（化学工程专业论文）β甘露聚糖酶活性基因探讨及固定化研究.pdf

摘要 摘要 本论文对地衣芽孢杆菌6 一甘露聚糖酶进行了侧链基团专一性化学修 饰和固定化研究 依据文献报道 在确定适宜的修饰条件下 分别用1 6 种典型侧链基 团修饰剂对纯化b 一甘露聚糖酶进行修饰研究 被修饰的侧链基团主要包 括羧基 巯基 二硫键 氨基 胍基 羟基 酚基 甲硫基 咪唑基和 吲哚基 结果发现 甲硫基修饰剂 咪唑基修饰剂和吲哚基修饰剂等与 酶发生反应后 酶活力急剧下降 初步认为蛋氨酸残基 组氨酸残基和 色氨酸残基等可能为地衣芽孢杆菌6 甘露聚糖酶的活性必需基团 通过化学修饰动力学和统计学分析以及底物保护下的修饰反应 进 一步表明 地农芽孢杆菌6 一甘露聚糖酶必需活性基团中包含有蛋氨酸 色氨酸及组氨酸等残基 在修饰剂浓度远远大于酶浓度的条件下 修饰 反应为拟一级反应 酶必需活性基团中有一个蛋氨酸残基 两个色氨酸 残基 一个组氨酸残基 对已知分子结构的6 甘露聚糖酶 如tr e e s e im a n 5 a tf u s c a m a n 5 a 户c e l l u l o s am a n 2 6 a 进行分析 表明地衣芽孢杆菌 一甘露聚糖酶 分子的折叠结构为典型的 d 8 桶式结构 分子表面有 个裂缝状凹槽的 催化活性拓扑结构 有两个g l u 残基为催化活性基团 分别起到催化和 亲核试剂的作用 一个h i s 残基在催化过程中起识别调节作用 而参与酶 催化过程的两个t r p 残基中一个为催化位提供一个疏水性面 另一个起 到调控底物结合的作用 而m e t 残基可能起到稳定化酶分子活性位环境 的作用 在专一性化学修饰的研究基础上 对该酶进行了固定化研究 选用 氨基载体 如s i l n i 1 2 c h i t n h 2 d 一3 8 0 n h 2 作固定化载体 三种醛基功 能试剂 甲醛 乙二醛 戊二醛 活化处理氨基载体为二级反应 选用乙 二醛活化处理载体固定化酶时较优 对固定化参数 如乙二醛浓度 活化 处理时间 偶联时间 给酶浓度等 进行了优化研究 并制得了三种固定 化酶 与游离酶相比 固定化酶最适p h 均向碱性方向偏移 酶活性最适温 度均变高 酶稳定性 包括酸碱稳定性 热稳定性 贮存和操作稳定性1 均 天津大学博士学位论文b 一甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究 得到提高 固定化酶酶促水解角豆胶半乳甘露聚糖和魔芋葡甘聚糖反应 动力学遵循米氏动力学方程 本文还探讨了固定化酶连续酶解调控魔芋 葡甘聚糖产物分子量的操作方式 最后结合b 甘露聚糖酶化学修饰与固定化的研究结果 分析了酶专 一性化学修饰与酶固定化之间的关系 重点讨论了专一性化学修饰对酶 固定化研究的指导意义 主要体现在四个方面 1 探测酶分子表面特性 与侧链基团性质以及与酶活性间的关系 2 固定化策略的确定 3 固定 化载体材料的表面分子结构设计 4 酶固定化中双功能试剂的遴选与设 计 关键词 d 一甘露聚糖酶专一性化学修饰活性基团固定化反应动力学 a b s 订a c t a b s t r a c t s p e c i f i cc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n a n di m m o b i l i z a t i o no fb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sp m a n n a n a s ew e r es t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n o nt h eb a s i so ft h ep r e v i o u s l yr e p o r t e dm o d i f i c a t i o nc o n d i t i o n s t h e p u r i f i e de n z y m e w a sm o d i f i e dw i t l l1 6g r o u p s p e c i f i c r e a g e n t s w h i c hm a i n l y r e a c t e d i 也c a r b o x y l s u l f l a y d r y l 一 a m i n o 一 g u a n i d o h y d r o x y l p h e n o l m e t h y t h i o 一 i m i d a z o l y l a n di n d o l y l g r o u p s a n d d i s u l f i d eb o n d a f t e r m o d i f y i n g w i t hm e t h y t h i o 一 i m i d a z o l y l a n di n d o l y l m o d i 蛳n gr e a g e n t s t h e s h a r pd e c l i n e so ft h ee n z y m ea c t i v i t y o fb m a n n a n a s ew a sf o u n d i tw a s i n d i c a t e dt h a t m e t h i o n i n e h i s t i d i n e a