（环境科学与工程专业论文）生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究.pdf

硕士学位论文 技术，发现该菌至少存在一个较大质粒；通过电泳检测，结果发现未消 除质粒的细菌能产生噬油斑( 即产表面活性剂) ，消除了质粒的细菌不能 产生噬油斑( 即不产表面活性剂) 。从而初步断定该菌产表面活性剂的功 能基因位于这个质粒上。这项工作为进一步研究表面活性剂产生菌的目 的基因作了一定的铺垫。 关键词：生物表面活性剂；筛选；功能基因；培养条件优化 i i i 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究 a b s t r a c t b i o s u r f a c t a n ti sah i g hs u r f a c e - a c t i v e a g e n ts y n t h e s i z e db yp l a n t ，a n i m a l o r m i c r o o r g a n i s m ，b u ta tp r e s e n tt h em o s tb i o s u r f a c t a n t sc o m ef r o mt h em i c r o o r g a n i s m p r o d u c t i o n c o m p a r e dw i t hc h e m i c a ls u r f a c t a n t ，b i o s u r f a c t a n th a se n v i r o n m e n tc o m p a t i b i l i t y , s a y i n gn o n t o x i c ，b ec o m p l e t e l yd e g r a d e db ym i c r o o r g a n i s m ，n o tc r e a t ep o l l u t i o nt o e n v i r o n m e n t ，g o o ds e l e c t i v i t ya n df e wu s el e v e l b i o s u r f a c t a n th a sb e e ng r a d u a l l ya p p l i e d i na g r i c u l t u r e ，a r c h i t e c t u r e ，f o o dd r i n k ，i n d u s t r yc l e a n ，l e a t h e r , p a p e r m a k i n g ，p e t r o l e u m ， e n v i r o n m e n t a lf i e l d sa n ds oo n m a n yb i o s u r f a c t a n t sa n dt h e i rp r o d u c i n gp r o c e s s e sh a v e b e e ns t u d i e dd e e p l ya n dw i d e l y h o w e v e r ，s of a rf e wo fb i o s u r f a c t a n t sh a v e b e e n i n d u s t r i a l i z e df o ri t sl o w - y i e l da n dh i g hc o s t s s oi ti st h eo n l yw a yf o rt h ei n d u s t r i a l i z a t i o n t oe x t e n s i v e l ys c r e e nt h es t r a i n sa n dt oa n a l y z et h ep r o d u c i n gp r o c e s s e sa n dt os t u d yt h e r e l e v a n c eb e t w e e nt h em o l e c u l a rs t r u c t u r ea n di t sf u n c t i o n t h e r e f o r e ，m o r eb i o s u r f a c t a n t s o fs p e c i f i cp u r p o s ea n dh i g hf u n c t i o ns h o u l db ep r o d u c e db yt h ew a yo fs t r u c t u r a l s c r e e n i n ga n dc o m p u t e rs i m u l a t i n g a n di t i s n e c e s s a r yt oo p t i m i z et h ep r o d u c i n g c o n d i t i o n sa n dp u r i f i c a t i o nm e t h o d s t h e r e f o r e ，m u c hi n t e g r a t e dt e c h n o l o g ya n do t h e r s c i e n c es u c ha ss i m u l a