（动物学专业论文）不同生理状态下草丛土毛虫的细胞结构及大核dna多态性研究.pdf

e a s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y s t u d i e so nc e l ls t r u c t u r ea n dp o l y m o r p h i c m a c r o n u c l e a rd n ai n 乃蒯c h as t r a m e n t i c o l a ( c i l i o p h o r a ：h y p o t r i c h i d a ) u n d e r d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a ls t a t u s s c h o o la n dd e p a r t m e n t ：s c h o o lo f l i f es c i e n c e t u t o r ： 鱼坠墅坚k 垒坠g d o c t o rc a n d i d a t e ： 苎塾竺坠g 塾坠望 a p r i l ，2 0 1 0 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明：本人呈交的学位论文不同生理状态下草丛土毛虫的细胞结构及大核 d n a 多态性研究，是在华东师范大学攻读硕士博士( 请勾选) 学位期间，在导师的 指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 华东师范大学学位论文著作权使用声明 不同生理状态下草丛土毛虫的细胞结构及大核d n a 多态性研究系本人在华东 师范大学攻读学位期间在导师指导下完成的硕士博士( 请勾选) 学位论文，本论文的 研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使用此学位 论文，并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网送交学位论文的印刷 版和电子版；允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被查阅、借阅；同意学校 将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题 和摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) () 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部 或“涉密 学位论文幸， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 ( u2 不保密，适用上述授权。 新签名一 桃名丝叁 撕年j 6 具7 日 “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学位 论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有效) ，未经上 述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用 上述授权) 。 盛索博士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 乔中东教授上海交通大学主席 朱振勤教授华东师范大学委员 中国农科院 黄兵研究员委员 上海兽医研究所 李利珍教授上海师范大学委员 王莲芸教授上海交通大学委员 吴自荣教授华东师范大学委员 侯连生教授华东师范大学委员 摘要 不同生理状态下草丛土毛虫的细胞结构及 大核d n a 多态性研究 摘要 原生动物是动物界中最简单、最低等的单细胞真核生物。土壤原生动物作为 原生动物中的一个类群，在土壤生态系统中起着至关重要的作用，土壤原生动物 与水生原生动物之间既相互联系又区别明显。土壤纤毛虫具有特有的生活状态以 及与土壤生活相适应的形态结构跟生理机能，尤其是土壤纤毛虫所拥有的随着土 壤颗粒及干湿度的变化发生形成包囊和脱包囊的生活史，是细胞对特殊环境条件 的一种适应性特征。到目前为止，诸多学者已经对水生纤毛虫形态结构及其包囊 做了比较多的研究，但是对于土壤纤毛虫的研究还甚少，仅限于生态功能、群落 特征和物种分布等几个方面。作者对土壤纤毛虫的细胞形态、皮层结构模式、细 胞质的细胞器以及核器等超微结构的研究是想进一步了解土壤纤毛虫是如何适 应土壤生境的，以及土壤纤毛虫与淡水纤毛虫之间的亲缘关系，还想更深入的了 解土壤纤毛虫包囊的发生及包囊的形态、细胞结构特征等，此研究对于进一步揭 示土壤纤毛虫细胞结构的分化、细胞模式的形成、种群的分类以及探索其在系统 发生过程中的演化地位等都有极为重要的生物学意义。本文对国内外有关土壤纤 毛虫的研究做了充分调研，以作者所在实验室在浙江温州所采集到的一种大型的 腹毛类土壤纤毛虫草丛土毛虫( t e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l a ) 为研究材料，分别 用正常生理状态的营养期细胞与经过人工诱导后产生的休眠阶段的包囊，对其进 行f l u t a x 荧光标记、抗q 一微管蛋白免疫荧光标记，以及扫描电镜术和透射 电镜术等多种技术手段的应用，系统的比较观察了其营养细胞与休眠包囊的形 态、皮层细胞质及其各种胞器的结构；应用r a p d 方法，分别对草丛土毛虫的 营养细胞与休眠细胞的大核d n a 进行了探索。