾的4 0 硫峻 s u s p e n s i e e s l5 0 加热 3 2 s i l i c a g e l g s o l u t i o n红霉素 二氯甲烷一氯仿 甲醇 禽苯酚和硫酸的乙醇 e r y t h r o m y c y l a m i n e 乙醛 h c o n h 2 1 1 0 c 加热 3 3 s i l i c a g e lg s o l u t i o n红霉素 e e s甲醇 乙酸钠水溶液生物自显影 3 4 k i e s e t g e l m o t h e r e b e a e c e d a e a 二异雨醚 甲醇一氨水对甲轼恭苯甲醚 硫嗽一 1 72 5 4等乙醇 1 1 9 句 热 3 5k i e s e l z e ir a tu r i n ee a m e t a b o l i t e s二异丙醚 甲醇 氨水对甲氧基苯甲醛 硫酸 f 2 5 4 r a t乙醇 1 1 9 力 热 f a e c e s 3 6 k i e s e l g e l s o l u t i o n e a e b e c e 1 3 e e 二异丙醚 甲醇 氨水4 甲氧基苯甲醛一硫酸 乙 6 0 f 2 5 4 a e a e a e e 等二乙醚 甲醇一氨水醇 1 l 9 加热 二氯甲烷 甲醇一氨水 3 7w h a t i n a nf e r m e n a 竹桃霉索 乙酰竹桃 苯一环己胺 甲酰胺生物自显影 n o4p a p e r霉素 b r o t h 注 e r y t h r o m y c i na e a e r y t h r o m y c i nb e b e r y t h r o m y c i nc e c e r y t h r o m y c i nd e d e r y t h r o m y c i ne e e e r y t h r o m y c i nf e f d e m e t h y l e r y t h r o m y c i n d m e e e r y t h r o m y c i n e n o l e t h e r e e e a n h y d r o e r y t h r o m y c i n a e e r y t h r o l o s a m i n e e s m p s e u d o e r y t h r o m y c i n a h e m i k e t a l p s e a h k p s e u d o e r y t h r o m y c i n ae n o l e t h e r p s e a e e d e h y d r o e r y t h r o m y c i n d e e r y t h r o m y c i ns t e a r a t e e s e r y t h r o m y c i ne t h y l s u c c i n a t e e e s c p r o p i o n y l e r y t h r o m y c j n p e e r y t h r o m y c i ne s t o l a t e e e s l 1 2 12 气相色谱 气液色谱用于定量分析红霉素 利用火焰离子化检测器 f i d 从 e a e b e c a e a e s m p e 的混合物中分离出红霉素以及定量分析和分离红霉素片 剂中的e a e b 及e c a e a e s m 的成分 利用g c m s 和单离子检测器 s i m 可以检测牛肉和猪肉中的红霉素含量1 2 5 1 相关色谱条件列于表1 2 第一章文献综述 t a b l e1 2g cc o n d i t i o n su s e df o rt h ea n a l y s i so f e r y t h r o m y c i na n dr e l a t e ds u b s t a n c e s 2 5 3 8 c o l u m n s a m p l ec o m p o uc a r r i e rg a s t e m p d e t e c t i o n f l o wr a t e g l a s sc o l u n m1 8 5 0 3 m m b a l k e a p e eh 4 0m l m i ni s o t h e r m a lf i d a 3 o v 2 2 5 0 1 1g a sc h r o mq p o w e rc e b a e a i b 6 0 0m f f m i no v e n 2 7 5 g s m1 0 0 1 2 0m e s h b 3 p p e 2 0 a e s mh e l i u m 5 5m l m i n o rs u p e l c o p o r t8 0 一1 0 0m e s h g l a s sc o l u m n1 8 5 0 x 3 r a m t a b l e t se a e c eh 4 0m l m i ni s o t h e r m a l f i d 3 o v 2 2 5o ng a sc h r o mog s m b a e a a j r 6 0 0m l m i no v c l l 2 8 0 1 0 0 1 2 0m e s he s m h e l i u m 5 5m i m i n g l a s sc o l u m n5 0 0 x 2 r a m b e e fa a d红霉素h e l i u m 一6 0m t m i ni s o t h e r m a m s s i ma t 5 o v 1 0 1 8 0 1 0 0m e s hc h r o mwh i e c t o r 3 0 0 m z 2 0 0 h p o v e n 2 8 0 c s p b 一2 0 g l a s sc a p i l l a r y 3 0 m c a l g s u l e se a 竹桃5 m l m i n0 v e n l 2 5 f i d 07 5 m m d 1霉索 螺 l m i nt h e n 旋霉素 i p eb v1 5 泰乐菌 m i nt o2 5 0 素 i n j e c t o r 2 5 0 12 1 3h p l c 方法 h p l c 是一种被广泛采用的红霉素及相关化合物的分析方法 可以对各种不 同的基质进行定量分析 包括各种原料药 药物制剂和生物样品等 表1 3 列出 了原料药和药物制剂的色谱条件 表1 4 列出了生物样品的色谱分析条件 因为红霉素的结构中缺乏发色基团 所以需要较低的紫外检测波长 一般检 测红霉素及相关化台物的紫外波长定在2 1 5 r m a 而且在分析前必须进行柱前预处 理以去除干扰杂质 k i y o s h it s u j i 等人利用反相柱 相似的流动相 稍有不同的有机相和醋酸铵 缓冲液 相应的p h 为6 2 7 0 对红霉素及其衍生物进行分离 紫外检测波长 为2 1 5 r m l 为了缩短分析时间提高柱温到7 0 cb 9 4 5 4 1 o i u l i a n op e l l e g a t t a 建立 的色谱系统用于分析发酵液中的e a e b e c 和其它立体异构体以及降解产物 川1 h p l c 方法也用于e e s c 片剂中的红霉素检测t 4 2 1 制各h p l c p r e p a r a t i v eh p l c 方法利用折光测定法从发酵残渣中分离红霉 素及其相关物质 这些化合物随后用分析型反相柱 a n a l y t i c a lr e v e r s e d p h a s e c o l u m n 在4 0 和2 1 5 n m 下进行分析t 4 3 1 利用p a r t i s i lo d s 柱从红霉素的顾料 药中分离e e 还用于研究红霉素降解产物 两者的流动相稍有不同 p h 值由 第一章文献综述 6 5 调整为4 0 可以成功分离出e a a e e a e e p s e a e e 等物质 4 4 5 1 0 s t u b b s 和k a n f e r 在e e s 的片剂和悬浊液稳定性指示实验中发现 e e s 在甲 醇中不稳定 在乙腈中也有类似的现象 后来又用类似的h p l c 方法汪实了红霉 素及其酯类化合物在甲醇和乙腈中存在的不稳定的现象 7 4 8 1 o h p l c 方法加之不同柱子的切换技术 利用反相柱和乙腈一磷酸盐缓冲液 p h 6 5 t m a t b a 水的流动相可以实现e a e b e c e e e ep s e a e e e a e e 的 分离 鹕t5 棚 c a c h e t 等人优化了红霉素及其相关物质的h p l c 系统条件15 0 1 作者研究了 p h 值对e a e e e b a e a e a e d e c d m e e a 的k 值的影响 当