n dt r y p t o p h a n r e s i d u e s m i g h t b e e s s e n t i a lg r o u p so f t h ee n z y m e a c t i v i t y i tw a sf u r t h e rc o n f n m e dt h a tt h e s er e s i d u e sw e r et h ee s s e n t i a lg r o u p so f t h ep m a r m a n a s ea c t i v i t yt h r o u g hk i n e t i ca n ds t a t i s t i ca n a l y s i so fc h e m i c a l m o d i f i c a t i o n a n dm o d i f y i n gr e a c t i o nu n d e rs u b s t r a t ep r o t e c t i o n w h e nt h e c o n c e n t r a t i o n so ft h em o d i f y i n g r e a g e n t so v e r w e i g h t e d t h ec o n c e n t r a t i o no f t h ee n z y m e t h em o d i l y i n gr e a c t i o n sc o m p l i e dw i t ht h ep s e u d of t r s t o r d e r r e a c t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sam e t h i o n i n e t w ot r y p t o p h a n s a n dah i s i t i d i n ei nt h ea c t i v e s i t eo fb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i si j m a n n a n a s e b ya n a l o g y w i t l lt h r e e1 3 m a n n a n a s e so w n i n g d e f i n i t e l yh i g h e rs t r u c t u r e s e g rr e e s e im a n 5 a tf u s c am a n 5 a pc e l l u l o s am a n 2 6 a i ti ss h o w e d t h a tb a c i l l u sl i c h e n 拆o r m i sp m a u n a n a s em a y p r e s e n tt h ef o l d e da r c h i t e c t u r e o ft h ec l a s s i c a l p a 8 b a r r e lm o t i f t h a tt h ee n z y m em o l e c u l a rs u r f a c em a y o w nac a t a l y t i cc l e f t g r o o v eo ft h ea c t i v e s i t et o p o l o g y t w og l ur e s i d u e si n t h ea c t i v e s i t e m a yp e r f o r m t h er o l e so f c a t a l y t i cp r o t o n d o n o ra n d n u c l e o p h i l e r e s p e c t i v e l y a h i sr e s i d u ei nt h ea c t i v e s i t em a yb er e s p o n s i b l e f o rt h e h y d r o g e nb o n d m e d i a t e dr e c o g n i t i o no ft h e h o c 3 t w ot r p r e s i d u e si nt h ea c t i v e s i t em a yt a k ep a r ti nt h ec a t a l y t i cc o u r s e w h i c ho n e m a yp r o v i d eah y d r o p h o b i l cs u r f a c ef o rt h e f a c eo ft h ep y r a n o s i d er i n gi n t h e c a t a l y t i cs i t e t h e o t h e rm a yb er e s p o n s i b l ef o rt h em e d i a t i o no ft h e s u b s t r a t eb i n d i n g am e tr e s i d u ei nt h ea c t i v e s i t em a ys t a b i l i s et h ea c t i v e s i t e e n v i r o n m e n t