结果如下： 1 细胞皮层微管胞器的荧光标记 应用f l u t a x 直接荧光和抗q 一微管蛋白抗体免疫荧光标记显示，草丛土毛 虫细胞皮层含有口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛、背触毛等纤毛器及 摘要 其纤毛器骨架、纤毛器基部附属微管和其他皮层非纤毛器微管骨架等组成的微管 胞器。其中：口围带和波动膜基部形成小膜托架、小膜附属微管及波动膜骨架； 波动膜由数量众多的的细小微管相互交织组成的密集微管网构成；额腹横棘毛基 部和左右缘棘毛基部由前纵微管束、后纵微管束和横微管束三部分微管组成；背 触毛基部含前纵微管束和后纵微管束。所得结果中，其横棘毛基部具有较发达的 横微管束，这在其他纤毛虫中未见报道；并且，细胞皮层纤毛器在其表膜下形成 的纤毛器基部微管骨架，较尖毛科的水生纤毛虫同种结构发达。据此推测，土毛 虫细胞皮层微管胞器的形态特征可能与细胞在土壤中的生命活动相适应，其发达 的纤毛器基部微管为其表面纤毛器的运动提供了有力的支撑，有利于纤毛虫在土 壤团粒间的运动和取食，这也是细胞与环境问长期相互作用的结果。 2 营养细胞和休眠包囊的扫描电镜观察 扫描电镜观察显示，草丛土毛虫的营养细胞中，腹皮层口围带含小膜5 5 7 0 片，波动膜2 片，额腹横棘毛和左右缘棘毛在细胞腹面按8 - 9 7 模式分布，背触 毛8 列。该纤毛虫的腹皮层纤毛器较发达，除口围带和波动膜外，其纤毛器的发 达程度按额棘毛、横棘毛、腹棘毛、缘棘毛逐渐递减。此外，在细胞的额区前表 面呈棘突样，在其他纤毛器附近的皮层表面呈波纹样。据所得结果推测，该纤毛 虫发达的皮层纤毛器及特殊的皮层表面，可能是细胞在土壤颗粒间隙水中运动及 其与环境相互作用的结果。 纤毛虫的休眠包囊为球形或者扁球形，直径7 0 8 0 l m ：包囊壁的背面由无 数六边形的鳞片紧密排列而成，呈蛇皮状；包囊壁的腹面内凹，中央有包囊孔。 据纤毛虫包囊壁背面的形态分析，该包囊壁可能是土壤纤毛虫形成包囊后细胞抵 御干燥环境、延长水分散失的特殊结构；据纤毛虫包囊形成过程中细胞紧贴下部 基质及分泌物质形成包囊壁的现象认为，包囊孔与周围的壁结构一起，可能具有 使包囊细胞固定在土壤基质表面的作用。结果表明，土毛虫的休眠包囊是细胞在 土壤环境中形成的一中特殊型包囊。 3 营养细胞和休眠包囊的透射电镜观察 透射电镜结果显示，在草丛土毛虫的营养细胞中，除纤毛器结构外，皮层由 表膜和表膜下表质层构成，表质层由一层微管对其加固；由微管聚集而成的微管 玎 摘要 束或者微管带集中存在于皮层纤毛器和腹面棘毛区的皮层表膜下；细胞质内含有 极其丰富的线粒体、食物泡等胞器结构；核孔呈虚线状分布于大核中，阿米巴样 的囊泡结构附着在核膜外，核仁和染色质聚集成大、小不等的团块分散分布其中， 部分染色质与核内膜紧密相连。所得结果充分表明，纤毛虫的营养期细胞具有对 土壤环境的适应性细胞结构，此结构更加有利于其运动与取食；纤毛虫的细胞质 胞器及核器是细胞进行新陈代谢生命活动的明显特征。 形成包囊后的纤毛虫，其细胞皮层纤毛器及与其相联系的微管类骨架彻底消 失。通过观察发现，草丛土毛虫的包囊壁结构较特殊，由两层结构组成，其中大 小相近的长方形小室相互聚集排列形成外层壁，而较厚的、透明的、紧贴在表膜 上的内层壁与外层壁紧密相连，成为表膜向包囊壁过渡的结构物质；休眠细胞内 含有大量的线粒体以及吞噬许多细胞器的自噬泡，其具有不同消化阶段的结构特 点；大核核膜与核外细胞质之间分界明显，其核内染色质呈均一状分布，巨大型 中央核仁位于大核中央，呈低电子密度状态。据此推测，纤毛虫形成包囊过程中 皮层纤毛结构及微管结构全部瓦解或被细胞吸收，因此该纤毛虫所形成的“毛基 体吸收型包囊”具有典型的尖毛科纤毛虫模式；相较之水生纤毛虫休眠包囊的壁 结构，草丛土毛虫休眠包囊所具有特殊的包囊壁结构，为细胞形成包囊后便于 在干燥环境中储备较多的水分、维持其特殊生理状态下的生命活动提供了必要的 条件；同时，在休眠细胞内清晰可见自噬泡类细胞器，而其他细胞器数目锐减， 并且与调节细胞代谢活动相关的营养期大核的结构形态在休眠细胞中也变化显 著，说明存在于不同营养细胞的生命活动过程中的自噬泡结构可能是食物泡的另 一种特殊的结构状态，它的作用可能为休眠细胞提供基本的营养和能量来源。 4 营养细胞和休眠细胞的大核d n a 多态性 作者用r a p d 方法分别对草丛土毛虫的营养细胞和休h 民细胞的大核d n a 进行 了比较研究，实验共选用随机引物3 2 条，其中3 0 条引物能够扩增出1 3 4 条片段， 用营养细胞大核d n a 为模板可以扩增出5 4 条片段，而以休眠细胞大核d n a 为模 板则扩增出8 0 条片段，营养细胞于休眠细胞大核d n a 之间共有2 0 条共享片段， 其共享度为3 0 。由此得出，同种纤毛虫的营养细胞大核d n a 和休眠细胞大核d n a 的差异明显。据此推断，在形成包囊时，大核d n a 的结构可能发生了剧烈的变化， 而这些变化与细胞在包囊形成过程中结构和代谢的变化以及生理活动的改变息 n i 形成包囊时，土壤纤 种淡水纤毛虫( 游仆 虫和急纤虫) 的r a p d 数据与草丛土毛虫的实验结果相比较后发现，草丛土毛虫 的营养细胞与休眠细胞的共享度与形成“毛基体吸收型包囊”的水生纤毛虫相比， 要明显低的多，推测这可能与该土壤纤毛虫形成包囊时细胞对纤毛器和其他微管 类胞器的的吸收更为彻底、细胞分泌物质形成特殊的包囊壁等有关，也有可能是 细胞形成包囊时的调控机制与淡水纤毛虫不尽相同；此外，其营养细胞与休眠细 胞的共享片段的强弱也有所差异，以上数据说明即使是共有的d n a 片段，在营 养状念与休眠状态下的含量也是不完全一致的。 关键词：土壤纤毛虫；草丛土毛虫；营养细胞；休眠包囊； 微管胞器； 超 微结构：大核d n a 。 