（发酵工程专业论文）干酪乳杆菌atcc393在不同环境因子胁迫下的生理应答.pdf

毒 h _ 口n v l 鼍i i 摘要 摘要 干酪乳杆菌在作为乳品( 尤其是酸奶) 发酵过程中所经历的多种胁迫环境将极大影 响其作为益生菌产品应用的活性、产率和风味。近年来，干酪乳杆菌在不同胁迫下的胁 迫应激反应成为了研究热点。然而，在应用过程中，干酪乳杆菌所经历的胁迫环境往往 是复杂和交互的，而传统单因素胁迫研究在描述实际过程往往有所局限。因此，本论文 从干酪乳杆菌典型株a t c c3 9 3 入手，通过研究其在单胁迫引发的多胁迫抗性下存活率 和相应的变化，进一步考察其在交互保护中蛋白质组的变化情况，为了解干酪乳杆菌在 复杂环境下的胁迫耐受机理及有目的提高其作为益生菌制品的胁迫耐受能力提供了条 件。主要研究成果如下： 1 考察了干酪乳杆菌a t c c3 9 3 在不同程度热、酸、氧和胆盐单因素胁迫条件下 的存活率，研究发现，对数中前期的干酪乳杆菌有较好的酸胁迫耐受能力( p h 3 0 ) 和极强 的耐胆盐能力( 2 的胆盐浓度下仍保持5 0 存活率) ，而其在1r n m 过氧化氢或5 0 0 c 高 温条件处理9 0r a i n 的情况下仍能保持较高的存活率，这进一步从胁迫耐受能力上证明 了其良好的益生菌应用潜力。 2 在单因素研究的基础上进一步考察了4 种胁迫条件按时间和强弱两两组合对细 胞存活率造成的影响。研究发现，酸预适应对提高热致死及氧致死条件下细胞的存活率 效果最为显著，而就酸适应而言，盐酸较乳酸有更好的交互保护能力。其中，p h 3 8 - 4 0 盐酸9 0 分钟的预适应处理使细胞在应对随后的热致死和氧致死时存活率分别提高了 3 0 5 倍和1 7 3 倍。 3 进一步比较了最佳交互保护条件下细胞脂肪酸含量和胞内p h 的变化。与直接经 历致死条件的细胞相比，经过酸预适应处理后，细胞在经历热致死或氧致死时胞内p h 下降减缓，细胞膜脂肪酸的不饱和度改变较小，这表明酸预适应所引发的交互保护可能 是通过维持胁迫条件下细胞生理状态的相对稳定来减少其他胁迫对细胞造成的不利影 响。 4 利用二维电泳和i t r a q 技术从蛋白水平上比较了交互保护前后干酪乳杆菌蛋白 质组的变化。结果表明，较强的蛋白损伤修复能力和再生能力可能是酸适应下细胞提高 多种胁迫耐受能力的主要原因，d n a 修复和能量代谢对维持细胞存活也有一定作用。 关键词：干酪乳杆菌，益生菌，交互保护，胁迫，蛋白质组学 ，。 、 a b s t r a e t a b s t r a c t a san a t u r a lm i c r o f l o r af r o md a i r yp r o d u c t s ，l a c t o b a c i l l u sc a s e ia l w a y se n c o u n t e r s s e v e r a ls t r e s s f u lc o n d i t i o n sw h i c hw i l lg r e a t l ya f f e c ti t sv i a b i l i t y , p r o d u c t i v i t ya n df l a v o r i n t h e s ec a s e s ，as e r i e so fp h y s i o l o g i c a lc h a n g e sn a m e ds t r e s sr e s p o n s e sa p p e a r e di n 厶c a s e it o f i g h ta g a i n s tt h eh a r s he n v i r o n m e n t s h o w e v e r , v a r i o u ss t r e s s e sa l w a y so c c u rs i m u l t a n e o u s l y t h u sc o m p l i c a t e st h ed e f e n s es y s t e m ，a n dt h et r a d i t i o n a lr e s e a r c ho ns i n g l e - s t r e s si sa b s o l u t e l y l i m i t e dt od e s c r i b et h ec h a n g e si nt h es t r e s sp r o c e s s i nt h i ss t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h es u r v i v a l a n dc o r r e s p o n d i n gp h y s i o l o g i c a lc h a n g e so f t h e 三c a s e it y p es t r a i n , 三c a s e ia t c c3 