t i o nt e c h n o l o g y , n a n o - - t e c h n o l o g ya n db i o - t e c h n o l o g y , i sb o u n dt o t h ed e v e l o p m e n to ft h eo v e r a l lt r e n d a l a r g en u m b e ro fb i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n gs t r a i n s h a v eb e e nr e p o r t e d b u tt h e m i c r o b e so ne a r t ha l ev e r yr i c hs ot h a tl e s st h a n1 o fm i c r o o r g a n i s m sh a v eb e e nk n o w n s ot h e r ei ss t i l lal o to fu n d i s c o v e r e ds p e c i e s i nt h ep a p e r , t h r e eb i o s u r f a c t a n t p r o d u c i n g s t r a i n sw e r es c r e e n e df r o mt h eo r g a n i cp e s t i c i d e sa c t i v a t e ds l u d g eb yd e s i g n i n gf i l t e r m e d i u m a l lo ft h e ma r ei d e n t i f i e dt ob e l o n gt og e n e r ao fa c i n e t o b a c t e r f r o mt h e m ，w 2 w i t hi t ss u r f a c t a n th a st h eb e s tp e r f o r m a n c e s ot h ef a c t o r sf o rf e r m e n t a t i o no fs u r f a c t a n t w e r es t u d i e d ，a n dt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw a so p t i m i z e di n i t i m l y a tt h es a m et i m e ，t h em i c r o b i o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o t e c h n o l o g yh a sb e e n d e v e l o p e d ，s ot h a tt h ep r o c e s so fm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o na n dt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f m e t a b o l i cr e g u l a t i o nh a v eb e e nd e e p l ys t u d i e sa n da r em o r ea n dm o r ec l e a r s om o r e g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e db a c t e r i a lw i t hh i g hp e r f o r m a n c em a yb ec o n s t r u c t e dw i t hg e n e t i c a n a l y s i sa n dm o l e c u l a rb i o t e c h n o l o g y , w h i c hi sn e c e s s a r yf o ri n d u s t r i a l i z a t i o n i nt h ep a p e r t h ef u n c t i o n a lg e n eo fs t r a i nw 2w a ss t u d i e db yt h ew a yo ft h ee l i m i n a t i o no fb a c t e r i a l p l a s m i da n dr a p i dd e t e c t i v et e c h n o l o g y i tw a sf o u n dt h a tt h e r ei sab i gp l a s m i da tl e a s t t h r o u g he l e c t r o p h o r e s i st e s t t h es t r a i n sw i t hp l a s m i dc a np r o d u c em a c r o p h a g e so i ls p o t i v 硕士学位论文 ( t h a ti st op r o d u c i n gs u r f a c