a c c o r d i n g t ot h er e s u l t so ft h ec h e m i c a l m o d i f i c a t i o n t h ee n z y m e i m m o b i l i z a t i o nw a sc a r r i e do u t a s i m m o b i l i z i n gs u p p o r t s t h r e e a m i n o s u p p o r t s i n c l u d i n gs i l n h 2 c h i t n h 2 d 一3 8 0 一n h 2 w e r ea c t i v a t e d i i i a b s t r a c t w i 血t h r e ea l d e h y d e f u n c t i o n a lr e a g e n t sf c o n t a i n i n gf r o m a l d e h y d e g l y o x a l g l u t a r a l d e h y d e w h i c ha c t i v a t i n gr e a c t i o n sf o l l o w e ds e c o n d o r d e rr e a c t i o n t h ea c t i v i a t e d s u p p o n sb yg l y x o a l m o r e s u i t a b l y i m m o b i l i z e dt h e l b m a n n a n a s e t h a nt h o s e b yf o r m a l d e h y d e a n d g l u t a r a l d e h y d e s o m e p a r a m e t e r s e g c o n c e n t r a t i o n o fg l y x o a l a c t i v a t i n gt i m e c o u p l i n gt i m e a d d i n ge n z y m ec o n c e n t r a t i o n w e r eo p t i m i z e d i nt h e p r o c e s s o f i m m o b i l i z a t i o n a n dt h r e ei m m o b i l i z e de n z y m e s w e r eo b t m n e d c o m p a r e d w i t ht h ef r e eb m a n n a l l a s e s o m ep r o p e r t i e sw e r ef o u n da r e r t h ei m m o b i l i z a t i o no nt h ea m i n o s u p p o r t s 1 o p t i m u m i ss h i f tt ow e e k l y b a s i cs i d e 2 o p t i m u mt e m p e r a t u r e sb e c o m eh i g h e r a n d3 t h ei r r t m o b i l z e d e n z y m e s t u r nm o r es t a b l ei nt h ea s p e c t so fa c i d b a s i c t h e r m a l s t o r a b l e a n d o p e r a t a b l es t a b i l i t y t h e r e a c t i o nk i n e t i c so ft h e e n y z m a t i ch y d r o l y s i s o f l o c u s t g a l a c t o m a r m a n a n d k o n j a cg l u c o m m m a n w i t ht h ei m m o b i l i z e d 1 3 m a n n a n a s e sf o l l o w e dm i c h a e l i s m e n t e n sk i n e t i c s i nt h et h e s i s i tw a sa l s o d i s c u s s e dh o w t oo p e r a t et h ec o n t i n u o u sr e a c t i o no f k o n j a cg l u c o m 锄a nw i t h t h ei m m o b i l i z e d 1 3 m 锄n a n a s e t om e d i a t et h em o l e c u l a r w e i g h t o ft h e e n z y m o l y s i sp r o d u c t b ya n a l y z i n g t h er e s u l t so fm o d i f i c a t i o na n di m m o b i l i z a t i o no fb a c i l l u s l i c h e n i f o r r n i sg m a n n