9 3 ，u n d e r c r o s s - p r o t e c t i o n 们1 er e s u l t sw i l lh e l pu st ou n d e r s t a n dt h em e c h a n i s mo fs t r e s st o l e r a n c ei n t h ec o m p l e xe n v i r o n m e n ta n dp r o v i d et h ep o s s i b i l i t yt oi m p r o v es t r e s st o l e r a n c eo fc e l l su s e d a sp r o b i o t i c sp r o d u c t s 1 w ec o m p a r e dt h es u r v i v a lr a t eo f l c a s e ia t c c3 9 3u n d e rv a r y i n gc o n d i t i o n so f h e a t , a c i d ，o x y g e n , a n db i l es a l ts t r e s s l c a s e ia t c c3 9 3e x h i b i t e dag o o da c i ds t r e s st o l e r a n c e q h 3 0 ) a n ds t r o n gr e s i s t a n c et ob i l e ( 2 b i l es a l tc o n c e n t r a t i o nr e m a i n e d5 0 s u r v i v a lr a t e ) o nt h ee a r l ym i d - l o gp h a s e i na d d i t i o n , i tm a i n t a i n e dah i g l ls u r v i v a lr a t eb o t hi n1m m h y d r o g e np e r o x i d et r e a t m e n ta n d5 0 0 c9 0r n i n , w h i c hs h o w e d i t sp o t e n t i a lu s e da sp r o b i o t i c s 2 n l es u r v i v a lr a t eo fc e l l sw i t ho rw i t h o u tc r o s ss t r e s s e sw e r ec o m p a r e d p r e a d a p t a t i o n 、7 i ，i t hm i l da c i dw a sf o u n dt ob em o s tc f f e c t i v ei ni m p r o v i n gt h ev i a b i l i t yo fc e l l su n d e rb o t h l e t h a lt h e r m a la n dl e t h a lo x y g e ns t r e s s e s c o m p a r e dw i t hl a c t i ca c i d ，h y d r o c h l o r i ca c i dw a s t h eb e t t e rc r o s s p r o t e c t i o ni n d u c e rw h i c hi n c r e a s e dt h es u r v i v a lt o3 0 5 f o l da n d17 3 f o l d r e s p e c t i v e l yu n d e rh e a ta n do x y g e ns t r e s sa f t e rm i l da c i dp r e a d a p t i o n ( p h3 8 4 0h c l9 0 m i n u t e s ) 3 1 1 1 em e m b r a n ec o m p o s i t i o no fc e l l sa sw e l la si n t r a c e l l u l a rp h ( p h i ) w a st h e n i n v e s t i g a t e du n d e rc r o s s - p r o t e c t i o ni n d u c e db ya c i d d i f f e r e n tf r o mt h ec e l l sd i r e c t l y e n c o u n t e r e dt h el e t h a lt h e r m a la n do x y g e ns t r e s s e s ，a d a p t e dc e l l ss h o w e das l o wd e c l