t a n t ) ，b u tt h es t r a i n sw i t he l i m i n a t e dp l a s m i d c a nn o tp r o d u c eo i l s p o tm a c r o p h a g e s ( t h a ti st op r o d u c i n gn os u r f a c t a n t ) i ti sc o n c l u d e dt h a tt h ef u n c t i o n a l g e n ei sl a c t a t e da m o n g t h ep l a s m i d k e y w o r d s ：b i o s u r f a c t a n t ；s c r e e n i n g ；f u n c t i o n a lg e n e ；c u l t u r a lc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本 声明的法律后果由本人承担。 作者签名：修f 曜 日期：鸿年多耶日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在一年解密后适用本授权书。 2 、不保密函。 ( 请在以上相应方框内打“ ) 日期：一8 年易b 多日 日期：8 年6 月j 7 日 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 生物表面活性剂的概述 1 1 1 生物表面活性剂的定义 生物表面活性剂( b i o s u r f a c t a n t ) 是天然表面活性剂的一种，主要是 指微生物生长过程中在特定条件下所产生的具有表面活性的代谢产物， 当然也有动物和植物产生的【l 4 】。它是细胞与生物膜正常生理活动所不可 缺少的成分。一方面广泛地分布于动、植物等生物体内，另一方面微生 物在其菌体外较大量地产生，积储微生物表面活性剂。大多数生物表面 活性剂是非离子型或阴离子型的 5 - s 】。不同文献中对生物表面活性剂有不 同的定义。这是因为由生物体系代谢产生的两亲化合物有两类：一类是 一些低分子量的小分子，它们能显著降低空气一水或油一水界面张力： 另一类是一些生物大分子，它们降低表、界面张力的能力比较差，但它 们对油一水界面表现出很强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面，防 止油滴凝聚，从而使乳状液得以稳定。有些文献中后一类称为生物乳化 剂( b i o e m u s i f i e r ) ，而有些文献中则将这两类都称为生物表面活性剂t 9 】。 本文所指的生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类具有表面活性 的两性物质，它们一般是微生物在一定条件下培养时，其在代谢过程中 分泌出具有表面活性的次级代谢产物，如糖脂、多糖脂、脂肽、脂蛋白 及中性类脂衍生物等。而且它们一般具有良好的降低表面张力、界面张 力的性能【l 。 1 1 2 生物表面活性剂的研究历史 早在2 0 世纪4 0 年代，z o b e l l 在研究硫酸盐还原细菌从沙粒中释放 原油的机制时就指出，微生物产生表面活性剂是细菌驱油的主要机制之 一。1 9 5 7 年，捷克的d o s t a l e k 和s p u m y 把脱硫弧菌( d e s u l f o v i b r i o ) 和假 单胞菌同糖蜜一起注入油层，原油产量提高。他们认为，可能是细菌产 生的表面活性物质，改变了岩石一油一水三相系统的界面张力所致。 6 0 年代后，石油工业开始发展，微生物对烃类物质的乳化机制引起 了关注。对提取的微生物表面活性剂集中于结构、性能、生物合成及调 控的研究。 2 0 世纪7 0 年代初人们就已经认识到许多数量众多的天然水溶性高 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究 分子化合物具有表面活性” 5 l ，到了七十年代末，生物表面活性剂的研究 开始发展起来。19 7 6 年，z a ji e 和p a n c h a l 综述了微生物乳化剂的来源及特 性，预测了其应用潜力。19 8 0 年，c o o p e r 和z a j i e 评述了微生物表面活 性剂的化学特性。19 8 4 年，z a j i e 和s e f f e n s 阐述了微生物表面活性剂的 理化性能。19 91 年，v a n d e r 等进行的轴对称液滴分析( a d s a ) 非常有 效，其他比较简单的方法有快速液滴破裂实验、产表面活性剂菌落的薄层 层析及比色法检测解烃细菌与产鼠李糖脂的细菌。近年来的研究热点是 发展快速检测表面活性剂高产菌株并评价其产表面活性剂的方法。 用微生物发酵法生产表面活性剂是7 0 年代后期发展起来的。加拿大、 英国、德国、前苏联等主要研究并开发各类新型生物表面活性剂、寻找 最适生产条件，表面活性剂结构剖析与改性，物化性能测试，室内驱油 物理模拟等。z a j i e 实验室几个产品已商业化。s i n g e r 实验室选育的一种 细菌，以正构烷烃为唯一碳源，产生一种胞外和胞内糖脂型表面活性剂， 使重油粘度降低9 5 以上，形成稳定的水包油乳状液【6 】。