a n a s e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n e n z y m e s p e c i f i c m o d i f i c a t i o na n de n z y m ei m m o b i l i z t i o nw a sd i s c u s s e d b u ti tv c a sf o c u s e do n t h eg u i d a n c es i g n i f i c a n c eo f s p e c i f i cm o d i f i c a t i o ni nt h ec o l l r s eo fs t u d yo n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t h es i g n i f i c a n c ew a si n c a r n a t e df r o mf o u ra s p e c t s 1 d e t e c t i o nt h e p r o p e r t i e s o fs u r f a c ea n d s i d e c h a i n g r o u p s i nt h e e n z y m e m o l e c u l e a n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ns u r f a c e s i d e c h a i n g r o u p s a n dt h e e n z y m ea c t i v i t y 2 s e l e c t i o no f t h ei m m o b i l i z i n gs t r a t e g y 3 d e s i g no ft h e s u r f a c es t r u c t u r eo ft h ei m m o b i l i z i n gs u p p o r t a n d4 s e l e c t i o na n dd e s i g no f b i f u n c t i o n a lr e a g e n t si nt h ep r o c e s so f i m m o b i l i z a t i o n k e y w o r d s 1 3 m a r m a n a s e s p e c i f i c a l l yc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n a c t i v e g r o u p i m m o b i l i z a t i o n r e a c t i o nk i n e f i c s i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和 取得的研究成果 除了文中特别加以标注和致谢之处外 论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得鑫洼盘堂或其 他教育机构的学位或证书而使用过的材料 与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意 学位论文作者签名 前乐腭 签字曰期 9 年7 月y 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤壅盘堂有关保留 使用学位论文 的规定 特授权墨鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库迸行检索 并采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编以供 查阅和借阅 同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 保密的学位论文在解密后适用本授权说明 一躲前眦 签字日期 年7 月 日 磬五日 何 獬 隰 骱 辩 西卵 舂泊 虿 p0 m y 名 期 一 蝴 前言 刖舌 在后基因时代 p o s t g e n o m i ce r a 分子和细胞生物学中最后一个前 沿 糖生物学和糖生物工程是新世纪研究热点中的热点 醣类活性 酶 c a r b o h y d r a t e a c t i v ee n z y m e s 既是糖生物学和糖生物工程研究的工 具 也是实现糖生物产品产业化和工业化的关键 作为重要醣类活性酶 之 p 1 4 d 甘露聚糖酶 d 1 4 d m a l l n a r li l l a n l l a n o h y d r o l a s e e c 3 2 1 7 8 又简称为p d 甘露聚糖酶或p 一甘露聚糖酶 p d m a i l l l a n a s e p m a n n a n a s e 是一类半纤维素酶 能随机水解含有p 1 4 一d 一甘露糖苷键 的甘露寡糖 甘露多糖 包括甘露聚糖 半乳甘露聚糖 葡甘聚糖等 产生一些小分子甘露寡糖 一种性能优越的双歧因子 在食品 医药 造纸 石油和糖链结构等研究中扮演重要的角色 在今天 虽然x 射线晶体衍射法 多维核磁共振法等先进实验手段 广泛用于研究酶活性结构和催化机制 但专一性化学修饰仍是一种重要 