i n ei n b o t hp h ia n du n s a t u r a t i o no fm e m b r a n ef a t t ya c i d s s u c hr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h e a c i d - i n d u c e dc r o s sp r o t e c t i o nm a ys t a b i l i z et h ei n t r a c e l l u l a rp ha n dm e m b r a n es a t u r a t i o nw h i c h r e l a t e dt ot h ec e l li n t e g r i t y 4 啊1 ep r o t e o m ec h a n g e so fl c a s e ia t c c3 9 3i nc r o s s - p r o t e c t i o nw e r et h e nc o m p a r e d b yt w o d i m e n s i o n a lp r o t e i ne l e c t r o p h o r e s i sa n di s o b a r i ct a g sf o rr e l a t i v ea n da b s o l u t e q u a n t i t a t i o n ( i t r a q ) t e c h n o l o g y r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h es t r o n ga b i l i t yo fp r o t e i nr e p a i r a n dr e g e n e r a t i o nm a yb et h em a i nr e a s o no fc r o s s - p r o t e c t i o ni ni m p r o v i n gc e l l s s u r v i v a l u n d e rs t r e s s e s i na d d i t i o n , d n ar e p a i rs y s t e ma n dt h em a i n t e n a n c eo fe n e r g ym e t a b o l i s m m a yp l a ya r o l ei ns u c ht o l e r a n c e s k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sc a s e i ，p r o b i o t i c s ，c r o s s - p r o t e c t i o n , s t r e s s ，p r o t e o m i c s 目录 目录 苈要， a b s t r a c t 2 ：2 矛卜孝绪跨 1 1 概述1 1 1 1 乳酸菌与益生菌1 1 1 2 干酪乳杆菌及其应用2 1 1 3 干酪乳杆菌作为益生菌面临的主要胁迫环境3 1 2 国内外研究动态4 1 2 1 单因素胁迫研究4 1 2 1 1 酸胁迫4 1 2 1 2 热胁迫5 1 2 1 3 胆盐胁迫5 1 2 1 4 氧胁迫6 l ：2 2 交互胁迫研究6 1 3 立题意义7 1 4 本论文的主要研究内容8 第- - g t 捌鹣方搓9 2 1 菌株9 2 2 仪器9 2 3 试剂9 2 4 胁迫实验1 0 2 4 1 生长实验1 0 2 4 2 单因素胁迫1 0 2 4 3 交互保护实验1 0 2 4 3 1 预实验1 0 2 4 3 2 最低致死条件下的交互保护1 1 2 4 3 3 以酸为预适应条件的交互保护1 1 2 4 3 4 细胞存活率的计算1 1 2 5 测定实验1 1 2 5 1 胞内p h 的测定1 1 2 5 2 细胞膜脂肪酸成分的分析1 l 2 6 蛋白质组学实验1 2 2 6 1 样品制备1 2 2 6 2 蛋白定量1 2 2 6 3 等点聚焦1 2 7 。、 目录 1 3 1 3 j 7 1 f 迫研究1 4 1 4 1 4 3 9 3 存活率的考察1 5 3 9 3 存活率的考察1 6 3 9 3 存活率的考察1 6 3 1 2 4 胆盐胁迫下干酪乳杆菌a t c c3 9 3 存活率的考察1 7 3 1 3 结论1 9 3 2 干酪乳杆菌a t c c3 9 3 的交互保护现象2 0 3 2 1 交互保护对菌株a t c c3 9 3 存活率的影响2 0 3 2 1 1 以热为致死条件的交互保护2 0 3 2 1 2 以氧为致死条件的交互保护2 l 3 2 1 3 以酸为致死条件的交互保护2 2 3 2 1 4 不同酸适应条件对细胞交互保护的影响2 2 3 2 2 酸适应交互保护对细胞膜脂肪酸含量的影响2 3 3 2 3 酸适应交互保护对胞内p