（机械制造及其自动化专业论文）细胞工程用微针的制备工艺研究.pdf

堡圭堕苎 塑堕三望旦堂笪竺型鱼三苎竖 摘要 微针是细胞工程实验的重要组成部分，其制作工艺的优劣直接关系到细胞工程实 验的结果。论文对微针的制备工艺过程( 包括微针的拉制、磨削以及锻制) 进行了详 细的研究，还通过多次实验总结出了拉针、磨针、锻针工艺中存在的问题，并提出了 相应的解决方案。文中还对微针的优化设计做了较深入的研究，通过对加热温度、拉 伸速度和拉伸长度的合理配置制造出各种规格的细胞工程用玻璃微针，在系统的总结 了前人优化设计中的数据处理方面成果的同时，给出了详细的优化方案，为细胞工程 用操作仪器的商品化作了详细的准备。 关键词：细胞工程，微针、制备工艺，优化设计。 堡主笙苎 塑堕三堡星垡笪塑型鱼三苎塑窒 a b s t r a c t a sak e yp a r to fc e l l e n g i n e e r i n ge x p e r i m e n t ，t h em a n u f a c t u r i n go fm i e r o p i p e t t e i n c l u d i n gt h ep u l l i n g t h eg r i n d i n ga n df o r g i n go fm i c r o p i p e t t ei sd i r e c t l yc o n n e c t e dw i t l l t h er e s u l to fc e l l e n g i n e e r i n ge x p e r i m e n t t h em a n u f a c t u r i n gp r o c e s so fm i c r o p i p e t t ei s d i s c u s s e di nd e t a i li nt h i s a r t i c l e t h r o u g hp l e n t yo fe x p e r i m e n t s ，t h ep r o b l e m sa n d s o l u t i o n sa r es u m m a r i z e d i nt h ep r o c e s so ft h ee x p e r i m e n t s ，t h eh e a t i n gt e m p e r a t u r e ， p a l l i n gv e l o c i t ya n dl e n g t ha r es e l e c t e dr a t i o n a l l y ，s ot h eg l a s sm i c r o p i p e t t eo fd i f f e r e n t s i z ec a nb ef a b r i c a t e d t h ed e t a i l e dc r a f to fo p t i m i z e dd e s i g ni s b r o u g h tf o r w a r db y s u m m a r i z i n g t h e p r e v i o u s d a t a p r o c e s s m e t h o do f o p t i m i z e dd e s i g n 。t h eo p t i m i z e d p a r a m e t e r so fp i p e t t ec a l lp r o v i d e ab a s ef o r t h em e r c h a n d i s eo f m i c r o i m p l e m e n t s k e y w o r d sl c e l l e n g i n e e r i n g ，m i c r o p i p e t t e ，m i c r o p i p e t t e f a b r i c a t i o nt e c h n i c s o p t i m i z e dd e s i g n 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：聋塑羔槲年7 月宁日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：訇酸一一2 啤年了月7 日 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 1 绪论 1 1 细胞工程技术 细胞工程是指在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或 基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技 术。细胞工程的优势在于避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗 传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞，因而能够提高基因的转移效率。 