在北美，许多 大的石油公司和大的跨国化学公司都积极研究开发生物表面活性剂，研 究兴趣主要集中在微生物法生产表面活性剂，助表面活性剂及其在微生 物采油( m i c r o b i a le n h a n c e do i lr e c o v e r y ) 中的应用，迄今为止在这些 方面已申请多项专利，有些产品已经商业化，其性能完全可与化学合成 表面活性剂相媲美【7 】。在这一阶段，除了石油工业以外，生物表面活性 剂也开始应用于从乳化、破乳至润湿、发泡及抗静电等各个方面。迄今 为止，这些方面已获得了不少成就，但由于工业技术保密，从发表的文 献中很少能活得这方面的信息。 1 1 3 生物表面活性剂的性质 生物表面活性剂结构的多样性决定了它功能的多样性。生物表面活 性剂的分子结构中既具有极性的基团，又具有非极性基团，是一类中极 两性分子。因此，他们能在两相界面定向排列成分子层，降低界面的能 量，即表面张力，多数生物表面活性剂可将表面张力减小至3 0 m n m 。它 们在决定界面的流变学特性以及两相间的物质传递方面起着十分重要的 作用【6 1 。 同化学合成的表面活性剂一样，生物表面活性剂分子中也含有憎水 基和亲水基两部分，憎水基一般为脂肪酰基链，极性亲水基则有多种形 式，如中性脂的酯或醇官能团、脂肪酸或氨基酸的羟基、磷脂中含磷的 部分以及糖脂中的糖基等。生物表面活性剂能量著降低表面张力和界面 张力。通常，生物表面活性具有良好的热及化学稳定性，如地衣芽孢杆 2 硕士学位论文 菌( b 1 i c h e n i f o r m i sj f 2 ) 产生的脂肽在7 5 时，至少可耐热l4 0 h 。生 物表面活性剂在p h 5 5 l2 之间保持稳定，当p h 小于5 5 时，会逐渐失 活。除此之外，还具有其它特有的性能，如p s e u d o m o n a ss p 产生的鼠李 糖酯的乳化性能很好，优于常用的化学合成乳化剂吐温( t w e e n ) 。生物 表面活性剂还具有良好的抗菌性能，这是一般化学合成的表面活性剂难 以匹敌的，如日本的实验室从p s e u d o m o n a ss p 得到的糖脂具有一定的抗 菌、抗病毒和抗枝原体的性能等。有些生物表面活性剂可以耐强碱、强 酸，如o ，o d 一海藻糖6 棒杆霉菌酸酯，在0 1m o l l 盐酸中浸泡7 0 个 小时，也仅有10 的糖脂被降解。p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s as7 8 1 产生的 类蛋白活化剂在p h 为1 4 l1 4 范围内非常稳定。还有许多生物表面活 性剂耐热性非常好，如糖脂( 表1 1 ) 、蔗糖脂、槐糖脂、酸性槐糖脂、 鼠李糖脂等。生物表面活性剂由于是天然产物，还具有更好的生物降解 性1 1 0 1 。 表1 1 糖脂的表面活性 t a b l e1 1s u r f a c ea c t i v eo fg l y c o l i p i d 生物表面活性剂主要具有以下的特征【6 】： 1 生物表面活性剂表面性能优良，同样能显著地降低表面( 界面) 张力，具有渗透、润湿、乳化、增溶、发泡、消泡、洗涤去污等一系列 表面性能。 2 有一些生物表面活性剂还有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等的药理作用 和免疫功能。例如，由r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 在含甘油的培养基中所 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究 分泌产生的单琥珀酰海藻糖脂能显著地抑制h e r p e s s i m p l e x 类型i 病毒。 3 生物表面活性剂分子结构类型多种多样，即有结构简单的分子或 高分子，其中大多数是因其复杂的结构而传统的化学方法所难以合成的。 4 生物表面活性剂的合成原料多是在自然界中广泛存在的、无毒无 副作用的物质，如甘油三酯、脂肪酸、磷脂、氨基酸等。原料的来源方 便，价格便宜。 5 最重要的是，生物表面活性剂产品本身无毒，并且能够在自然界 完全、快速地被微生物降解掉，不会对环境造成污染和破坏。 6 生物表面活性剂的生产工艺简单，常温、常压下即可发生反应， 生产设备要求不高。 7 研究表明，生物表面活性剂的驱油效率比人工合成的表面活性剂 的驱油效率高3 5 倍8 倍，而价格却为人工合成的表面活性剂的3 0 。 许多国家已经把产生生物表面活性剂的微生物采油作为长期开采油田项 目的一部分。与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂在大面积油 面和地下贮藏条件下使用更为有效。 8 生物表面活性剂和合成表面活性剂的物理性质比较( 表面张力与 界面张力是不同的，临界胶束浓度) ，以及在毒理和生物降解方面都比合 成表面活性剂具有优势；生物表面活性剂通常比合成表面活性剂化学结 构更为复杂和庞大，单个分子占据更大的空间，因而显示出较低的临界 胶束浓度( 见表1 2 ) 。 