i v 摘要 s t u d i e so nc e l ls t r u c t u r ea n d p o l y m o r p h i c m a c r o n u c l e a rd n ai ut e 蒯c h as t r a m e n t i c o l a ( c i l i o p h o r a ：h y p o t r i c h i d a ) u n d e rd i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a ls t a t u s a b s t r a c t ： s o i lp r o t o z o a na sal a r g ea s s e m b l a g eo fp r o t o z o ap l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h e s o i le c o s y s t e m t h e r ea r es i m i l a r i t i e sa n dd i f f e r e n c eb e t w e e ns o i l p r o t o z o aa n d a q u a t i cp r o t o z o a e s p e c i a l l y , s o i lc i l i a t e s ，t h e i ru n i q u el i v i n gc o n d i t i o n s ，c e l l s t r u c t u r e sa n dp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r sc o u l da d a p tt ot h es o i l l i f e e n c y s t m e n ta n d e x c y s t m e n ta r eo n ep a r to ft h es o i lp r o t o z o al i f eh i s t o r y , w h i c ht a k e sa ni m p o r t a n t e f f e c to ni t ss u r v i v a l a tp r e s e n tt h es c i e n t i s t si nm a n yf i e l d sf o c u so nc i l i a t e sl i v e d i nw a t e r b u tt h e r ea r en om o r es t u d i e so ns o i lc i l i a t e s m o s ts t u d i e so nt h ec i l i a t e s r e m a i n e di nt h e e c o l o g i c a lf u n c t i o n s ，c o m m u n i t yc h a r a c t e r i s t i c sa n ds p e c i e s d i s t r i b u t i o n ，e t c ，o n l yaf e ws m a l lc i l i a t e sw e r eo b s e r v e do np h y s i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a n di t si n t e r n a l s t r u c t u r e b ym e a n so fs t u d y i n gc o r t i c a ls t r u c t u r ea n dm o d eo f c y t o p l a s m ，o r g a n e l l e sa n dn u c l e a ru l t r a s t r u c t u r e ，e t c w ew a n tt ok n o wh o wt h e ya d a p t t ot h es o i le n v i r o n m e n ta n du n d e r s t a n dt h er e l a t i o n g s h i pb e t w e e ns o i lc i l i a t e sa n d f r e s h w a t e rc i l i a t e s i no u re x p e r i m e n t s ，t h eo c c u r r e n c eo fr e s t i n gc y s t sw a sf o u n d t h i s k i n do f r e s t i n gc y s t sh a ds p e c i a lc y s tw a l l ，w h i c hc o u l da d a p tt h ed r ys o i le n v i r o n m e n t t h i si st of u r t h e rr e v e a lt h ec e l ls t r u c t u r eo fg e n e t i cc h a n g e so fs o i lc i l i a t e s ，t h e e s t a b l i s h m e n to fc e l l m o d e l ，s p e c i e sc l a s s i f i c a t i o n ，a n d w ec a nh a v em o r e u n d e r s t a n d i n g so ft h e i rp l a c ei nt h es y s t e m s t u d y i n gs o i lc i l i a t e sa n dt h es t a t