此外，细胞工程不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间 进行杂交，甚至可以在动物与植物与微生物之间进行融合，形成前所未有的杂交物种。 随着人类迈入2 1 世纪，作为前沿技术的细胞工程技术将会得到更大的发展。许 多细胞级操作：如植物细胞的染色体切割，细胞融合，动物卵细胞转基因注射等均成 为当前生物工程的研究热点。目前，经常用到的细胞操作技术主要包括细胞核移植、 细胞内药物注射，细胞核内d n a 注射、胚胎注射及细胞单个分离等。按操作性质分， 细胞操作主要分成两大类：细胞注射，细胞切割“。而目前最常用的是细胞微注射 技术。下面着重介绍一下细胞微注射技术及其发展状况。 1 - 1 - 1 细胞微注射技术 细胞微注射技术现在已经成为向活细胞体内引入物质的最佳方法之一，微注射使 得我们能够使用单细胞为研究对象，来研究体内复杂的细胞过程、结构和功能。可以 用于微注射的分子很多，如蛋白质、核酸等，都可以注射到细胞里面，并分析它们在 细胞内的活动情况。微注射可以应用在细胞学、细胞生物学、生理学、分子生物学、 发育生物学和药理学等领域。可以分析酶与酶系统的功能、细胞结构蛋白、激素的控 制机制、细胞内和细胞间的调控机制、信号传递与细胞周期研究、转运过程、蛋白质 生物合成和遗传信息的翻译与转录等“1 。 随着细胞微注射技术的广泛应用，对实验手段和实验设备也提出了较高的要求。 比如，设备操作的容易程度以及微注射量的控制精度等问题。在细胞微注射过程中， 微注射的量一般要求不超过细胞总体积的2 0 ，因此，对微注射量的可控性提出了 较高的要求“1 。 目前，定量微注射常用的有如下几种方法”。： i 、包被针尖法 在包被针尖方法中，将针尖( 密闭针) 浸到即将导入到细胞的物质溶液中。然后将 浸蘸有样品液的微注射针刺入细胞，样品在细胞质中溶解。这种方法虽然既快又简单， 堡主堕塞 塑堕三堡旦塑笪盟剑曼三苎堕塞 疆辩实际上簿入缓稳孛襻菇的量是难瑷控镱静e i i 、被动注射法 在被动注象方法串，锋中充满注翁溶液。溶滚静填充怒簌羧甄吸静幸# 麓，鼯将锌 管末端插入溶液中使其针头充满溶液。也可将针头髓于一定体积的样品中，使针的拜 藏蠛峦予甄吸俸惩褥充滚。将锌裁入绥庭零，撵鑫被动逡滚入缓稳孛。这秘方法逶受 了包被针尖方法所遇到的许多问题，包括由于针尖干燥使样品变性问题。另一个优点 是鼯入裂缨稳孛熬烧覆懿浓度是已疑戆，壤控裁注瓣载量壤建凌黪。这是瞧予对趣、 位艘以及导入样品进入细胞的速度无法精确控制。 疆i 、素续珏力法 相对予以上两种方法丽言，直接压力法微注射应用较为广泛。它对大墩的特异分 子热缨骢蛰架蛋自艨是绲鸯效豹。这转方淡有如下嚣耱不越静方式： 恒定流动恩微注射 恒定流动显微注射方淡最初是瞧g r a e s s m a n ( g r a e s s m a n n1 9 7 0 ；o r a e s s m a n 秘 o r a e s s m a n n1 9 8 3 ) 歼发成功的。他撼出一种非常优辩的方法将相对值定量的物质导入 到生长与玻璃器皿的培养缨胞中。淀射物壤的量取决于注射液中榉晶浓度、透过针尖 的德度和针尖停留程细胞质中的时间。然而由于该方法要耩确的测定样品溶液流过针 尖的速度是有一定阂难的，因此，想精确测定最后淀射入细胞中的溶液量是不可能的。 另该方法所需注射物质较多，困此时于十分宝贵的样品是不适合的。 脉i 巾流动没射 脉冲流幼注射方法可能楚当前簸为广滋使用的方法。冀主要潦遴是稠用压力控制 装鼹导入可控的脉冲气流来驱动一小份溶液通过针尖，从而实现寇量注射。 本谦麓新雳徽注射器疆与上述凡秘徽注莉方浓是截然不丽豹。箕徽注射基本舔 理主要是利用压电陶瓷的邀压电效应。我们知道，在压电陶瓷电介质极化方向加电场， 压彀陶瓷会产生瓿壤变形，当去箨多 热电蕴，莲电陶瓷瓣变形陡之消失。徽注菇蚕楚 利阁这种效应产生的惯性力将微针中的液体喷射到细胞中的，如果在压电陶瓷上加上 羯麓淫静脉冲信号，镞钎串毽将嚣赣悭建喽薅窭定豢匏液体，簸两实瑶量鼙控。 1 。1 2 组憋赣注射技术发震获淀 慰活缨瑰豹要徽操穆起始予2 0 世纪麓耱半酵，营宠疲建予龟黛毽魏璎究。套4 8 年代后期，建立了细胞内记漾的可靠方法。在以后不到十年间，使用类似的技术直接 将黛甥物质转送到缨魏悫( c h a r a b e r s & c h a m b e r s1 9 6 1 ) 。起秘皴注射躺霆懿爨是培莽的 受体细胞中转移哺乳动物的细胞核( r a e s s m a n n1 9 7 0 ) 和染色体( d i a c u m a k o s1 9 7 3 ) 。 随麓物质的提缝霸设冬懿改避，已经姥够角缨臆内转移不弱来源麴大分子溶滚，继如 病毒r n a ( g r a e s s m a n n r a e s s m a n n1 9 7 6 ：s t a c e ye ta 1 1 9 7 7 ) 。纯化的蛋白质和 2 硕士论文细胞工程用雌塑型叠兰兰婴塑 病毒d n a 。人们采用丽样的方法，利用微注射把d n a 转移到疑精卵中。不久入们搬 重组基因稳定地引入到鼠生殖细胞系中。从此以后，微注射成为转基因动物研究的常 援方法，广泛遮应袋子活细簸的研究中，懿旗因表达、信号转导或缀胞骨絮研究等”n 当今世界的其它国家对微注射技术的研究方兴来艾。