9 与化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂具有许多有利之 处：( 1 ) 具有更强的表面和界面活性，选择性和专一性好，用量少，无 毒或低毒；( 2 ) 可生物降解性，不对环境造成污染；( 3 ) 可用微生物方 法引入化学方法难以合成的新化学基团等优点；( 4 ) 一般不致敏、可消 化，因此可以用于化妆品，甚至作为食品添加剂：( 5 ) 可以从工业废物 中生产，应用于环境的生物治理；( 6 ) 结构多样，有可能适用于特殊的 领域；( 7 ) 对油水的乳化更加稳定；( 8 ) 具有更好的环境相容性、更 高的起泡性，在极端温度、p h 、盐浓度下的更好选择性和专一性【l1 1 ；( 9 ) 用微生物发酵生产，工艺简便，当发酵技术进一步成熟和产量达到一定 规模后生产成本可望进一步降低，进而可广泛应用于工业、农业、医药 以及人们日常生活用品等各个领域。由此可见，与化学合成表面活性剂 相比，生物表面活性剂有许多明显的优势，可以成为化学合成表面活性 剂的替代品或升级换代产品，有着巨大的经济效益和社会效益。 表1 2 生物表面活性剂和化学表面活性剂的物理性质比较1 1 2 - 1 4 1 4 表面张力界面张力 临界胶束浓度 表面活性剂类型 ( m n m ) ( m n m )( m g l ) 脂肽 2 70 1 0 31 2 2 0 枯草菌脂肽2 7 3 21 02 3 1 6 0 槐糖脂 3 0 3 71 0 2 01 7 0 8 2 0 s u r f a c t i n2 70 0 111 o 鼠李糖脂 2 5 3 00 0 5 4 05 2 0 0 r l2 7o 0 55 0 r 22 64 0 04 0 0 0 微 r 33 0 1 o o 2 0 0 0 0 生r 42 5 1 0 02 0 0 0 0 物海藻糖脂 3 0 3 83 5 1 74 2 0 厶 海藻糖6 霉菌酸脂 3 21 6 02 0口 成 海藻糖6 二霉菌酸脂 3 61 7 02 0 海藻糖2 ，3 ，4 ，2 四脂 2 6 1 0lo 0 海藻糖6 二，四，六，八脂 3 00 0 2 l o 51 5 0 0 0 葡萄糖6 霉菌酸脂4 09 02 0 0 纤维素二糖6 霉菌酸脂 3 51 04 0 麦芽三糖6 ，6 ，6 ”三霉菌 4 4 1 9 0l o 0 酸脂 一一一 黑粉菌酸 3 0 1 0 2 0 0 化 十二烷基磺酸钠 3 7o 0 22 1 2 0 0 学 溴化十六烷基三甲基铵 3 05 o o 1 3 0 0 0 合 线性烷基苯磺酸盐4 7 1 05 9 0 成 t w e e n 2 03 04 8 06 0 0 0 1 1 4 生物表面活性剂的种类 化学合成表面活性剂是根据它们的极性基团来分类。而生物表面活 性剂则不同，主要依据它们的化学组成和微生物来源分类【6 l5 1 。生物表面 活性剂是含有亲脂基团和亲水基团的两性生物分子。其中亲脂基团为脂 肪酸的碳链或甾酮碳环，亲水基团( 极性基团) 为脂肪酸或氨基酸的羧 基、磷脂的磷酰基或糖类和缩氨酸的羟基。根据它们的结构和形态，它 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究 们可以分为六类：羟基化和交联化的脂肪酸( 地衣酸) 、糖脂、磷脂、脂 多糖、脂肽和脂蛋白以及细胞整体 1 6 , 17 。生物表面活性剂也可以按分子 大小分成两类：诸如糖脂、磷脂、脂肽和脂肪酸等能够有效降低表面张 力的低分子量分子和诸如脂多糖和脂蛋白等多聚物【18 】。与其结构相对 应，生物表面活性剂主要分为糖脂类、脂肽和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸 类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂等五大类【l 9 1 。 1 糖脂类 大多数已知道的生物表面活性剂属于糖脂类。在糖脂中，人们最熟 悉的是鼠李糖脂、海藻糖脂和槐糖脂。 鼠李糖脂常由假单孢菌( p s e u d o m o n a ss p p ) 产生。j a r v i s 和j o h n s o n 第一次报道了用铜绿假单孢菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 产生含鼠李糖 的糖脂。用假单孢菌产生的鼠李糖脂可以使界面张力降到lm n m ，使表 面张力降到2 5 m n m - 3 0 m n m 之间。 分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 、诺卡氏菌( n o c a n d i a ) 和棒杆菌属 ( c o r y n e b a c t e r i u m ) 的大多数种都可产生海藻糖脂。红串球菌 ( r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s ) 会合成一种阴离子海藻糖脂。红串红球菌和 节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) 产生的海藻糖脂能分别使培养液中的表面和 界面张力降低到2 5 m n m 4 0 m n m 和1m n m 一5 m n m 之间。 槐糖脂主要由酵母产生的。如球拟酵母( t o r u l o p s i sb o m b i c o l a ) 、嗜 石油球拟酵母( t p e t r o p h i l u m ) 和蜜蜂生球拟酵母( za p i c o l a ) 。