h 含量的影响2 4 3 2 4 结论2 5 3 3 交互保护下干酪乳杆菌a t c c3 9 3 蛋白水平的变化2 5 3 3 1 干酪乳杆菌a t c c3 9 3 的全蛋白分布2 6 3 3 2 基于二维电泳的干酪乳杆菌a t c c3 9 3 交互保护下蛋白质组差异分析2 6 3 3 2 1 酸适应前后干酪乳杆菌a t c c3 9 3 蛋白质组差异比较2 6 3 3 2 2 热致死下干酪乳杆菌a t c c3 9 3 在亚适应前后蛋白质组差异比较2 7 3 3 2 3 氧致死下干酪乳杆菌a t c c3 9 3 在亚适应前后蛋白质组差异比较2 8 3 3 2 基于i t r a q 的干酪乳杆菌a t c c3 9 3 交互保护下蛋白质组差异分析2 9 3 3 4 结论3 3 3 4 本章小结3 4 致掰酊 豸咤蝴筋 附录：作者在攻读硕士学位期闻发表的论文4 2 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概述 1 1 1 乳酸茵与益生茵 乳酸菌不是一个分类学上的名称，而是指一类可发酵碳水化合物并产生大量乳酸、 不产孢子、厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性球菌或杆菌的统称。乳酸菌在自然界中种类很 多，分布极广：有些种类生活在动物的肠、胃、口腔之中，皮肤表面以及牛奶、乳制品、 肉类制品中；有些种类生存在水果、蔬菜、谷物及植物制品上。乳酸菌主要包括乳球菌 属( l a c t o c o c c u s ) 、乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、明串珠菌属( l e u c o n o s t o c ) 、双歧杆菌属 ( b i f i d o b a c t e r i u m ) 、片球菌属( p e d i o c o c c u s ) 和链球菌属( s t r e p t o c o c c u s ) 等。除少数外，如肺 炎链球菌m 幻淞册e 姗z d 万缸理) 和化脓性链球菌 啤砌卯淞乃，d g p 刀哪【1 】，绝大部分 乳酸菌是人和动物体内必不可少的具有重要生理功能的菌群。除片球菌属外，以上各属 乳酸菌均广泛应用于轻工、食品、医药及饲料工业等许多行业中，如干酪乳杆菌 ( l a c t o c o c c u sc a s e o 和嗜热链球菌( s t r e p t o c o c c u st h e r m o p h i l u s ) 。近年来，随着乳酸菌的特 殊生理活性和营养功能被不断发现，有关乳酸菌的研究愈发受到重视。大量研究表明， 作为人类胃肠道中的乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群的平衡，提高食物消化率和生 物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败茵生长繁殖和腐败产物的产生， 制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、免疫反应等产生作 用【2 4 】。 益生菌( p r o b i o t i c s ) - - 词来源于希腊文，最早由l i l l y 和s t i l l w e l l 于1 9 6 5 年提出。益 生菌的定义随着人们对人体及动物体内正常微生物菌群与健康关系的深入研究日益完 善，目前关于益生菌最普遍使用的定义是由英国学者f u l l e r 于1 9 8 9 年提出的：益生茵 是一类“适当摄入对宿主有好处的活的微生物”。虽然近两年益生菌市场的蓬勃发展使得 市场上对于益生菌种类的界定出现了部分混淆的情况，但是国内外学术界对于乳杆菌和 双歧杆菌两个属的益生功能已达成共识。在国内，2 0 0 7 年c i c c 出版的益生菌菌种目 录中承认的1 4 3 株益生菌中有5 1 株双歧杆菌和8 4 株乳杆菌，而乳杆菌中的嗜酸乳杆 菌和干酪乳杆菌更是作为乳杆菌的前两位加以收录。 ， 、 江南大学硕士学位论文 腹泻 致痹性 肝功能损伤( 包括产 癌症生l i l ) 产生致癌 物质 吸收营葬钧 质 合成维生囊 个g l o 和水平 图1 - 1 人体粪便茵群的主要组成及作用 f i g 1 - 1g e n e r a l i z e ds c h e m eo f t h ec o m p o s i t i o na n dh e a l t he f f e c t so f p r e d o m i n a n th u m a nf e c a lb a c t e r i a 1 1 2 干酪乳杆菌及其应用 干酪乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sc a s e i ) 属于乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) ，革兰氏阳性不产 芽孢，无鞭毛，不运动，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶，接触酶阴性，最适生长温度 3 7 0 c ，g + c 含量为4 5 6 - - - 4 7 2 。