美国、日本、加拿大、瑞舆 等鬣家都有不溺类甏鼹微注辩梳器入静密魂，其孛特舅著名酌有美溪懿s u t t e r 公磷 和日本的尼康公司，但他们凝同的特点是微注射时通过对气体压力的控制来实现对泣 象爨翁控销翁灌。臻院较露害，在谶海，美予这方瑟懿疆究裁菲嚣熬多，涛拜大学 机器人与信息自动化研究所主要对细胞染色体切割的微操作机器人进行了定的研 究，辫显也毅褥了一定茨残绫。露索蓬工大攀微系绫磷究室主要集中予嚣邀驱动徽泼 射机器人系统方面的研究。 综合 嚣蠢，与嚣步 裙魄，鏊瘫徽注袈领域磅变瓢篷篦较薄弱，炎金投入不是，豢 待予进一步的发展。 1 2 论文背景和主要工作 本论文麴辑究鹜荣是江苏害毫技零研究许麓鬃藏工程嚣；镶操露撬器a 系统及箕 配套设备的i i f 制( 项目编号b 6 2 0 0 1 0 2 3 ) 。南京理工大学机械工程学院微系统研究窝 承提了该课题懿臻键任务。魏羲嚣述，壶予我嚣在绥慈搡终仪器系统方嚣懿姘究还不 够，因此，目前细胞操作仪器系统全部依赖避口，外商一般将微注射器及其附属设铸 敷控铮莰、壤铮纹、锻铮仪滋露摇绑式锷罄。表1 。2 1 为绥蕤工程仪器系统熬缨或及 国外售价。 蔽i ，2 。l 缨燕工毽仅嚣系绫豹缀妓及謦势售羚 图外同类产品售价 序号名称备注 ( 万元入疑西) 1 显微操作仪 1 3 液压传动式 鼹溪塞式 2 显徽注射仪 1 8 3 拉赞纹 2 。4双辩控铡 4磨针仪4 3配备患微镜 5 锻针仪 6 7 双电流精密调节 从表1 2 1 中可以看出微拉针仪盼售价约在3 0 0 0 美元旋右，磨针仪( 含显微镜) 的售价约在5 0 0 0 美元左右，锻针仪馋价约在8 0 0 0 美咒左右，配套购买的话需要1 6 0 0 0 美元。而配备专用拉钟所需的毛细玻璃管，荦只售价近1 元入民币，由于所俦微拉针 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 仪在拉制微针时是根据该配售毛细玻璃管材料及规格制定的，拉伸工艺参数制作成数 个模式固化到机器的控制芯片中，当我国用户试图利用该拉针仪用国产毛细玻璃管为 原材料拉制微针时达不到微注射的基本要求，只能靠购买进口毛细玻璃管，由于微操 作的成功率仅在1 0 左右，且玻璃微针只能一次性使用，我国每年消耗的玻璃微针数 量巨大，所耗费用极高，因此微针技术国产化是一个非常紧迫性的课题”。但微针的 国产化问题就牵涉到微针制作设备的设计、微针工艺参数的优化、微针各种几何参数 的检测等问题。 在微注射过程中，微针几何参数对微注射性能起到至关重要的影响，如果不能准 确地制作出微针，微注射注射量是根本无法得到控制的。因此，微针制备技术对本课 题来说是个重点、难点，本人正是在这样的背景下致力于本课题的研究。 在此课题研究过程中，本人主要完成的工作如下： 论文的第二章完成了对微针用材料的分析与选择，并最后总结出了材料的主要成 分。 论文的第三章完成了微针的拉制，并对微针的拉制过程以及影响参数做了详细的 介绍，通过大量的实验数据总结出了微针参数优化的理论依据，为拉针仪的商品化奠 定了理论基础。 论文的第四章完成了对微针磨制，并对微针磨制过程中以及影响参数做了详细的 介绍，分析微针磨制过程中出现的问题并提出了详细的解决方案，为磨针仪的商品化 奠定了基础。 论文的第五章完成了对微针的锻制，并分别介绍了断针、弯钩及墩粗的原理及工 艺过程，最后总结出了微针锻制的参数及影响因素，为锻针仪的商品化奠定了基础。 论文的第六章对整个课题进行了总结。 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 2 微针用材料的选择 2 1 微针对材料性能的要求 根据细胞操作的特点，对细胞操作用的微针提出了如下的几点要求“1 ： ( 1 ) 定的化学稳定性：在细胞注射时，由于细胞培养皿中的培养基溶液要具有 细胞正常的生存环境，因此可能会具有一定的酸性或碱性，且微针中的样品溶液也可 能具有一定的酸性或碱性。因此，对细胞注射用微针材料就有特殊的要求，即要具有 较强的化学稳定性，能够抵抗一定的酸、碱性。 ( 2 ) 较好的工艺温度特性：细胞微注射对微针的直径提出了较高的要求，般 在几个微米左右，如此小的直径一般只能采用拉制的方法，而拉制时要涉及到加热温 度的问题，因此，这种材料要适于采用拉制的方法。且工艺温度一定要恰当，不能太 高，否则很难加工。 ( 3 ) 一定的机械强度：首先微针需要与注射器联接，另外，微注射时，微针需 要扎入细胞核内，细胞本身具有一定的韧性，因此，对微针就提出了一定的机械强度 要求。 ( 4 ) 一定的清洁度：微针由于内径很小，能够达到几个微米，如果稍微有杂质 就容易堵死微针内径，因此对材料的清洁度有很高的要求。 ( 5 ) 良好的磨削加工性能：由于微针在细胞注射时要磨成不同的角度，因此要 求材具有良好的磨削性能。 2 2 玻璃的主要原料 玻璃的主要原料或玻璃形成原料可分为酸性的、碱性的和碱士性的，按玻璃组成 中最常见到的各种氧化物可以把玻璃分为以下几类“”2 “： 酸性氧化物：研。、最g 、彳乇q 。 碱性氧化物：n a ，0 、墨0 。 碱士性氧化物：c 矗0 、m g o 、p b o 、z n o 、b a 0 。 ( 1 ) 用于供给玻璃中酸性氧化物的原料的性能分析 砂：砂的品质好坏可以用颗粒的大小和杂质的含量来评定。中等细度的砂是 最适用于熔制玻璃的，它们的颗粒大小范围是从0 5 m m 到0 2 5 m m 。砂中的o ，的 含量越接近1 0 0 。也就是砂中的杂质越少，则砂的品质越好。砂中常见的有害 杂质是铁的氧化物( f e ，0 3 ，f e o 等) ，因为在玻璃中即使铁的氧化物含量很少， 也能使玻璃带有绿色。 硼酸：硼酸h ，b q 是供给玻璃中所需得氧化硼，氧化硼的熔化温度是7 5 0 c 。 5 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 当硼酸受热时，分解为氧化硼与水，氧化硼进入玻璃组成中，而水在熔制时就挥 发出去。使玻璃具有许多优良的性质：它加速玻璃的熔制过程，使玻璃具有较大 的流动性，提高玻璃的化学稳定性和热稳定性。 三氧化二铝：在玻璃中加入少量的爿厶戗( 3 ) 将大大地降低玻璃的结晶倾 向，增高玻璃的化学稳定性和热稳定性。但是，应该注意，大量的爿厶n 可使玻 璃的熔制过程遭遇困难，它提高了玻璃熔体的粘度和玻璃熔体加速凝固一“快 凝”。 ( 2 ) 用于供给玻璃中碱性氧化物的原料性能分析 苏打：大多数的玻璃组成中都引入有碱性氧化物。只有少数用作制造具有特 殊工业用途制品的玻璃，例如，用作电绝缘材料的玻璃，不含碱性物质。玻璃中 的氧化钠是用苏打或硫酸钠引入的。苏打受热分解生成q 0 和a 9 ，n a ，0 进入 玻璃组成中，c a 在熔制中挥发出去。 n a 2 c q = n a 2 0 + c 0 2 在玻璃熔制中所用的苏达主要是由化学工业供给的。苏打是微细的白色粉末，易 溶于水，是一种含杂质很少的产品。在苏打中常见的主要杂质为氯化钠，它的含 量一般不超过0 5 0 8 。无水苏打含碳酸钠约在9 8 5 左右。 硫酸钠：和苏打一样，含有氧化钠。硫酸钠加热分解生成氧化钠和三氧化硫。虽 然硫酸钠是天然出产的，面价格也较苏打便宜，但是在玻璃熔制中使用它时，将 引起一系列的极大不便。 i 、即使有碳存在，硫酸钠的分解仍较苏打困难，因此玻璃熔制需要在较高的温 度下进行。 i i 、已经熔化而未起作用的硫酸钠，常浮至玻璃熔体的表面，使制品产生缺陷。 i i i 、含有硫酸钠的配合料在熔制时，放出刺鼻的二氧化硫气体。 、当用硫酸钠配合料熔制玻璃时，大大地加速对玻璃熔炉耐火砖的破坏。 但是，由于苏打的原料资源不足，并且尚需要使用于国民经济的其他部门中， 所以到目前为止有很多玻璃工厂在配合料中仍采用一部分硫酸钠。 碳酸钾：世：c q 是用来供给玻璃中的氧化钾，碳酸钾受热时，依下列方程式 分解成氧化钾和二氧化碳： k # o 产k l o + c 0 2 氧化钾存在于玻璃中使玻璃增加光泽，降低玻璃的结晶倾向和使玻璃容易制 作。在熔制颜色玻璃时，氧化钾能使玻璃具有比较纯净的颜色。 ( 3 ) 用于供给玻璃中碱士性氧化物的原料 碱士性氧化物是所有玻璃中的必需组成部分。最主要的碱士性氧化物是c a o 和 硕士论文 细胞工程用微针的制备工艺研究 m g o 。在制造玻璃器皿中也引入比较少量的氧化钡以增加玻璃的光泽，氧化锌 z n o 主要引入技术玻璃的组成中，使玻璃具有较高的化学稳定性和热稳定性。 2 3 玻璃材料的性能分析 综合上述几个方面的要求，考虑到各种材料的性能，粗略选择玻璃为微针的材料， 但是玻璃由于成分的不同，其物理、化学性能相差很大，因此，在玻璃的组成成分上 还要进行选择，当然，玻璃成分的选择还要从成分对上述几个方面性能的影响上进行 入手。 ( 1 ) 化学稳定性方面 从玻璃结构影响的角度 大量的学者对玻璃的化学稳定性进行了较长时间的研究，结果有些学者认为玻璃 的化学稳定性是和玻璃的结构密切联系在一起的，斯达威尔斯等认为化学稳定性是由 玻璃结构的化学键来决定的。化学稳定性好的玻璃，必须具有强大的结构网能量，而 同时具有大的机械强度与硬度。 而帕立需等认为化学稳定性好的玻璃必需有两个条件：i 、玻璃网状形成物比例 要多；i i 、网状结构形成物的阳离子电荷要多，直径要小。 从这两种假说出发，化学稳定性好的玻璃成分应该是： i 、由于成4 + 与口“能形成玻璃中的网状形成物，因此，4 + 与b “比例应该多些， 也就是应采用高硅氧与高硅硼硅酸盐玻璃。 i i 、考虑到阳离子的高电荷和小体积，在网状形成物中，应采用4 + 与b “。因彤4 + 在四价的网状形成物中，半径是较小的( 如4 + 的半径r = 0 。3 9 埃，而g e 4 + 的r = 0 4 4 埃) ：而且“在同电荷的阳离子中，半径也是较小的( 如b “之半径r = 0 2 5 埃而矿“ 的半径r ：0 6 5 埃，一s “的半径- = 0 6 9 埃，鼬“的半径1 - = 0 9 0 埃) 。 从受侵蚀的机理来考虑 玻璃防止被侵蚀的机理是保护膜( 凝聚物) 的生成，不同成分的玻璃其凝聚物情 况是不同的，可分为下列三个类型： i 、不形成保护膜的凝聚物。如磷酸盐玻璃及石英玻璃。磷酸盐玻璃继续溶解， 故其化学稳定性很差。石英玻璃根据邦达威金的研究，在3 1 0 。c 时，石英玻璃的溶解 速度比其它玻璃大得多。 i i 、形成多孔状保护膜的凝聚物。