的研究手段 侧链基团专一性化学修饰d 甘露聚糖酶有助于了解酶的活 性结构以及催化底物水解的机理 为酶分子的改性 化学修饰 固定化 提供可靠的理论依据 并为酶的实际应用提供指导 相比游离酶 固定化酶可以回收重复使用 可实现酶反应连续化自 动化 产品质量高 固定化酶的方法主要有非共价结合法 化学结合法 和包埋法 其中采用化学结合法制备的固定化酶具有相当高的稳定性 是最为常用的方法之一 魔芋是我国西南地区的特有经济作物 其主要成分葡甘聚糖是一种 高分子高粘度化合物 常用作食品原料与食品添加剂 近年来 已有一 些用作膜与缓释材料以及组织工程中的骨架材料等方面的报道 如用b 甘露聚糖酶及其固定化酶对葡甘聚糖进行适当的改性 可以获得高附加 值的双歧因子低聚甘露糖 中等分子量的寡糖缓释材料 这些新用途拓 宽了魔芋葡甘聚糖的应用范围 使原料大幅度增值 具有重大的经济和 社会效益 1 9 9 5 年以来 很多人对地衣芽孢杆菌b 甘露聚糖酶进行了较为深入 的研究 主要包括 菌体产酶的适宜条件 酶学性质和酶解魔芋葡甘聚 糖制备低聚甘露糖等 天津大学博士学位论文b 甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究 本文在前人的研究基础上 对地衣芽孢杆菌b 甘露聚糖酶进行专一 性化学修饰和固定化研究 具体内容包括 1 用典型的专一性侧链基团修饰剂对b 甘露聚糖酶进行修饰研究 初步确定出与b 一甘露聚糖酶活力有直接关系的残基 2 运用化学修饰动力学和统计学分析方法详细研究b 甘露聚糖酶的 专一性化学修饰 同时结合底物保护下的修饰 确定出必需氨基酸残基 数 3 选用三种典型的氨基载体作为固定化载体 研究相应载体固定化 酶的最佳方案和条件 4 对固定化酶的酶学性质 动力学特征 水解特性 进行较为系统 的研究 并与游离酶的酶学性质进行比较 5 探讨固定化酶连续水解的可行性和工艺条件 6 结合p 甘露聚糖酶的专一性化学修饰和固定化研究结果 分析二 者之间的联系 为酶固定化研究提供可靠的理论依据 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1p 甘露聚糖酶的研究进展 b 1 4 d 甘露聚糖酶 1 1 3 1 4 一d m a n n a nn l a n n a l o h y d r o l a s e e c 3 2 1 7 8 简称为1 3 9 一甘露聚糖酶或p 甘露聚糖酶 p d m a r m a n a s e 1 3 m a r m a n a s e 是一类半纤维素酶 能够随机水解含有p l 4 d 一甘露糖苷 键的甘露寡糖 甘露多糖 包括甘薅聚糖 半乳甘露聚糖 葡甘聚糖等 的糖基水解酶 3 7 1 它隶属于醣类活性酶峭1 在食品 医药 造纸和石油 等方面有广泛的应用 1 1 1 醣类活性酶的研究及其分类 1 1 1 1 醣类活性酶的定义与其酶属 醣类活性酶婵1 c a r b o h y d r a t e a c t i v ee n z y m e s 是一类作用于糖苷键的 生物活性催化剂 涉及到糖苷键的降解 修饰 生成 醣类活性酶广泛 存在于自然界内 是生物圈内碳循环过程中必不可少的催化剂 依据酶 对糖苷键作用方式的不同 可以分为四大酶属 8 j 糖苷酶和转糖苷酶 g l y c o s i d a s e sa n dt r a n s g l y c o s i d a s e s e c3 2 1 一 糖基转移酶q l y c o s y l t r a n s f e r a s e s e c2 4 一 多糖裂合酶 p o l y s a c c h a r i d el y a s e s e c4 2 2 和 碳水化合物酯化酶 c a r b o h y d r a t ee s t e r a s e s 第一大酶属是糖基水解酶群 e n z y m eg r o u p so f o g l y c o s y lh y d r o l a s e s 能够水解两个或以上碳水化合 物单体之间或碳永化化合物单体与非碳水化合物部分之间的糖苷键 3 7 在二糖 寡糖和多糖的生物合成过程中涉及到数以百计的糖基转移酶 催化糖分从供体分子向受体分子的转移而形成新的糖苷键 多糖裂合酶 通过b 构型消去机制来催化切断多糖链 进而在非还原糖端形成 个新 双键 碳水化合物酯化酶催化取代糖n 脱乙酰化或o 一脱乙酰化 醣类活 性酶之四大酶属的 些具体特性见表1 1 在后基因时代 p o s t g e n o m i ee r a 醣类活性酶在被誉为 分予和细 胞生物学中最后一个前沿1 9 的简单和复杂碳水化合物研究中将迎来巨大 的挑战 1o j 随着计算机和网络技术的发展 使得大量资源得以共享 推 天津大学博士学位论文b 甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究 动了醣类活性酶和糖科学的迅速发展1 1 1 而p 甘露聚糖酶隶属于糖昔水 解酶属 并且其酶类丰富和研究较为全面 表l 1 醣类活性酶的四大酶属嘲 t a b l e1 1 f o u re n z y m eg r o u p so f c a r b o h y d r a t ea c t i v e e n z y m e s 糖基水解酶糖基转移酶多糖裂合酶碳水化台物酯化酶 酶族 e c n o 催化 机制 9 0 