菌体长短不一，两端方形，常成链；菌落粗糙， 灰白色，有时呈微黄色；生化反应能发酵多种糖【5 1 。干酪乳杆菌，存在于人的1 2 1 腔、肠 道内含物和大便及阴道。也出现牛奶和干酪、- 孚l s f j 品、饲料、面团和垃圾中。近来，不 少学者探讨了乳杆菌，干酪乳杆菌及其发酵孚l s s j 品对免疫缺损患者的作用。口服用干酪 乳杆菌发酵乳具有临床应用价值，因为它们能增强免疫应答引诱系统，并增进巨噬细胞 功能。这主要可能是由于乳杆菌在乳制品发酵过程中产生的特定物质( 像酪蛋白肽) ， 或由于微生物的自溶产生的细胞壁成分，在增进宿主免疫功能上起到了主要作用。在微 生物研究的基础上，人们普遍认为，干酪乳杆菌是保健功能较强的乳酸茵。体外试验已 经证明，干酪乳杆菌具有黏附在肠粘膜表面的能力，并可进入肠淋巴结和身体其它器官， 这种能力可能与其免疫激活作用有关。 干酪乳杆菌作为益生菌之一被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等- 孚l s u 品的发酵 剂及辅助发酵剂，尤其在干酪中的应用较多，适应干酪中的高含量盐及低p h 值，通过 一些重要氨基酸的代谢以增加风味并促进干酪的成熟。干酪乳杆菌良好的耐酸及胆汁抗 性，可降低血浆胆固醇，增强宿主对微生物病原体的非特异性抵抗力，加快清除肠道内 病原体，治疗肠道菌群紊乱和增强肠道透性，从而防止食物过敏和急性腹泻。此外，干 酪乳杆菌还可使抗低密度氧化脂抗体和淋巴细胞增加，使粒细胞的噬菌作用明显增强， 2 徽 一 第一章绪论 对宿主进行免疫调节，防止肿瘤的产生。由于能够在人体肠道内稳定存活并具有众多的 医疗保健功能，干酪乳杆菌作为益生菌被广泛应用于功能性食品，特别是乳制品的开发 中，并逐渐为人们所关注。2 0 0 5 年，内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点 实验室在内蒙古酸马奶中筛选得到的干酪乳杆菌l a c t o b a c i l l u sc a s e iz h a n g 被证实具有 良好的益生功效，并在2 0 0 8 年完成了全基因组测序工作，成为了我国少有的具有自主 知识产权的益生菌菌种睁7 1 ，引发了国内益生菌研究的热潮并使干酪乳杆菌成为当前研 究的热点菌株。 图1 - 2 干酪乳杆菌及其形态 f i g 1 - 2t h es h a p eo f l a c t o b a e i l l u sc a s e i 本研究所用的干酪乳杆菌l a c t o b a c i l l u sc a s e ia t c c3 9 3 购买自美国标准菌种保藏中 心a t c c ( a m e r i c a nt y p ec u l t = u r ec o l l e c t i o n ) ，是a t c c 认可的干酪乳杆菌的典型株( t y p e s t r a i n ) 引，针对其所做的研究对于描述干酪乳杆菌种的情况具有较好的代表性。 1 1 3 干酪乳杆菌作为益生菌面临的主要胁迫环境 作为国内益生菌的主力军，干酪乳杆菌在食品尤其是奶制品行业发挥着越来越重要 的作用；然而与此同时，随着其产品种类的增加和市场的扩大，围绕其产生的争论也在 近两年逐渐增多，而在诸多质疑之中，干酪乳杆菌作为益生菌从生产到食用整个过程中 能否保持活菌状态是焦点。目前广泛接受的f u l l e r 在1 9 8 9 年提出的益生菌概念就明确 指出“活的微生物这一必要条件；而其随后在1 9 9 1 年提出的“有用益生菌”必须满 足的四个条件中前三条又是和菌的活性相关【9 。1 0 】( 图1 3 ) 。遗憾的是，在实际的工业生 产过程中，作为起酵物的干酪乳杆菌却不可避免的面临着来自外界环境的各种物理或化 学的不利条件的影响，如：伴随发酵进行而在细胞生长基质中不断积累的乳酸，制剂化 过程中所经历的喷雾干燥，人体内所经受的盐酸和胆盐，作为兼性厌氧菌在各个阶段都 要经历的氧环境等。这些因素都限制了细胞的正常生长和代谢，造成了所谓的“胁迫”环 境，降低了干酪乳杆菌的存活能力，成为其作为益生菌进入实际应用领域的重要瓶颈 【l l - 1 5 1 。 ， 。 江南大学硕士学位论文 囝图 1 2 1 单因素胁迫研究 活菌能力的保持关键是提高乳酸茵胁迫抗性，其手段目前主要有两种：一是在菌种 筛选过程中以胁迫环境作为选择压力而直接获得高耐受菌株【1 6 】；二是通过益生菌胁迫机 制的研究有目的地影响或改造菌种，从而提高其耐受性【1 7 】。筛选菌种的方法较为常用但 却不可避免地遗漏掉一些有应用潜力的益生茵；而胁迫机理的研究一方面能进一步挖掘 成熟菌株的应用潜力，同时也为筛选具有高胁迫抗性的优良菌株提供了可借鉴的思路。 