如m r ：0 n s i d 2 玻璃，在水解时，r ：o 溶解于 水，而所q 也有部分溶解，但大部分形成多孔状的保护膜，这种保护膜仍不够稳定。 i i i 、形成复杂保护膜的凝聚物。如硼硅酸盐玻璃，在硼硅酸盐中，根据研究，认 为加入氧化硼达8 1 0 ，此时在j d 一口：0 3 一s i o ：系统中形成 x 切，0 飓0 3 z s i o ，凝聚物，则以x = 0 0 8 1 0 1 3 、y = 0 0 6 1 0 0 8 7 、z = 0 8 硕士论文 细胞工程用微针的制备工艺研究 0 8 5 比较稳定。复杂的凝聚物常常会分解为简单的凝聚物，这些过程是很复杂的， 所以从生成保护膜的稳定性看来，在玻璃中加入适量的氧化硼能够大大提高其化学稳 定性。 从温度影响大的角度来考虑 水溶液的侵蚀爿是一个动力学过程，它的温度关系应服从下列关系式： a = k e x p ( 一点0 g r ) 或l o g a = k l e 4 5 t ) 式中置及k 。为常数，e 二为过程的活化能。大量的实验证明了上式，并提出了活 化能的数值，对大多数的玻璃来说，这个数值在8 0 千焦摩尔附近，因此与n a + 离子 扩散活化能相当。将玻璃组成进行系统改变所作研究结果在数值上虽有差别，但差别 很小，不足以引出其他结论。活化能8 0 千焦摩尔意味着在o 1 0 0 。c 区域内温度 升高2 0 k ，侵蚀成度增大l o 倍，也就是说在室温时玻璃是十分稳定的，丽在1 0 0 度时 出现较大的侵蚀。 从膨胀系数的角度来考虑 玻璃的膨胀系数是表示了玻璃结构的松紧程度，结构愈紧，其膨胀系数愈小；结 构愈松，其膨胀系数愈大。帕立需认为玻璃化学键愈强则膨胀系数愈小，且玻璃的化 学稳定性常常和膨胀系数联系起来，具有高的化学稳定性的玻璃常常具有低膨胀系 数。 有些成分如z r o ，、s n d 2 、彳f 2 q 、b q 有时为力d 2 ，在加热时会发生紧缩的可能， 因而降低玻璃热膨胀系数。当有较小的热膨胀系数时，这些成分可以降低硅氧化物的 热膨胀。碱性氧化物如n a 2 0 、k 2 d 可使玻璃结构松弛，因而增加了玻璃的膨胀系数。 二氧化锆和二氧化钛，通常认为有二氧化硅存在。可以到玻璃网状结构中去，根据丁 不列拜、英格里许的研究，认为以z r 0 2 去代替鄹0 2 、c a o 、m g o 、d 2 0 可使膨胀 系数下降。根据罗姆等研究，以n a 代替所0 2 、c a o 、m g o 时，其膨胀系数是下降 的。 图涅尔等的研究结果表明以n 。 代替n a ，0 时，其膨胀系数也是降低的，但不如 受0 2 、县d 3 及g g o 能降低膨胀系数。力0 2 是很复杂的，与玻璃原始成分有关，与研0 2 含量有关，0 含量影响到n d ，进入网状结构中。故阿本求出了乃d 的加和性系数 与蛾d ，含量的关系式： a t i x l 0 7 = 3 0 一1 5 ( a 一5 0 ) 口一克分子含量，此式适用于8 0 s i o2 5 0 时。 碱士金属氧化物对玻璃膨胀系数的影响，排成下列减增次序 b e o _ z n o _ n i o c o o 斗f e o ( f e 2 0 3 ) 哼m g o 呻m n o m n 2 0 3 一c d o - - p b o 一s r o 斗b a o 硕士论文细胞工程用微针的制备工艺研究 碱金属氧化物之离子半径愈大。则愈能使结构松弛，增加膨胀系数也愈多，通常 可按渐增方向，排成下列次序： 弛0 - n a 2 0 一坞。 根据以上的研究结果，从降低膨胀系数出发，应按下列原则来考虑玻璃成分： i 、应多加玻璃网状形成物，如多，则膨胀系数减小。 i i 、在网状形成物中，应加入能形成紧密结构的氧化物。如在硼硅酸盐玻璃中加入 少量的碱性或碱士性金属氧化物，促进 丑0 4 】、 b 0 3 】。紧密结构的生成。 i 、加入电荷大而离子半径小的网状改良物。 、尽量少加电荷小而离子半径大的碱金属氧化物。 v 、尽量少加除氧以外的其他阴离子，也就是少加氟化物与硫化物。 ( 2 ) 工艺温度特性方面 一般玻璃成分中，通常包括两部分氧化物，及网状形成物与改良物，而不同的形 成物与改良物对玻璃的稳定性、熔点有较大的影响。 从网状形成物来看，对我们有用处的是所4 + 与四“，其它一些网状形成物如p “的 稳定性不够。 4 + 可以单独形成玻璃，此种玻璃即是石英玻璃，键的强度很高，所以其性能很 好，但比较难熔，成型也困难。b “也可单独形成玻璃，此时是以 b q 】的结构出现 的，但是其化学稳定性及热稳定性都不好，所以不会采用单纯的岛q 的玻璃。在q 与岛q 二元系中，当二氧化硅含量在5 0 以上，熔化就困难了。即使二氧化硅含量 在2 5 ，在1 5 0 04 c 下熔化也需要4 5 小时。二氧化硅含量再多，则粘度更大，同时 其性质并不理想，且熔化困难，显然不宜采用。 因此，我们可以看出单独使用网状结构形成物来制造玻璃，还存在很多问题。在 玻璃中必须加入一些网状改良物。加入的改良物，希望阳离子电荷小，而离子半径较 大，使m e 一0 键减弱，起助熔作用，同时也可得到所需要的性能。考虑到这一点， 故在玻璃中可加入网状改良物，成为多元系统。最常用的是在b ，qj 所d ，系统中加 入 f ，成为b ：0 3 斗彤0 2 _ n a 2 0 系统。