3 2 1 6 51 2 1 3 2 4 4 2 2 不确定 毛耋鬈冀霎黥鬻震姜鬻晰型消除艺嚣篆看裟筹构型维持或转换单取代构型转换 乙酰或z n 催化脱乙酰 1 1 1 2 糖基水解酶的分类与结构特征 糖基水解酶分类方法很多 最为经典的是e cf e n z y m ec o m m i s s i o n 分类法 它是依据国际生物化学和分子生物学协会 i n t e r n a t i o n a lu n i o no f b i o c h e m i s t r ya n d m o l e c u l a r b i o l o g y i u b m b 命名委员会的规定 主要基 于其作用底物专一性 偶尔也基于其分子机理 但不能恰当反映酶分子 的结构特征1 8 上世纪九十年代 法国的科学家h e n r i s s a t 4 5 1 等根据酶分 子氨基酸序列同源性和疏水簇分析 h y d r o p h o b i cc l u s t e ra n a l y s i s h c a 糖基水解酶被分为9 0 个酶族1 8 j 与单独的底物专一性相比 更好地反映 了酶分子的结构特点 有助于揭示酶分子间的进化关系 为推演机理信 息提供了方便的工具 蛋白质的折叠比其序列更为保守 一些糖基水解 酶酶族归类在一起形成超族 s u p e r f a m i l y 或者部族 c l a n 反映了蛋白质 的折叠具有同源性1 5 j 见表1 2 8 j 糖苷键的酶解通过广义酸碱催化机制进行 通常需要两个关键的残 基 一个质子供体和一个亲核基团 糖基水解酶水解底物主链糖苷键过 程中 其异头体构型存在两种运动形式 构型维持与转换pj 由此糖基水 解酶可分为构型维持酶和构型转换酶 其水解机理如图1 1 糖基水解酶结构中至少具有一个催化域 c a t a l y t i cd o m a i n 有的具有 多个催化域 但大多数糖基水解酶具有多个结构域 除作为催化域外 还有底物结合域 s u b s t r a t e b i n d i n gd o m m n 有的甚至还有一个连接子 1 i n k e r 连接催化域和底物结构域 3 3 1 而酶的催化活性位通常位于酶 的催化域中 比较分析一些糖基水解酶的x 射线衍射晶体结构 三种典 型的活性位拓扑结构也被揭示 7 1 口袋状凹槽 p o c k e t g r o o v e 裂缝状凹 槽 c l e f t g r o o v e 和隧道孔 t u n n e l 如图1 2 所示 笔者认为 这些拓 第一章文献综述 扑结构是通过研究酶晶体结构而发现的 在溶液状态下酶分子结构中可 能存在凸状 b u l g e 结构 甚至可能有触角式 a n t e n n a 活性结构 g h 图1 1 糖基水解酶的催化机理 a 构型维持 b 构型转换 f i g1 1 c a t a l y t i cm e c h a n i s m so f g l y c o s y lh y d r o l a s e s a r e t a i n i n g b i n v e r t i n g 表1 2 糖基水解酶酶族归类 t a b l e1 1 c l a n so f r e l a t e df m i l i e si ng l y c o s y lh y d m l a s e s t 55 置 一 曼 翌 竺 蔓 g h a 1 3 a 8 1 2 5 5 1 5 9 7 2 7 2 6 3 7 9 0 5 矗3 9 4 2 g h g 3 7 6 3 g h k 1 3 a b 1 8 2 0 g h l a a 6 1 5 6 5 g h m a t t 6 8 4 8 5 q 会黑 一 f奢鼋 尹 一 孓嘻 善 一鼻带 天津大学博士学位论文p 一甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究 图1 2 糖基水解酶的三种典型活性位拓扑结构 a 口袋状凹槽 b 裂缝状凹槽 c 隧道孔 f i g1 2 t h et h r e et y p e so fa c t i v es i t ef o u n di ng l y c o s y l h y d r o l a s e s a p o c k e t g r o o v e b c l e f t g r o o v e c t u n n e l 1 1 1 3 醣类活性酶与糖生物学 糖生物工程和寡糖工程 糖生物学作为基因组学和蛋白质组学的一个延伸 1 2 研究糖缀合物糖 链的结构 生物合成和生物学功能 寡糖和多糖的生物合成 修饰和降 解是在醣类活性酶作用下实现 因此 醣类活性酶在糖生物学中常作为 工具酶被用来加工糖链 尤其在寡糖工程1 1 3 中 利用醣类活性酶中的水 解酶类水解天然多糖制备低聚糖 一类重要的双歧因子 能有效地促 进肠道内双歧杆菌的自然增殖 如利用地衣芽孢杆菌b 甘露聚糖酶水解 魔芋葡甘聚糖制备的低聚甘露糖就是性能优越的双歧因子 1 4 l 1 1 2p 甘露聚糖酶的研究进展 早在二十世纪初 就有分解植物甘露聚糖的酶的最初报道 对6 一甘露 第一章文献综述 聚糖酶的研究始于上世纪5 0 年代末6 0 年代初 人们在研究甘露多糖及 其水解时发现的 1 9 5 8 年c o u r t i o s 首先发现了真菌能够产生p 一甘露聚糖 酣16 1 9 6 0 年w i l