在已经开展的工作中，单一胁迫环境中乳酸菌的生理状态是研究的热点之一。 c o m p o s i ：j o no f 馈晤 伊o w 挂1m e j d i u m 1 极i c 卧p r o d u c t s f e g o r g a n i ca d d , h y d r c g e p e x i d e ) d i s s o l v e do x y g e n 只n 剐c e l l m a 5 s m e c h a n i c 羽s t 懈 - c o m p o s i t i 3 nc f f r e e z i r n ga n dd r y * n g 玎搀d i a f j t r e m et e m p e r a t u 糖 c o n d i t i o n sf s p f a y d r y i n g f r e e z ed r y , g ) o x y g 朗s b - e s s c e t it l e h v d r a t t o n ( i r t a c e l u l a ro u n o ( i c ) a c i d l t yo fc a l r j 甜 f o o d o g e ns 由曹s 霉 c o i n d e | j o n w 胁 o t h e ro r g a r i s m = i nt h ep r o d u c t t e m p e r a t u r e m o l s t u 怕c o n t e n t 恼d i cc o n d i t i o n si n s t o m a c h e n z y m a t i ca c t i v i t i e s c o m p o s i d o no ft h e 甜l v i r o n t n e n - ： r e g ，p r e s e n c eo f 电r r r , e n t a b l e 鲥g a r s ) b l i e s a l t l nt h e $ m 8 1 i i n l e s t t n e 图l - 4 干酪乳杆茵在生产应用各阶段所遭遇的各种胁迫环境 f i g 1 - 4m a i nf a c t o r sa f f e c t i n gt h ev i a b i l i t yo f p r o b i o t i c sf r o mp r o d u c t i o nt ot h eg a s t r o i n t e s t i n a lt r a c t 1 2 1 1 酸胁迫 乳酸菌的生长特点是以产酸作为最终的发酵产品，产生的乳酸被释放并积累到细胞 外环境中，有机酸在自然环境中能抑制其他微生物的生长，但在高密度发酵中却也极大 地降低了其自身的活性；此外，乳酸菌在食用消化后在胃中又遇到了一个更强的无机酸 环境，人体正常胃液的p h 往往低于3 0 ，这与大部分乳酸菌5 - 9 的最优生长p h 相差甚 4 第一章绪论 远。两者结合，使得酸胁迫成为了乳酸菌单因素胁迫研究的重点。目前关于酸胁迫对菌 体的生理影响尚未完全清楚，但是一个广泛接受的说法是，由于酸能够通过细胞膜被动 扩散进入细胞质，然后迅速解离成不能透出细胞膜的质子和相应极性基团。胞内质子的 积累使得胞内p h 下降，从而减少了跨膜的质子推动力，影响了细胞多种转膜机制的能 量来源【1 8 】。内部的酸化条件也减少了对酸敏感的酶的活力并且对蛋白质和d n a 造成永 久性损害，伴随解离过程产生的阴离子的大量积累，也会对细胞生理造成有害影响。目 前认为，乳酸菌酸适应能力增加至少有两个生理阶段：1 ) 在对数生长期经过一个非致 死性的酸性p h 条件，能诱导l a t r 适应；2 ) 在进入稳定期之后，通过一个不依赖于 外界p h 的g e n e r as t r e s sr e s p o l l s e ( g s r ) 提高适应能力【1 9 也o 】。而诸如f o f l a t p 酶， k + a t p a s e ，精氨酸脱亚胺酶，脲酶被认为在帮助乳酸菌抵御外界酸胁迫过程中起到关 键作用。 1 2 1 2 热胁迫 为了便于运输和延长活菌的保存时间，热喷雾干燥被广泛用于乳酸菌发酵剂的制备 过程。然而无论是添加保护剂或是施加真空条件降低喷雾干燥的温度( 6 0 1 0 0 0 c ) ，热胁 迫总会对菌体存活造成不利影响。乳酸菌的适宜温度集中在3 0 3 7 0 c 之间，热胁迫引起 的细胞死亡通常被认为是高温下蛋白质变性以及随后而来的聚集所引起，此外，大分子 如核糖体，r n a 的不稳定以及膜流动性的改变也被提及【2 l - 2 3 。