槐糖脂 能使正十六烷和水的界面张力从4 0 m n m 降到5 m n m ，并且对p h 值和 温度的变化有很好的稳定性。 2 脂肽和蛋白质 19 6 8 年，a r i m a 等首次发现枯草杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) i f 0 30 3 9 产 生的脂肽类表面活性剂呈晶状，商品名为表面活性素( s u r f a c t i n ) ，是迄 今已报道的效果最好的表面活性剂之一，在o 0 0 5 的浓度下，能将表面 张力从7 2 m n m 降到2 7 9 m n m 。地衣芽孢杆菌( b 1 i c h e n i f o r m i s ) 8 6 产 生的表面活性剂b l 8 6 能把水的表面张力降到2 7 m n m ，把水和正十六 烷的界面张力降到o 3 6 m n m ，并很好的促进p 碳化硅胶体在氮化铝浆中 的扩散。 短小芽孢杆菌( b a c i l l u sb r e v i s ) 和多粘芽孢杆菌( b p o l y m y x a ) 产 生的很多环脂肽，都有很好的表面活性。假单孢菌( pr u b e s c e n s ) 和硫 氧化硫杆菌( t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s ) 产生的含鸟氨酸和牛黄酸的脂、 膨胀土壤杆菌( 彳g r d 6 口c f p ，f 甜朋t u m e f a c i e n s ) e f 0 3 0 58 产生的含赖氨酸的 脂和褪色沙雷氏菌( s e r r a t i am a r c e s c e n s ) n s38 产生的一种含氨基酸的 6 硕士学位论文 生物表面活性剂都有很强的表面活性。 3 脂肪酸、磷脂和中性脂 不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p ) h o i n 可产生磷脂乙醇胺，有乳化作 用；曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 的一些种和硫氧化硫杆菌也可大量产生磷脂； 节杆菌菌株a k 1 9 和铜绿假单孢菌( p a e r u g i n o s a ) 4 4 t i 在十六烷和橄 榄油上生长时，能分别积累4 0 和8 0 ( w t w t ) 的磷脂；红串红球菌在 正烷烃中生长时产生的磷脂酰乙醇胺能把水和十六烷之间的界面张力降 到lm n m 以下。 4 高分子生物表面活性剂 醋酸钙不动杆菌( a x a l c o a c e t i c u s ) r a g 1 能产生一种有效的聚阴离 子杂多糖，是水中烃类非常有效的乳化剂；n a y o n v e n e z i a 等从抗辐射不 动杆菌( a r a d i o r e s i s t e r s ) k a 5 3 分离出了一种含丙氨酸的阴离子杂多糖 蛋白生物表面活性剂；脂多糖是解脂假丝酵母( c a n d i d al i p o l y t i c a ) 合成 的细胞外水溶性乳化剂；苔粘双孢黑粉菌( s c h i z o n e l i a 聊口，口 d 譬，口玎，z 肌口) 和玉蜀黍黑粉菌( u s t i l a g om a y d i s ) 可产生一种生物表面活性剂，它是含 赤藓糖醇和甘露糖的脂；荧光假单孢菌( p f l u o r o s c e n s ) 在汽油上生长时 可产生一种生物乳化剂，它由5 0 的碳水化合物、19 6 的蛋白质和l0 的脂组成。 5 微粒生物表面活性剂 不动杆菌( a c i n e t o b a c t e rs p p ) h o1 n 产生的囊泡，直径为2 0 5 0 n m ， 浮力密度为1 15 8 9 c m 3 ，是由蛋白质、磷脂和脂多糖组成的，比起相同 生物体的外面的膜，膜的囊泡大约可以包含5 倍的磷脂和大约3 5 0 倍的 多糖。这些胞外膜囊泡具有分隔烃类的微乳化作用，这在微生物细胞吸 收烷烃雷物质中起了重要作用。 1 2 生物表面活性剂的生产 1 2 1 生物表面活性剂产生菌 微生物发酵法生产生物表面活性剂的生产菌种大致可分为三类，一 类是严格以烷烃作为碳源的微生物，如棒状杆菌c o r y n e b a c t e r i u ms p ； 一类是以水溶性底物为碳源的微生物，如杆菌b a c i l l u ss p ；另一类可以 以烷烃和水溶性底物两者作为碳源，如假单胞菌p s e u d o m o n a ss p 。