l i a m s 和d o e t s c h 发现细菌也能产生p 一甘露聚糖酶m 1 9 6 5 年r e e s e 和s h i b a t a 给出了b 一甘露聚糖酶的概念和定义标准1 2 j 在一 些高等生物中 如海洋软体动物l i t t o r i n ab r e v i c u l a l 驯和m y t i l u se d u l i s i i 圳 体内 豆类植物如四棱豆 长角豆 瓜胶等萌发的种子中 天南星科 f a r a c e a e 植物魔芋萌发的球茎中发现有活性酶存在 2 特别是随着人们 对自然界的第二大植物多糖资源 半纤维素的开发利用和低聚甘露糖 药用价值的发现 卜甘露聚糖酶的研究迈入新的一个台阶 关于p 甘露 聚糖酶的基础研究和应用研究现状在以前的论文1 1 4 捌j 已详细综述 下面 对b 甘露聚糖酶的基因克隆 分类 结构学特征和催化机理研究情况进 行综述 1 1 2 1b 甘露聚糖酶的基因克隆与表达 研究甘露聚糖酶基因克隆 可以构建高表达工程菌 得到高产菌株 研究d 一甘露聚糖酶基因表达和控制 得到大量酶蛋白 用于研究酶蛋白 改性及应用研究等 1 9 8 9 年 日本学者a k i n o 等人继1 9 8 7 1 9 8 8 年报道 了一株嗜碱性芽孢杆菌 a l k a l o p h i l i c b a c i l l u ss p s t r a i n a m 0 0 1 所产的胞 外p 一甘露聚糖酶和p 甘露糖苷酶的性质后 成功地从该菌株中克隆出b 一 甘露聚糖酶基因并在大肠杆菌中得到表达 2 2 1 1 9 9 5 年 瑞典学者s t h l b r a n d 等人用u n i z a p x r 载体构建了里氏木霉b 甘露聚糖酶的c d n a 文库 并 在酵母多拷贝表达载体p a j 4 0 1 上克隆 把获得的质粒p r i s m 3 0 导入酿酒 酵母中表达 检测到了胞外b 甘露聚糖酶的活性 其分子量为7 5 k d a 2 3 1 还有很多有关p 甘露聚糖酶的基因克隆与表达的报道 详见1 3 尤其是 1 9 9 6 年加拿大学者m a r g a 等人 硎利用基因克隆技术把s t r e p t o m y c p j l i v i d a n sp 甘露聚糖酶基因的启动子置换成 a c p 与野生菌株相比产酶量 增加了3 5 0 倍 对不同来源b 甘露聚糖酶基因克隆 获得了不少有关酶 的序列 结构及基因表达调控等许多信息 为酶分子改造奠定了很好的 基础 1 1 2 2b 甘露聚糖酶的分类 能够水解甘露糖苷键的酶除p 甘露聚糖酶外 还有几种 但彼此之间 天津大学博士学位论文b 甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究 极易混淆 表1 4 基于酶对糖苷键作用方式进行分类 表i 3 b 甘露聚糖酶的基因克隆与表达 t a b l e1 3 c l o n i n ga n de x p r e s s i n go f f l m a n n a n a s e s 在p 一甘露聚糖酶分类和鉴定时 需考虑作用底物 产物 酶分子结 构等多方面的因素 1 9 8 3 年 a r s k i 根据b 甘露聚糖酶水解甘露聚糖的糖 链要求不同分为 能水解甘露三糖及三糖以上的称为第 类b 甘露聚糖 酶 能水解甘露四糖及以上的但不能水解甘露三糖的称为第二类肛甘露 聚糖酶 只能水解甘露五糖及以上的称为第三类p 甘露聚糖酶 4 二十 世纪九十年代 法国学者h e n d s s a t 提出了根据酶蛋白质的氨基酸序列同 源性1 4 5 和蛋白质分子的疏水簇分析 4 2 4 3 对糖基水解酶进行分类 把糖基 水解酶分为9 0 个家族 8 1 和1 3 个超族 g h a mc l a n h e n r i s s a t 等人的分 类系统 与以往根据酶对底物特异性的分类系统相比 更能体现出酶分 子的结构特点 这样即便在不了解酶的反应性时 也可以根据酶蛋白或 第一章文献综述 酶基因甚至功能活性区序列进行分类 1 9 9 5 年 f a n u t t i 等人m 依据 h e n r i s s a t 等人的分类系统原理 将6 甘露聚糖酶分为三类 与第2 6 糖 基水解酶家族中的水解酶类有很强同源性的为第一类甘露聚糖酶 如芽 表1 4 甘露糖苷键水解酶的比较 删 t a b l e1 4 c o m p a r a s i o no f h y d r o l a s e so f m a n n o s i d el i n k a g e s 名称及国际 性 水解特点 转糖产物反应 系统分类号质苷化异构速度 甘露糖苷酶 外 从 糖苷键甘露聚 叶d m a r m o s i d a s e 切糖链的非还原端逐有无慢 e c3 2 1 2 4 酶 个切下d 甘露糖 b d 甘露糖苷酶 外 从b 一糖苷键甘露聚糖 1 3 d m a n n o s i d em a n n o h y d r o l a s e 切链的非还原端逐个有无慢 e c3 2 1 2 5 酶切下d 甘露糖 a 1 2 1 3 甘露糖苷酶 外水解酵母甘露聚糖 u 1 2 1 3 m a n n a nm a n n o s i d a s e 切 中的1 2 一和1 3 糖苷慢 e c3 2 1 7 7 酶键 释放出甘露糖 b 甘露聚糖酶 内随机水解甘露聚糖 肛1 4 m