u so ft h e p r o c e s so fe v o l u t i o nh a si m p o r t a n tb i o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e i nt h i ss t u d y , w eu s e d t e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l aa st h ee x p e r i m e n t a lm a t e r i a lo fs o i l c i l i a t e s ，a p p l y i n g f l u o r e s c e n c e l a b e l i n gm e t h o d ( f l u t a x ) ，a n t i - a t u b u l i n a n t i b o d y f l u o r e s c e n c e l a b e l i n g ，s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) a sw e l la st h er a p dt e c h n o l o g y , n o t o n l y i n t h e m i c r o s c o p i c l e v e la n d s u b m i c r o s c o p i cl e v e l ，t oo b s e r v ea n dc o m p a r et h es t r u c t u r ea n du l t r a s t r u c t u r eo ft h e v 摘要 e x t e r n a lm o r p h o l o g yo ft h en o r m a lc e l l sa n dr e s t i n gc y s t s ，t h ec i l i a t ec o r t e x ，t h e c y t o p l a s ma n di t sv a r i o u so r g a n e l l eo ft e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l a ，b u ta l s o ，f r o mg e n e l e v e l ，t h em a c r o n u c l e a rd n a so ft h en o r m a lc e l la n dr e s t i n gc y s to ft e r r i t r i c h a s t r a m e n t i c o l aw e r ec o m p a r e da n ds t u d i e d t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 m o r p h o l o g yo fm i c r o t u b u l a ro r g a n e l l ei nt e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l a t h em i c r o t u b u l a r o r g a n e l l e si n t h ec o r t i c a lc i l i a t u r eo ft h es o i lc i l i a t ez s t r a m e n t i c o l aw e r ev i s u a l i z e d b yd i r e c t f l u o r e s c e n tl a b e l i n go ff l u t a xa n d i m m u n o f l u o r e s c e n tl a b e l i n gu s i n ga n t i - - at u b u l i na n t i b o d y t h ed i s t r i b u t i o np a t t e r no f b a s e a s s o c i a t e dm i c r o t u b u l e sw e r ef o u n dt ob ei na c c o r d a n c ew i t ht h a to fa d o r a lz o n e m e m b r a n e l l e s ( a z m ) ，u n d u l a t i n gm e m b r a n e s ( u m ) ，f r o n t a l v e n t r a l t r a n s v e r s ec i r r i ( f v t c ) ，l e f t - r i g h tm a r g i n a lc i r r i ( l - r m c ) a n dd o r s a lk i n e t i e s ( d k ) t h ec y t o s k e l e t o n o fa z ma n du mw a sc o m p o s e do fm e m b r a n e l l eb r a c k e t s ，m e m b r a n e l l e - a s s o c i a t e d m i c r o t u b u l e sa n dt h es k e l e t o no fu m t h ea n t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ( a l m ) ， p o s t e r i o rl o