这些 微生物在以碳氢化合物为底物的培养基上生长时，可合成一系列范围很 表1 3 生物表面活性剂及其产生菌 t a b l e1 3bi o s u r f a c t a n t sa n dt h e i rm i c r o o r g a n i s m s 7 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究 生物表面活性剂名称产生菌 r h a m n o l i p i d s t r e h a l o s el i p i d s s o p h o r o s el i p i d s p s e u d o m o n n ss p p p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a a r t h r o b a c t e rp a r a f f i n e u s c o r y n e b a c t e r i u ms p p m y c o b a c t e r i u ms p p m y c o b a c t e r i u mp a r a f f i n i c u m m y c o b a c t e r i u mp h l e i m y c o b a c t e r i u ms m e g m a t i s m i c r o m o n o s p o r a r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s c a n d i d as p p p s e u d o m o n a ss p p t o r u l o p s i sb o m b i c o l a t o r u l o p s i sa p i c o l a g l u c o s e - ，f r u c t o s e - ，爿，f ，d 6 口c ，p ，s p p s a c c h a r o s el i p i d s c e l l o b i o s el i p i d s p o l y o ll i p i d s p h o s p h o l i p i d s s u l f o n y l i p i d s a r t h r o b a c t e rp a r a f f i n e u s c o r y n e b a c t e r i u ms p p c o r y e b a c t e r i u mh y d r o c n r b o c l n s | h s r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s u s t i l a g om a y d i s r h o d o t o r u l ag l u t i n u s r h o d o t o r u l ag r a m i n u s a c i n e t o b n c t e rs p p c o r y n e b a c t e r i u ms p p c o r y n e b a c t e r i u ma l k a n o t y t i c u m m i c r o c o c c u ss p p 砌i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s c a p n o c y t o p h a g as p p m o n o - ，d i g l y c e r i d e s a c i n e t o b a c t e rs p p d i g l y c o s y ld i g l y c e r i d e s l a c t o b a c i l l u sf e r m e n t i i m e l l y s i n l i p i d o r n i t h i n e - l i p i d c a n d i d aa n t a r c t i c a g r o b d c t e r i t l mt u m e f a c i e n s p s e u d o m o r l a sr u b e s c e n s 8 硕士学位论文 i i i i 皇鲁暑摹詈皇= 昌鲁昌皇詈皇鲁暑皇鲁皇詈皇皇皇詈量鲁昌皇暑皇鼍昌暑葛墨鲁詈暑喜暑兽篁皇詈暑鲁皇詈暑喜篁昌暑暑詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈詈昌詈鲁詈喜詈置暑詈穹皇暑鲁詈鼍詈穹昌詈 t h i o b a c i l u st h i o o x i d a n s n u t r o l i p i d n o c a r d i ae r y t h r o p l i s m y c o l a t e so fm o n o ，d ia n d t r is a c e h a r i d e c o r y n e b a c t e r i u md i p h t h e r i a e l i p o p o l y s a c c h a r i d e s a c i n e t o b a c t e rc a l c o a c e t i c u s( r a g - 1 ) p s e u d o m o n a ss p p c a n d i d al i p o l y t i c a p 0 l y s a c c h a r i d e p r o t e i n c o r y e b a c t e r i u mh y d r o c a r b o c l a s t u s c o m p l e x c a r b o h y d r a t e - p r o t e i n l i p i d c 。m p l e x p s p 材d 。