与之相对应，在针对热 胁迫所做的研究中发现，分子伴侣体系d n a k - o r p e d n a j 和g r o e s g r o e l 在修复高温损 坏的蛋白质并维持细胞高温下存活率起着至关重要的作用 2 4 - 2 f l ，此外，热诱导蛋白酶 h t r a d e g p 和f t s h h f l b 的缺失使某些乳酸菌对于热敏感性增加，这也暗示了蛋白酶降 解受损蛋白能力与乳酸菌热胁迫抗性密不可分 2 6 - 2 r l 。 1 2 1 3 胆盐胁迫 胆汁是一类复杂的消化分泌物，其在人体内分散和吸收脂肪中起重要作用。而胆酸 ( 也叫做胆盐) 是胆汁的主要组成部分，属胆汁酸( c a ) 的衍生物并由胆固醇所合成。一 些胆盐可以与肝中的甘氨酸和牛磺酸所共轭【2 s 】。尽管胆盐对细菌细胞的毒害作用还没有 完全了解，但胆盐的表面活性和两性分子性能对微生物产生强有力的杀伤作用。它们能 作为去污剂分解细胞膜。由于乳酸菌作为革兰氏阳性菌缺少组成第一道渗透屏障的外 膜，因此它们对胆盐的毒性较革兰氏阴性茵更为敏感。目前发现，在乳杆菌中，胆盐水 解酶( b i l es a l th y d r o l a s e s ，b s h ) 能够解共轭胆盐，水解类固醇核心部分的甘氨酸或牛 磺酸。这个水解过程改变了胆盐的性质并且降低了胆盐在低p h 下的溶解性以及其去污 剂活性1 2 9 1 。此外，一种被称为m d r 流出系统( m u l t i d m gr e s i s t a n c e ，m d r ) 的转运蛋白 家族在在短乳杆菌中被发现，这组蛋白被认为可能在乳杆菌挤t 丑( e x t m s i o n ) 胆盐过程中 起了关键作用，但在其他乳杆菌种群中尚未有相关报道【3 0 】。 5 ， i 江南大学硕士学位论文 1 2 1 4 氧胁迫 乳酸菌是兼性厌氧微生物，在糖酵解中产生的n a d h 的再生主要依赖丙酮酸还原生 成乳酸的过程，因而不需要氧的参与，实际上氧气对它们的生长具有负面的效用。人们 普遍认为，乳酸菌在任何条件下都不以氧作为最终的电子受体。但是总体而言氧气对乳 酸菌包括干酪乳杆菌的消极作用还是更多一些。氧气的有害作用主要表现在氧负离子以 及羟基自由基对蛋白，脂以及核苷酸的进攻所造成的细胞老化和死亡，而氧胁迫下存活 的细胞主要通过减少氧负离子或自由基( 酶降解或消除) ，使其进攻的靶点不易损坏或 修复损伤从而提高存活率。虽然工业发酵中培养干酪都在不通气条件下进行，但在实际 操作过程中不可避免地会遇到氧。例如为了使培养基分布均匀，必须进行低转速搅拌【3 l j ， 这样，干酪乳杆菌在消耗氧的过程中，就会产生一系列活性氧。由于乳酸乳球菌的抗氧 胁迫系统中没有高效的过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) 。并且，超氧化物歧化酶( s u p c r o x i d e d i s m u t a s e ，s o d ) i ；勺催化作用副产物也是h 2 0 2 ，因而h 2 0 2 往往会积累在乳酸乳球菌的发 酵液中。n 2 0 2 是酵解过程中多种酶的抑制剂，其中3 磷酸甘油醛脱氢酶对h 2 0 2 特别敏 感【3 2 1 。所以，h 2 0 2 被认为是包括干酪乳杆菌在内的许多乳酸菌好氧代谢所产生的最重 要的抑制性物质之一【3 3 1 。并且，氧化产物可能会积累在食品中，并对食品品质产生不利 的影响，如引起颜色的改变和臭味的产生等。这样，对氧胁迫的抵抗机制也成为了乳酸 乳球菌研究学者关注的重要问题之一。 除了以上四种胁迫外，冷冻胁迫、渗透压胁迫、饥饿胁迫等也在乳酸菌单因素胁迫 研究中大量涉及。 1 2 2 交互胁迫研究 与传统单因素胁迫研究不同，以干酪乳杆菌为代表的乳酸杆菌在实际应用中所遇到 的胁迫条件却是复杂和交叉的，各种胁迫往往同时出现，简单的单因素研究在描述细胞 在实际过程中的变化时具有一定的局限性。有趣的是，在某些传统单因素实验中，意外 发现不同胁迫之间似乎存在关联性，如嗜酸乳杆菌l a l 1 在胆盐中的预适应能显著提高 其在热胁迫下的存活率，而热适应却对其在胆盐胁迫的抗性提高没有任何帮助【蚓；本实 验室前期的研究也发现在冷冻胁迫过程中，旧金山乳杆菌胞内的 也+ 】【n a d h 州比值 持续上升，s o d 活性和胞内巯基水平下降，这表明冷冻胁迫诱发了细胞内氧胁迫的产生， 从而进一步验证了乳酸杆菌中单一胁迫诱发细胞产生交互保护效应的观点。然而遗憾的 是，目前对于上述交互保护现象的研究更多的是集中在乳酸菌模式菌株乳酸乳球菌上 ( 图1 5 ) ，而对于具有重要益生功能和应用价值的乳酸菌菌株如干酪乳杆菌的研究还罕 有报道。 