n g i t u d i n a lm i c r o t u b u l e s ( p l m ) a n dt r a n s v e r s em i c r o t u b u l e s ( t m ) w e r e l o c a t e di nt h eb a s a lp a r to fn 厂1 a l m ，p l m ，t ma n ds p r o u t e dm i c r o t u b u l e s ( s m ) w e r es i t u a t e di nt h eb a s a lp a r t so fl m ca n dr m c a l ma n dp l mw e r ev i s u a l i z e di n t h eb a s a lp a r to fd k t h eb a s eo ft r a n s v e r s ec i r r i ( t c ) c o n t a i n e dc o m p a r a t i v e l y d e v e l o p e db u n d l e so ft m t h eo c c u r e n c eo fs ma n dt h el o c a t i o no ft m i nt h eb a s a l p a r t so fl - 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l i k es t r u c t u r e sa tt h et e r m i n a lp a r t o ff r o n t a ls u r f a c er e g i o nw h e r en oc i l i u mi sp r e s e n t a tt h er e m a i n i n gn o n - c i l i a t e d s u r f a c er e g i o no ft e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l a , t h e r ed i s t r i b u t e dal a r g en u m b e ro f u n e v e n l ya r r a n g e ds h a l l o wp i t s t h e s em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sm i g h tb et h e a d a p t i v ec h a n g et ot h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ec i l i a t ea n dt h es o i le n v i r o n m e n t t h e f o r m a t i o no ft h er e s t i n gc e l l si sa l s oar e s u l tt oa d a p tt ot h es o i le n v i r o n m e n t 3t h ei n t e r n a lu l t r a s t r u c t u r eo ft h en o r m a lc e l la n dr e s t i n gc y s to ft e r r i t r i c h a s t r a m e n t i c o l a t h ei n t e r n a lu l t r a s t r u c t u r eo ft e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l aw a so b s e r v e db yu s i n g t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y w ef o u n dt h a ti t ss u r f a c em e m b r a n ew a sc o m p o s e d o ft h ep l a s m am e m b r a n ea n dt h ec e l lm e m b r a n e w ea l s oo b s e r v e dt h a tt h e r ew a s d e n s ef i b e rb u n d l e sc l o s et ov e n t r a ls u r f a c em e m b r a n ei nt h et e r r i t r i c h a s t r a m e n t i c o l a i t sl i p s ，v e n t r a lc i r r ia n dm o u t hc o r t e xs u r f a c em e m b r a n eg a t h e r e d u n d e rt h ef o r m a t i o no ft h i c kf i b e rb u n d l eo rf i b e rt a p e t h e s ef i b e rb u n d l es t r u c t u r e s a l l o w e dt e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l a s u r f a c em e m b r a n et ob er e i n f o r c e dc a t e r p i l l a rt o a d a p ti t sc r a w l i n gl i f ei