，玎。刀口s 甜。，p s c p 行s l i p o p e p t i d e s ( s u r f a c t i n ，a r t h r o b a c t e rs p p v i s c o s i n ，g r a m i c i d i n ，b a c i l l u sb r e v i s p o l y m i x i n s ，e ta 1 ) b a ci l l u sp ol y m y x a b a c i l l u sp u m i l i s b a c i l l u ss u b t i l i s b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s c a n d i d al i p o t y t i c a c a n d i d ap e t r o p h i l i u m p s e u d o m o n a sn u o r e s c e n s s e r r a t i am a r c e s c e n s o r n i t h i n e ，l y s i n ep e p t i d e s g l u c o n o b a c t e rc e r i n u s f a t t y s t r e p t o m y c e ss i o y a e n s i s t h i o b a c i l l u st h i o o x i d a n s a c i d sa r t h r o b a c t e rp a r a f i n e u s ( e o r y n o m y c o l i c a c i d s ，c a n d i d at r o p i c o l a s p i c u l i s p o r i ea c i d s ，c o r y n e b a c t e r i u ms p p t r e h a l o s e m y c o l a t e s ，c o r y n e b a c t e r i u ml e p u s s e r r a w e t t i n ，e ta 1 ) m i c r o c o c c u ss p p p e n i c i l l i u ms p i c u l i s p o r u m r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s t a l a r a m y c e st r a c h y s p e r m u s 广的具有表面活性作用的物质，如：糖脂、脂蛋白多糖蛋白质复合物、 磷脂、脂肪酸和中性脂等。在烃基质中培养时，许多微生物都可以有利 于烃基质被动扩散而进入细胞内的效应，这是通过微生物产生的一大类 9 生物表面活性剂产生菌的筛选及功能基因的定位研究 物质而起作用的，这类物质就称作“生物表面活性剂，见表1 3 。 1 2 2 微生物法生产生物表面活性剂 利用微生物法制备生物表面活性剂时，微生物的培养路线一般采用 发酵路线。根据不同的微生物和目标分子，生产表面活性剂的微生物发 酵法可分为以下4 种( 见表1 4 ) f 20 1 。 表1 4 生成生物表面活性剂的各种方法 t a b l e1 4m e t h o d so fb i o s u r f a c t a n tp r o d u c t i o n 与细胞生长相关的方法用亲油介质诱导生产 在控制下生长细胞生产 由休止细胞生产 由生产细胞，游离休止细胞，固 定化休止细胞经加入前体法生产 用优选介质组成达到增产 用优选环境影响因素( p h ，温度，通气、搅 拌，速度等) 达到增产 加入能引起细胞壁通过透性变化的试剂( 青 霉素，乙胺丁醇，e d t a 等) 增产 加入能促进胞壁结合生物表面活性剂与胞壁 分离，从而使该生物表面活性剂进入介质中 的试剂( 如烷烃，煤油，e d t a 等) 增产 限氮生长 限多价阳离子生产 在控制下改变p h 或温度等条件增产 由游离休止细胞生产 由固定化细胞生产 由固定化休止细胞经随程提取法生产 1 3 2 1 生长相关型生物表面活性剂的生产 该法中底物的消耗、细胞的生长、表面活性剂的生成同步进行。培 养基中的碳源很重要，不同碳源对表面活性剂的产量和成分都有影响。 例如，p s e u d o m o n a s 菌在以正烷烃为惟一碳源的培养基中生长，产生大 量的鼠李糖脂，而在果糖或葡萄糖培养基中只能产生少量的鼠李糖脂。 另外一些因素，如培养基中氮源的种类和加入方式、p h 值、温度、搅拌 速度、通气速度，以及氧气在气液界面的传输速度等，都对表面活性剂 的生成有影响。生长细胞法的优点是由于底物的存在诱导细胞体内产生 大量的酶，从而提高了细胞的转化活力，且操作简便。缺点是发酵过程 1 0 硕士学位论文 中易被杂菌感染，此外还要求底物对细胞的生长不能有抑制作用。 培养微生物生产生物表面活性剂时，某些因素或现象会反映出生成 的表面活性剂是生产相关型。由生长细胞合成生物表面活性剂常常伴随 着产生泡沫，降低介质的丫。和丫l ，或使培养基中的油性基质乳化。如果 已经建立了提取产物的合适步骤，若要提高表面活性剂的产率，则应对 影响微生物代谢活动的各种生理参数进行考察和研