在这种情况下，b ”的配位数改变了，既有 口d 4 】也有【口0 3 ，且 b d 4 】与【b d 3 】按一定的比例，使玻璃结构变得很紧密和稳定。由 于 矿的加入，使得玻璃易熔，即具有较好的温度工艺性能。如有爿f q 少量的加入， 更能构成具有高度稳定性的玻璃，此种玻璃较含有同量二氧化硅的其它玻璃具有较低 的熔点。 ( 3 ) 机械强度方面 玻璃的理论强度约1 0 3 公斤毫米2 ，但是，实际玻璃强度却非常低，只有3 5 公斤毫米2 ，这可以解释为：主要是因为玻璃表面上有细微的伤痕或裂纹所致。为 提高玻璃表面强度，最好使表面产生压应力层。在实际上进行强化时，可分别使用物 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 理及化学两类方法。 物理强化 i 、表面积冷法：将玻璃加热至软化点温度附近，均匀地急剧冷却，由玻璃内外 面温差造成的热应力，在固化的玻璃表面产生了压应力层。从而使玻璃的机械强度增 加。 、溅射侵蚀法：玻璃在机械研磨的过程中，在表面上产生的微细伤痕。然后又 以高频或离子束溅射玻璃。其强度增大。但是由于溅射本身也将造成细裂纹，自然地 使此种强化法受到某种局限，使其强度远远低于理论值，或者只能增大至一定限度。 化学强化 化学强化的原理，即以化学方法改变玻璃表面的性质或组成，增大玻璃的强度。 其中一种方法是用化学药品处理，出去表面的微小裂痕：另一方面是通过离子交换， 改变表面之组成。 i 、将玻璃棒以流水或热水处理时，玻璃表面或者变得光滑，或者失去光泽。当 玻璃保持其光学透过率时，强度增大5 6 倍左右，这是由于除掉了表面微小的裂纹 等缘故。 i i 、离子交换强化法：把玻璃浸在高温熔融盐中，玻璃中得碱离子与熔盐中的碱 离子因互相扩散而发生离子交换，因在交换层产生压应力而使强度增大。此法可以大 致分为二类。 a 、高温型离子交换法：在玻璃的软化点与转变点之间的温度区域内，把n a 2 0 或 k 2 0 的玻璃浸入n 的熔盐中。使玻璃中的n a + 或者k + 与比他们的半径小的熔盐中的 上f + 相交换，然后冷却至室温，由于含三+ 的表层与含n a + 或者世+ 的内层膨胀系数不 同，表面产生的残余压应力而强化。同时，玻璃中如含有爿厶d 1 、n 0 等成分时，通 过离子交换，能产生膨胀系数低的一l i 辉石( l i z o o a l 2 q 4 s i 0 2 ) 结晶，冷却后的 玻璃表面将产生很大的压应力，可得到强度很高的玻璃。 b 、低温型离子交换法；在不高于玻璃转变点的温度区内，将玻璃浸在含有比玻 璃中碱离子大的碱离子熔盐中。例如，用n a + 置换工f + ，或用置换n a + ，然后冷却。 由于碱离子的体积差造成表面压应力层，提高了玻璃的强度。虽然比高温型交换速度 慢，但是，由于强化中玻璃不变形而具有实用价值。 ( 4 ) 材料清洁度方面 清洁度的判断方法：判断玻璃表面是否清洁，有阱下各种方法。 i 、呵气法。向清洁的玻璃表面上呵气时，会生成均匀的微小水滴；而在不清洁 的表面则产生特别吸附状态的水滴。 i i 、浸润法。把水或酒精滴在玻璃表上时，在清洁的表面上会产生圆形的均的 浸润：不清洁的表面的浸润则是不均匀的，周围的边界成锯齿形。这与水对清洁 1 0 硕士论文 细胞工程用微针的制备工艺研究 玻璃的浸润角接近零有关。 i i i 、成膜法。在往玻璃表面上涂金属皂的薄膜时，水面上的单分子皂膜不能顺利 地移向不干净的玻璃表面。 、将玻璃表面清洗的非常洁净时，其静态摩擦系数将变化得很大，而如果有油 脂等存在时，则将下降。据此可以半定量地判断玻璃的清洁度。( 玻璃的静态摩 擦系数可以通过表中查询) 。 清洁方法：虽然有种种清洁玻璃表面的方法，但是，有时对某种用途或使用 方法说来是清洁的表面，对其它目的则是不清洁的，所以，应当针对具体的 使用目的，考虑清洁法。 i 、用有机化合物蒸汽处理，对除去有机油脂类很有效。但是，应该按照附着物 的种类，选择得当，经常使用的有三氯乙烷、二甲苯、乙醇等。不过应当注意， 他们会吸附在表面上。 、有机溶剂处理：当附着物能溶解在有机溶剂中时，或者能与有机溶剂生成鳌 合物时采用此法。 i 、热处理：为除去吸附着的有机物和水，常采用加热法。例如可以把要洁净的 玻璃放在真空中加热，会更有效地除去表面不纯物。 、碱溶液处理：为清洁玻璃表面，采用强碱性溶液，尤其是用热溶液处理，会 起到将表面剥离一层的作用，所以，能除去表面的附着物，得到平滑的表面。但 是长时间浸泡反而会使表面变粗糙。 v 、酸溶液处理：用酸清洗时，在除去表面附着物的同时，靠近表面层的碱离子 也会被溶出而生成富集肼。 的表面层。当使用重罗铬酸溶液时，会将有机物氧化 而除去，还能去掉表面上附着的盐类。然而，被吸附在表面上的c ，离子很难去 掉，而使用硝酸可以防止d 离子吸附。 、用氢氟酸处理：剥离表面被氢氟酸侵蚀，发生如下的反应： 钳0 2 + 4 h f = s i f , + 2 皿0 有时使用1 ：1 的9 8 的h 2 s o , 与4 8 的爿f 酸的混合溶液。在钠钙硅酸盐玻璃的 情况下，能生成c a s 0 4 ，使玻璃表面慢慢变得平坦。 、水洗：水作为洗涤剂其作用虽然不大，但是，在使用了酸或碱溶液之后，必 须以除去酸或碱。 