nt h es o i l t h ec y s to ft e r r i t r i c h as t r a m e n t i c o l ac o n t a i n e dl a r g e a m o u n t so fm i t o c h o n d r i ac y s tc a t e r p i l l a r sa n df o o db u b b l e s ，w h i c hm i g h tb er e l a t e dt o f o o dd i g e s t i o na n de n e r g ys t o r a g e l a r g e s tn u c l e a re l o n g a t e dc y l i n d r i c a l ，n u c l e a r m e m b r a n ew a sn o ts m o o t h ，s h o w i n gw a v y c h r o m a t i ng r a n u l e ss c a t t e r e di n l a r g e n u c l e i ，a r r a n g e dr a t h e rs l o p p y , a n ds o m ef a m i l yr e u n i o n i n t oah i g he l e c t r o nd e n s i t yo f t h es i z e so ft h ec l u m p s ，n u c l e o l u sh i g hn u m b e ro fs c a t t e r e dl a r g en u c l e u s ；m e m b r a n e w a sd i v i d e di n t ot w ol a y e r s ，i n n e rn u c l e a rm e m b r a n ea n do u t e rn u c l e a rm e m b r a n e i n n e rn u c l e a rm e m b r a n ew a st h i c k e r , b u to u t e rn u c l e a rm e m b r a n ew a sv e r yt h i n t h e n u c l e a rp o r e l i k es t r u c t u r em a d et h en u c l e a rm e m b r a n ei n t ot h ed o t t e dl i n e a f t e rt h e f o r m a t i o no fc y s t s ，c y s tw a l lb e c a m et w ol a y e r s t h i sk i n do fs t r u c t u r eh a dn o tb e e n f o u n di no t h e rc i l i a t e s m e m b r a n ec o n s i s t so ft w ol a y e r so fi t sc o m p o s i t i o n d u r i n g v 摘要 h o l l o wa r e a ，o fw h i c ht h e r ew e r em a n ys m a l lm e m b r a n es e p a r a t i o n ，w a st h e i ru n i f o r m s q u a r ec h a m b e r t h e ya r r a n g e di nn e a tr o w sl i k eas q u a r ew i t hac i r c l ec i r c u i ti nc e l l s p e r i p h e r a l c y s t sh a v et w oa u t o p h a g i cv a c u o l e s ：o r g a n e l l ea u t o p h a g i cv a c u o l e s ，a n d c y t o p l a s m i ca u t o p h a g i cv a c u o l e s 4t h e c o m p a r i s o no fm a c r o n u c l e a rd n af r o mn o r m a lc e l l sa n dr e s t i n gc y s t so f t h em a c r o n u c l e a rd n af r o mn o r m a lc e l l sa n d r e s t i n gc y s t so ft e r r i t r i c h a s t r a m e n t i c o l aw a sc o m p a r a t i v e l ya n a l y z e db yu s i n gr a p d t e c h n o l o g yi nt h ep a p e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tn of r a g m e n t sp r o d u c e du s i n g2r a n d o mp r i m e r s ，1 3 4 f r a g m e n t sw e r ea m p l i f i e df r o m m a c r o n u c l e a rd n a so ft h en o r m a lc e l l sa n dt h e r e s t i n gc y s t su s i n