a n n a nm a n n a n o h y d m l a s e 切 8 1 4 糖苷键 形成一 轻微无快 e c3 2 1 7 8 酶 系列低分子寡糖 b 甘露二糖酶 外从b 糖苷键甘露聚 1 4 b d m a n n a na n n o b i o h d r o l a s e切糖链的非还原末端无有慢 e c3 2 1 1 0 0 酶 逐个切下甘露二糖 8 1 6 甘露糖苷酶 内 随机水解直链b 一1 6 1 6 一b d m a n n a nm a r m o s i d a s e切甘露聚糖形成一系 e c3 2 1 1 0 1 酶 列低分子寡糖 a 1 2 甘露糖昔酶 外 水解m a r l 9 g i c n a c 2 1 2 e x o m a n n o s i d a s c 切寡糖的d i 2 一d 甘露 b c 3 2 1 1 1 3 酶 糖端 c t i 3 1 6 甘露糖苷酶 水解m a n s g l c n a c 3 m l 3 1 6 m a n n o s i d a s e寡糖的a 1 3 和 e c3 2 1 1 1 4 1 6 d 甘露糖端 1 2 甘露糖苷酶 内 水解m a n g g l c n a c 2 e n d o 廿1 2 m a n n o s i d a s e切 寡糖的n 葡萄一1 3 一甘 e c3 2 1 1 3 0 酶 露糖单元端 l 2 1 6 一甘露糖苷酶 外水解酵母d 甘露聚 a 1 2 1 6 d m a n n a nm a n n o s i d a s e切糖中的a 1 2 和 1 6 b c3 2 1 1 3 7 酶 糖苷键 释放甘露糖 天津大学博士学位论文p 甘露聚糖酶活性基团探讨及固定化研究 表1 5 甘露聚糖酶的分类 t a b l e1 5 c l a s s i f i c a t i o no f p m a r m a n a s e s 类别酶族酶超族 生物体 b a c i l l u ss p 5 h bs pa m 0 0 1 bs u b t i l i s1 6 8 b s u b t i l i sh b 0 0 2 b s u b t i l i sn m 3 9 c a l d i c e l l u l o s i r u p t o rs a c c h a r o l yt l e u s c e l l u l o m o n a s f i m i i2 6g h a c e l l v i b r i oj a p o n i c u s c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m p f r o m y c e ss p r h o d o t h e r m u sm a r i n u s t h e r m o t o g an e a p o l i m n a a g a r i e u sb i s p o r u s a b i s p o r u sc 5 4 c a r b 8 a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s b a c i l l u s c z 肥 l a 坫 k l c a l d i b a c i l l 蚶 c e t l u l o v o r a n s c a l d i c e l l u l o s i r u p t o r s a c c h a r o l y t i c u s c e l l v i b r i oj a p o n i c u s c l o s t r i d i u mc e l l u l o t y t i c u m c l o s t r i d i u mc e l l u t o v o r a n s d a t u r a f e r o x g e o b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 5g h a m c a 2 1 8 4 l a c t u c as a t g v a l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m m y t i l u se d u l i s o r p i n o m y c e ss p p c 2 p s e u d o m o n a ss p n d l 3 7 s t r e p t o m y c e sl w i d a n s 6 6 t a l a r o m y c e se m e r s o n 札t h e r m o b i f i d a s e a t h e r m o t o g am a r i t i m a t r i c h o d e r m ar e e s e i i 目b r i os pm a 1 3 8 i l l4 4 c a l d i c e l l u l o s i r u p t o r s a c c h a m l y t i c u s i v7 6b a c i l l u s c i r c u l a n s t n 3 1 v 肌v 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