但是，对任何场合都通用的最完善的洗净方法是难于得到的。因此，在选 择洗净方法时，应当仔细考虑玻璃表面的性质、附着物的种类，洗净后的使用 目的等诸如此类的问题。 ( 5 ) 玻璃的磨削加工性方面 玻璃实际上时一种粘性极大的“固态液体”。它与固态金属的不同之处在于，在 硕士论文 细胞工程用微针的制备工艺研究 熔融状态时可以自由运动的固态金属原子在冷态下可以形成清晰的三维晶体结构，而 玻璃在室温下仍保持其无序的非晶体结构。玻璃组成的成分的不同对其磨削加工性能 有很大的影响。具体影响见表2 3 1 表2 3 1 有利及不利于磨削性能的各种成分对机械执行的影响 有利于玻璃磨削性能的成分及其特征 尸b o使硬度减低 不利于玻璃磨削性能的成分及其特征 使抗压强度显著增高 所d 2 使冲击强度、硬度、抗弯强度、抗张强度、抗压强度增高 岛q m g o 使冲击强度、硬度、抗弯强度、弹性系数、抗压强度增高 使冲击强度、抗张强度、抗压强度、弹性系数增高 4 f 2 0 3 c a 0 弹性系数、硬度、抗张强度( 抗弯强度) 增高 b a 0 使硬度、抗张强度( 抗弯强度) 增高 2 4 材料的选择结果 综合上述的分析，细胞微注射用微针的材料适宜选用硼硅酸盐玻璃，且其中的成 份需控制在一定的范围内，我们选用的硼硅酸盐玻璃的组分如下所示： d 7 4 8 爿f n 3 5 尻n 1 4 5 瓦d 4 5 疋0 0 5 其软化温度为7 7 0 1 0 。 2 5 本章总结 本章主要介绍了以下几个方面的内容： ( 1 ) 介绍了微针对材料性能的要求，为微针材料的选择做了基础。 ( 2 ) 介绍了玻璃的主要原料和组成，并分析了玻璃各组分对玻璃的影响，为玻 硕士论文细胞工程用微针的制备工艺研究 璃的制造提供了参考依据。 ( 3 ) 对玻璃材料的性能进行了分析，主要分析了这些性能的影响因素，从而对 玻璃的选择做了有利的依据 ( 4 ) 确定了材料的选择结果。 硕士论文 细胞工程用微针的制备工艺研究 3 微针的拉制 由细胞微注射的实际情况需要，对微针的外形提出了如下图所示的要求 3 1 微针拉制的原理 图3 1 微注射用微针外形图 针尖斜角微针内径 由玻璃成型理论可知，玻璃液的粘度值决定了玻璃成型的温度范围，固化速度值 决定了玻璃成型中各个操作工序的延续时间，拉制工艺参数的控制失调，将导致针管 弯曲，在针管处出现气隙、条纹、结石、析晶等现象“。拉制的加热温度、加热时 间、拉伸速度、加热和拉伸之间的顺序和时间间隔以及加热线圈的长度都是关键的工 艺参数。 经实验证明采用等速拉伸不能满足要求，玻璃加热的熔化时间也不能精确控制， 这意味着通过检测玻璃管熔化温度控制拉伸的开始时间，通过电机及螺旋传动使卡头 下移拉制微针的工艺方案不可行。实验表明，只有拉伸速度逐渐加快才能拉制出如此 细的针头( 且为锥形) 。由于拉制时间仅1 秒左右，靠机械调速方式达不到如此快的 反应速度。电磁卡头变速拉伸和重物拉伸都符合变速拉伸要求。电磁卡头变速拉伸可 通过调节卡头线圈电流来改变拉伸速度及拉力，但成本高且结构复杂。而重物拉伸的 速度变化唯一且可知，拉伸力可以通过增减砝码来调节以适应不同规格的玻璃管，结 构简单、成本低且工艺稳定。为此南京理工大学微系统研究室设计了可改变各项工艺 参数的的微针拉针仪“”。设计时尽量使拉针仪适合拉制微管道，拉针仪的外形图如 图3 1 1 所示。 拉针仪拉制微针时的工作原理如下：硼硅酸盐玻璃毛细管装夹在固定卡头和活动 卡头之间。活动卡头的底部配有可改变重量的砝码块，当加热丝通电时，硼硅酸盐玻 璃管将受热变形，当温度达到硼硅酸盐玻璃的塑性加工工艺温度时，在砝码的重力作 用下，硼硅酸盐玻璃管将被拉长，最终可形成半成品的微针。通过调整调压器可以调 硕士论文 细胞工程用微针的制备工艺研究 整加在线圈上的电压值，从而可以调整加热温度。调整时间继电器初值，可以改变加 热时间。而加热线圈的圈数及砝码重量均为可调的，从而可以改变微针的几何参数。 拉针仪拉制微针时的原理图如图3 1 2 所示： 图3 1 1 拉针仪外形图 加热 线圈 图3 1 2 拉针仪拉制微针时的原理图 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 图3 1 3 加热电阻丝 3 2 微针拉制的仪器设备和材料 ( 1 ) 拉针仪( 图3 1 1 ) 拉针仪包括拉针器，继电器控制柜和可调式变压器。 ( 2 ) 外径中1 6 姗、中1 2 f i m i 硼硅酸盐毛细玻璃管。 3 3 微针的拉制的工艺过程 微针的拉制过程可以包括：毛细玻璃管的安装、毛细玻璃管的拉制、以及拉好后 微针的拆卸。具体过程如下： ( 一) 毛细玻璃管的安装 ( 1 ) 检查设备、线路连接是否正确。 ( 2 ) 打开继电器控制柜开关。 ( 3 ) 使用最大行程控制螺栓。 ( 4 ) 取下玻璃管上夹头，夹紧玻璃管，使其端部露出，穿过加热丝垂直放置。 ( 5 ) 调整下夹头位置，上下调整整个活动卡头至适当位置( 以抬起上块至螺栓最 大控制位置，并可使活动卡头夹住玻璃管下端约l o m m ) 。 ( 6 ) 拧紧活动卡头夹紧玻璃管，并使上块固定在螺栓最大控制位置不滑落。 ( - - - ) 毛细玻璃管受热拉成微针 ( 1 ) 先把电源开关关闭，然后调整加热丝电压到事先设定的温度。 ( 2 ) 打开开关，加热丝开始对毛细玻璃管加热。 ( 3 ) 玻璃管受热并融化，在下卡头重力作用下，拉伸延展并拉断成两部分，形成 微针。 ( 三) 徽针的拆卸 ( 1 ) 等微针形成后首先把电源关闭。 ( 2 ) 先让加热丝和微针在空气中冷却一段时间。注意不能等加热丝刚停止加热就 把微针取下，因为那时候微针和加热丝温度都很高，直接拿下的话容易使微 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 针尖部发生弯曲。 ( 3 ) 等微针和加热丝冷却下来后，首先把上卡头部分取出，取出时要使微针垂直 取出，如果稍有偏斜，就容易使微针针尖碰到加热丝上，而使针尖碰断。 ( 4 ) 取出上部的微针并把它放置在一定的位置后，再松开下卡头的旋紧螺母，用 手慢慢地把微针取出并存放于一定的位置。 在宏观下看到的实际微针( 图3 3 1 和图3 3 3 ) 图3 3 1 中1 2 咖毛细玻璃管拉制的微针 图3 3 20 1 6 咖毛细玻璃管拉制的微针 堡主堡苎 塑塾三矍旦丝丛箜型鱼三茎堕塞 用c c d 技术的显微镜下拍摄出微针的图像( 图3 3 4 ) 图3 3 3 在显微镜下拍摄到的微针 3 4 徽针拉制时的注意事项 由于微针材料选用的是玻璃，脆性大，拉制过程中会遇到下面一些问题： ( 1 ) 毛细玻璃管的对心 在活动卡头上把毛细玻璃管固定好了以后，在往活动卡头上装夹时一定要小心， 并且保证固定卡头的中心、玻璃管的轴心以及活动卡头的中心在一条直线上，假如有 偏心的话，拉制过程中就会使毛细玻璃管受力不均匀，拉出的针尖就会出现弯曲现象。 ( 2 ) 毛细玻璃管的装夹 毛细玻璃管安装在上卡头和下卡头之间时旋紧力一定要适中。 安装在上卡头时，上卡头的螺母旋紧力不能太大，太大容易把毛细管给夹断：太 小的话就不足以把毛细胞玻璃管给卡住，通过加热丝安装在下卡头后，就会在下卡头 重力的作用下没有受热而直接滑下来，从而无法拉制微针。 从玻璃管安装在下卡头到整个微针拉制形成过程中，活动卡头夹住玻璃管后下部 不受力，都是靠下卡头和玻璃毛细管之间的摩擦力来维持平衡的，所以安装时更要特 别细心。下卡头的旋紧螺母不能拧得太松或者太紧。旋得太松的话，毛细玻璃管和卡 头的摩擦力小于卡头部分的重量，在卡头重力的作用下使微针在装夹时就被拉断；旋 得太紧的话，由于玻璃毛细管的脆性很大，在旋紧过程中可能由于旋紧力太大而把毛 细玻璃管给夹断。因此旋紧时旋紧力大小要适中，具体的旋紧力可以用测力扳手来确 定，或者根据经验来确定。 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 3 5 徽针拉制时对参数的控制 拉制微针时可以调节的参数包括加热电压( u ) ，加热长度( 1 ) ，拉制重力( g ) 。 拉制时对微针的影响如下所述： 拉制微针对电压的控制 为了找出电压对微针的影响，固定合适的加热长度( 1 ) 和砝码重量( g ) 值，改变加 热电压( u ) ，可分别得到微针内径d ( 肛m ) ( 表3 5 1 ) 的原始数据。 实验参数为：加热长度( 1 ) ：5 m m ；砝码重量( g ) ：1 5 k g ：硼硅酸盐玻璃管：外径 1 6 m m ，内径1 o m m ，长9 0 r a m 。 表3 5 1 微针内径和加热电压关系的原始数据 微针编号加热电压u ( v )微针内径d ( um ) 0 1 #4玻璃管没有达到熔点被拉断 0 2 #51 4 0 3 #71 2 8 0 4 #91 1 2 0 5 #1 11 0 0 6 #1 3 9 5 0 7 t t1 58 9 0 8 #1 77 o 0 9 #1 96 8 1 0 #2 15 9 1 l #2 3拉成微管道 1 2 #2 4 加热丝被烧断 从表3 5 1 可以看出，电压对拉出的微针有很大的影响，因为电压太低，电阻 丝不容易发热，即使有一定的热度，对要拉制的玻璃管来说，也达不到玻璃的熔点而 不能变软，例如，当电压低于5 v 时，毛细玻璃管由于没有达到熔点而被拉断；但是， 如果电压太高，可能出现下面两种情况： 一种情况是超过了电阻丝的熔点而被烧断；另一种情况是下重块达到最低点而毛 细玻璃管仍没有被拉断。从表3 5 1 可以看出，当电压u = 2 3 伏时由于此时微针的收 缩长度较大，即使使用最大的形成控制开关，还是无法拉断，拉成了微管道；而当电 压u = 2 4 伏时，就会由于温度超过了加热丝的熔点而烧断。 因此实验当中，通常把电压设定为l o v ，又由于各种调压器的调压范围不同，其 精度也就不同。为了获得准确的数据，基本上固定电压值，但是理论上讲，在其他参 1 9 硕士论文 细胞工程用微针的制各工艺研究 数不变的情况下，在允许的范围内，电压越大，拉制的微针的收缩长度就越短，反之 也成立：在允许的范围内，电压越小，拉制的微针的收缩长度就越长。经实验得知当 调压电压超过1 0 伏特时，加热温度过高致使微玻璃针针尖部分的柔韧性降低，使得 微针容易破碎，所以，一般情况下不采用超过i o v 的电压。 对加热长度的控制 为了找出微针内径和加热长度的关系，固定合适的电压( u ) 和砝码重量( g ) 值，改 变加热范围( 1 ) ，