6 第一章绪论 图1 - 5 乳酸乳球菌的交互保护现象 f i g 1 - 5c r o s s p r o t e c t i o nn e t w o r ko f l 1 a c t s s o l i dl i n e si n d i c a t ec r o s s - t o l e r a n c e ，w h i l ed o t t e dl i n e s i n d i c a t ec o m b i n a t i o n so fs t r e s s e sw h e r ec r o s s - p r o t e c t i o nw a sn o to b s e r v e d t h ed i r e c t i o na r r o w sr e v e a lt h e s e q u e n c ef r o ma d a p t i o ns t r e s st ot h el e t h a lc o n d i t i o n 1 3 立题意义 益生菌中，乳杆菌和双歧杆菌是最重要的两个属；这其中，乳杆菌以清晰的遗传背 景与悠久的使用历史又成为益生菌研究的代表菌株。从单纯的奶制品起酵物，到对健康 有促进作用的活菌产品，随着人们看待乳杆菌角度的变化，对菌的要求也发生着变化。 而这其中，如何保持菌体活性成为人们关注的焦点。 遗憾的是，乳杆菌对环境胁迫的耐受能力较差。从工业角度来看，发酵、加工和货 架期所经历的氧胁迫，发酵过程所经历的酸胁迫，制剂化过程所经历的温度胁迫将极大 地影响菌体产量和活性；从益生菌角度来看，乳杆菌在应对人体蛋白酶，胃酸和胆盐胁 迫过程中活性的降低又将严重影响其定殖肠道的效率【3 5 。3 7 】。益生菌发挥功能的前提是菌 体自始至终以活菌形式存在，但以乳杆菌为代表的益生菌在恶劣环境下的活性保持较差 却逐渐成为人们质疑的靶子，也成为益生菌市场推广的主要障碍【3 引。 这样的背景下，乳杆菌对环境胁迫的耐受能力成为目前研究的热点。多数研究者从 乳杆菌某一特定株入手，比较其在施加胁迫前后的差异，从差异中寻找到研究点进而揭 示乳杆菌应对胁迫的潜在机理，从而为筛选胁迫耐受菌提供目标；为改造菌种提供素材 或对工业应用提供指导【3 9 】。 然而与传统单因素胁迫研究不同，以干酪乳杆菌为代表的乳酸杆菌在实际应用中所 遇到的胁迫条件却是复杂和交叉的，各种胁迫往往同时出现，简单的单因素研究在描述 细胞在实际过程中的变化时具有一定的局限性。基于上述原因，作者选取干酪乳杆菌标 准株厶c a s e ia t c c3 9 3 为研究对象，通过考察交互胁迫作用下细胞的不同生理应答反应， 初步研究了不同胁迫条件影响干酪乳杆菌生理活性的作用相关性，探索了干酪乳杆菌细 7 7 江南大学硕士学位论文 胞应对外界不同胁迫环境时启动自适应机制的协同作用方式，并对上述交互保护的作用 机理进行了初步探讨，从而为高活性乳酸菌益生菌的筛选、遗传、定向改造和工业应用 提供了必要的理论指导。 1 4 本论文的主要研究内容 本论文在国家“9 7 3 项目”( 2 0 0 7 c b 7 1 4 3 0 6 ) ；国家自然科学基金重点项目 ( 2 0 8 3 6 0 0 3 ) ；国家自然科学基金( 3 0 8 0 0 0 0 8 ，3 0 9 0 0 0 1 3 ) 等的资助下完成。 课题以干酪乳杆菌典型株a t c c 3 9 3 t m 为研究对象，从将所经历胁迫环境入手，就 以下方面展开研究( 图1 - 6 ) ： 1 生长对数中期的干酪乳杆菌作为益生菌在常见胁迫环境( 如酸胁追，热胁迫， 胆盐胁迫，氧胁迫) 下的耐受能力，衡量其在益生菌工业中的应用潜力并为其在双因素 胁迫下的存活率比较实验提供前提条件； 2 比较干酪乳杆菌在a 胁迫预适应后对于b 胁迫的耐受能力，并进一步考察不同 强度和种类酸的预适应对其交互胁迫保护耐受能力的影响，初步探究在酸适应交互保护 条件下一些生理指标( 如细胞膜脂肪酸组成与细胞胞内p h ) 的变化； 3 通过蛋白质组学( 如二维电泳和i t r a q ) 手段比较并分析在上述交互保护条件 下细胞蛋白水平的变化。 图1 6 论文研究思路 f i g 1 - 6t h ew o r k - f l o wo f t h i sr e s e a r c h 8 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 菌株 干酪乳杆菌a t c c3 9 3 c a s e ia t c c 3 9 3 t m ) 为本实验研究用菌株，购自美国标准 菌种保藏中心a t c c ( a m e r i c a nt y p ec u l t u r ec o l l e c t i o n ) 2 2 仪器 恒温培养箱上海跃进医疗器械厂 高压灭菌锅无锡市第二医疗器械厂 h p l c 美国安捷伦有限公司 1 10 0 电子天平m e t t l e rt o l i d op l 2 0 0 2 冷冻立式离心机( c f l 6 r x ) 日本h i t a c h i 公司 小型高速离心机 e p p e n d o r f 公司 精密酸度计m e l 阻e rt o l i d op l 2 0 0 2 可见光分光光度计上海天美科学仪器有限公司 紫外可见光分光光度计日本s h i m a d z u 公司 g c 1 4 a 型气相色谱仪日本s h i m a d z u 公司 q - m a s s9 10